專利名稱：胚源性神經(jīng)干細(xì)胞原代細(xì)胞的分離及傳代培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種胚源性神經(jīng)干細(xì)胞的原代細(xì)胞的分離及傳代培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
神經(jīng)干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)是神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的重大突破，為神經(jīng)發(fā)育和神經(jīng)組織移植等研究領(lǐng)域開(kāi)辟了廣闊前景。神經(jīng)干細(xì)胞是一種具有自我更新及廣泛分化潛能的細(xì)胞，它處于分化的非終末狀態(tài)，可通過(guò)對(duì)稱或不對(duì)稱分裂出新的干細(xì)胞或分化潛能逐漸變小的子細(xì)胞，最終產(chǎn)生中樞神經(jīng)系統(tǒng)的三種主要細(xì)胞，即神經(jīng)元細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞。一般認(rèn)為神經(jīng)干細(xì)胞主要存在于哺乳動(dòng)物胎腦的紋狀體、小腦半球、腦室區(qū)等，成年哺乳動(dòng)物腦的側(cè)腦室壁和海馬等區(qū)。有關(guān)哺乳動(dòng)物胚胎階段和成年動(dòng)物在特定腦區(qū)存在神經(jīng)干細(xì)胞已不斷得到證實(shí)，但對(duì)人類神經(jīng)干細(xì)胞的研究尚少，傳統(tǒng)的高密度懸浮細(xì)胞培養(yǎng)法 克隆球形成和生長(zhǎng)緩慢，存在高密度的抑制作用；低密度難以培養(yǎng)成功則可能是與細(xì)胞的密度依賴性和神經(jīng)干細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)量過(guò)少有關(guān)；中等密度懸浮細(xì)胞培養(yǎng)2周后可見(jiàn)克隆球形成，但有其它細(xì)胞吸附現(xiàn)象。。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決胚胎神經(jīng)干細(xì)胞較難培養(yǎng)的問(wèn)題，本發(fā)明的目的是提供一種胚源性神經(jīng)干細(xì)胞原代細(xì)胞分離及傳代培養(yǎng)方法，其采用無(wú)血清培養(yǎng)和單細(xì)胞克隆技術(shù)從人胚皮層中分離得到具有自我更新和多分化潛能的神經(jīng)干細(xì)胞，并采用免疫熒光染色予以鑒定。具體的，本發(fā)明的一種胚源性神經(jīng)干細(xì)胞原代細(xì)胞分離及傳代培養(yǎng)方法包括以下步驟原代細(xì)胞的分離和培養(yǎng)，傳代培養(yǎng)及單細(xì)胞克隆、傳代，克隆誘導(dǎo)分化，以及間接免疫熒光檢測(cè)。其中，所述神經(jīng)干細(xì)胞的分離和培養(yǎng)步驟包括將胚胎在無(wú)菌條件下分離出胎腦大腦皮層，剝離硬膜及表面血管，在DMEM/F12的細(xì)胞培養(yǎng)液中漂洗，用細(xì)吸管反復(fù)吹打瓶?jī)?nèi)組織碎塊至完全散開(kāi)，制成細(xì)胞懸液，經(jīng)100目不銹鋼網(wǎng)過(guò)濾，制成單細(xì)胞懸液，經(jīng)分胎藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞，加入含B27和EGF、bFGF)的DMEM/F12無(wú)血清培養(yǎng)基，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞，調(diào)整活細(xì)胞濃度為I X105/ml，將原代細(xì)胞種植于培養(yǎng)瓶，37°C，5% CO2條件下靜置培養(yǎng)；所述傳代培養(yǎng)及單細(xì)胞克隆、傳代步驟包括將原代培養(yǎng)7天后的細(xì)胞克隆懸液用吸管輕柔吹打進(jìn)行機(jī)械分離，制成單細(xì)胞懸液，用含B27和bFGF的無(wú)血清培養(yǎng)液將細(xì)胞懸液按IX IO4Iiir1濃度傳代接種于培養(yǎng)瓶，在37°C，5% CO2條件下靜置培養(yǎng)7天，同時(shí)進(jìn)行克隆形成實(shí)驗(yàn)，計(jì)數(shù)每代的克隆形成率，每7-9天機(jī)械分離傳代，方法同前；采用有限稀釋法將原代克隆細(xì)胞制成的單細(xì)胞懸液，稀釋到40ml-1，于96孔培養(yǎng)板中滴加稀釋的細(xì)胞懸液，選取僅有一個(gè)細(xì)胞的培養(yǎng)孔作記號(hào)，并動(dòng)態(tài)觀察；待長(zhǎng)成單細(xì)胞克隆球后機(jī)械分離成單細(xì)胞懸液，再將一個(gè)克隆的所有細(xì)胞種至培養(yǎng)瓶中，待次代克隆長(zhǎng)成后連續(xù)傳代，最后得到大量來(lái)自某單個(gè)細(xì)胞的亞克隆。所述克隆誘導(dǎo)分化步驟包括分別選取部分傳代及單細(xì)胞克隆的細(xì)胞種植于多個(gè)多聚賴氨酸包被的玻片上，并加入含血清培養(yǎng)基，觀察其生長(zhǎng)分化情況，分別于7天、14天行免疫熒光檢測(cè)；所述間接免疫熒光檢測(cè)步驟包括將克隆細(xì)胞滴至多聚賴氨酸包被的玻片上，貼壁12小時(shí)后用4%多聚甲醒固定,進(jìn)行行Nestin抗體免疫熒光染色；分別將傳代及單細(xì)胞克隆的細(xì)胞種植于預(yù)置多聚賴氨酸包被玻片的含血清培養(yǎng)集中，于7天、14天時(shí)取出，進(jìn)行Nestin, NeuN, GFAP, CNP抗體的免疫熒光單標(biāo)染色及NeuN和CNP抗體的免疫熒光雙標(biāo)染色。本發(fā)明采用無(wú)血清培養(yǎng)和單細(xì)胞克隆技術(shù)從從胚齡12周的新鮮人胚皮層中成功建立一株人胚神經(jīng)干細(xì)胞，該細(xì)胞具有連續(xù)克隆能力，可傳達(dá)培養(yǎng)，表達(dá)神經(jīng)巢蛋白抗原；分化后的細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)元細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞的特異性抗原。


通過(guò)下面結(jié)合附圖的詳細(xì)描述，本發(fā)明前述的和其他的目的、特征和優(yōu)點(diǎn)將變得顯而易見(jiàn)。其中圖1所示為本發(fā)明的胚源性神經(jīng)干細(xì)胞原代細(xì)胞的分離及傳代培養(yǎng)方法的步驟流程圖。
具體實(shí)施例方式如圖1所示的本發(fā)明的胚源性神經(jīng)干細(xì)胞原代細(xì)胞分離及傳代培養(yǎng)方法的步驟流程圖，所述方法包括以下步驟S1、原代細(xì)胞的分離和培養(yǎng)取胚齡12周水囊引產(chǎn)的新鮮人胚胎，在無(wú)菌條件下分離出胎腦大腦皮層，剝離硬膜及表面血管，在DMEM/F12(1 I)的細(xì)胞培養(yǎng)液中漂洗三次，用細(xì)吸管反復(fù)吹打瓶?jī)?nèi)組織碎塊至完全散開(kāi)，制成細(xì)胞懸液，經(jīng)100目不銹鋼網(wǎng)過(guò)濾，制成單細(xì)胞懸液，經(jīng)分胎藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞，加入含B27 (I 50)和EGF (表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子)(20ng/ml)、bFGF(成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子)(20ng/ml)的DMEM/F12(1 I)無(wú)血清培養(yǎng)基，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞，調(diào)整活細(xì)胞濃度為I X 105/ml，將原代細(xì)胞種植于25平方厘米培養(yǎng)瓶(8ml細(xì)胞懸液/瓶)，37°C，5% CO2條件下靜置培養(yǎng)7天。S2、傳代培養(yǎng)及單細(xì)胞克隆、傳代將原代培養(yǎng)7天后的細(xì)胞克隆懸液用吸管輕柔吹打進(jìn)行機(jī)械分離，制成單細(xì)胞懸液，用含B27和bFGF的無(wú)血清培養(yǎng)液將細(xì)胞懸液按
IX IO4Inr1濃度傳代接種于培養(yǎng)瓶，在37°C，5 % CO2條件下靜置培養(yǎng)7天，同時(shí)進(jìn)行克隆形成實(shí)驗(yàn)，計(jì)數(shù)每代的克隆形成率，每7-9天機(jī)械分離傳代，方法同前。采用有限稀釋法，將原代克隆細(xì)胞制成的單細(xì)胞懸液，稀釋到401111'于96孔培養(yǎng)板中滴加稀釋的細(xì)胞懸液,選取僅有一個(gè)細(xì)胞的培養(yǎng)孔作記號(hào)，并動(dòng)態(tài)觀察。待長(zhǎng)成單細(xì)胞克隆球后機(jī)械分離成單細(xì)胞懸液，再將一個(gè)克隆的所有細(xì)胞種至培養(yǎng)瓶中，待次代克隆長(zhǎng)成后連續(xù)傳代，最后得到大量來(lái)自某單個(gè)細(xì)胞的亞克隆。S3、克隆誘導(dǎo)分化分別選取部分傳代及單細(xì)胞克隆的細(xì)胞種植于多個(gè)多聚賴氨酸包被的玻片上，并加入含血清培養(yǎng)基(DMEM/F12/B27/bFGF+5%胎牛血清)，觀察其生長(zhǎng)分化情況，分別于7天、14天行免疫熒光檢測(cè)。S4、間接免疫熒光檢測(cè)將克隆細(xì)胞滴至多聚賴氨酸包被的玻片上，貼壁12小時(shí)后用4%多聚甲醛固定，行Nestin抗體免疫熒光染色(抗Nestin IgG)。分別將傳代及單細(xì)胞克隆的細(xì)胞種植于預(yù)置多聚賴氨酸包被玻片的含血清培養(yǎng)集中，于7天、14天時(shí)取出，進(jìn)行Nestin (巢蛋白)、NeuN、GFAP (膠質(zhì)纖維酸性蛋白)、CNP(C型鈉尿肽)抗體的免疫熒光單標(biāo)染色及NeuN和CNP抗體的免疫熒光雙標(biāo)染色。對(duì)上述本發(fā)明的實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析如下1、克隆細(xì)胞形態(tài)觀察人胚皮層原代培養(yǎng)細(xì)胞成圓形球狀，懸浮生長(zhǎng)，經(jīng)分胎藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞在80%以上，培養(yǎng)7天時(shí)細(xì)胞數(shù)目明顯增加，可見(jiàn)數(shù)十個(gè)至數(shù)萬(wàn)個(gè)細(xì)胞組成的細(xì)胞球，細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，邊界清楚，折光性強(qiáng)。有少數(shù)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，分化出有突起的神經(jīng)原細(xì)胞，經(jīng)傳代克隆后仍未出現(xiàn)與原代培養(yǎng)相同的大量次代克隆。單細(xì)胞克隆顯示單個(gè)細(xì)胞在培養(yǎng)3天時(shí)細(xì)胞克隆增大至數(shù)十個(gè)，此后隨密度增加生長(zhǎng)加快，經(jīng)傳代后仍成懸浮生長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)不變。2、誘導(dǎo)分化結(jié)果將傳代克隆及單細(xì)胞克隆后獲得的克隆細(xì)胞經(jīng)胎牛血清培養(yǎng)12h后即見(jiàn)部分克隆細(xì)胞團(tuán)向四周發(fā)出放射狀細(xì)胞索，2天后可見(jiàn)大部分細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞索不斷增粗和伸長(zhǎng)，一周后大部分細(xì)胞已從其邊緣向外遷移分化成大量形態(tài)不一的、分散成片的多突起星狀細(xì)胞或神經(jīng)原樣細(xì)胞，突起互相交織成網(wǎng)狀，2周后部分神經(jīng)細(xì)胞開(kāi)始衰退、死亡。3、間接免疫熒光檢測(cè)將原代、傳代和單細(xì)胞克隆的細(xì)胞進(jìn)行Nestin免疫熒光染色，結(jié)果顯示大部分細(xì)胞呈Nestin抗原陽(yáng)性，尤其是傳代3次以上的克隆90%以上均呈陽(yáng)性。NeuN免疫熒光染色呈陰性。經(jīng)含血清培養(yǎng)7天、14天行NeuN、GFAP和CNP免疫熒光單標(biāo)染色顯示均有陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞存在，NeuN、GFAP和CNP雙標(biāo)染色證實(shí)有神經(jīng)元細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞同時(shí)存在。Nestin免疫熒光染色在I天時(shí)尚可見(jiàn)部分陽(yáng)性細(xì)胞，2周時(shí)幾乎未找到Nestin陽(yáng)性細(xì)胞。本發(fā)明從人胚皮層中分離培養(yǎng)并鑒定神經(jīng)干細(xì)胞，利用無(wú)血清培養(yǎng)和單細(xì)胞克隆技術(shù)在人胚皮層中分離具有單細(xì)胞克隆能力的細(xì)胞，并進(jìn)行培養(yǎng)、傳代，貼壁分化觀察，采用間接免疫熒光檢測(cè)克隆細(xì)胞的神經(jīng)巢蛋白抗原和分化后特異性成熟神經(jīng)細(xì)胞抗原的表達(dá)。本發(fā)明的技術(shù)從從胚齡12周的新鮮人胚皮層中成功建立一株人胚神經(jīng)干細(xì)胞，該細(xì)胞具有連續(xù)克隆能力，可傳達(dá)培養(yǎng)，表達(dá)神經(jīng)巢蛋白抗原；分化后的細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)元細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞的特異性抗原。本發(fā)明并不局限于所述的實(shí)施例，本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不脫離本發(fā)明的精神即公開(kāi)范圍內(nèi)，仍可作一些修正或改變，故本發(fā)明的權(quán)利保護(hù)范圍以權(quán)利要求書限定的范圍為 準(zhǔn)。
權(quán)利要求
1. 一種胚源性神經(jīng)干細(xì)胞原代細(xì)胞分離及傳代培養(yǎng)方法，其特征在于，其采用無(wú)血清培養(yǎng)和單細(xì)胞克隆技術(shù)從人胚大腦皮層中分離和培養(yǎng)出具有自我更新和多分化潛能的神經(jīng)干細(xì)胞，其包括以下步驟原代細(xì)胞的分離和培養(yǎng)，傳代培養(yǎng)及單細(xì)胞克隆、傳代，克隆誘導(dǎo)分化，以及間接免疫熒光檢測(cè)；其中， 所述原代細(xì)胞的分離和培養(yǎng)步驟包括將胚胎在無(wú)菌條件下分離出胎腦大腦皮層，剝離硬膜及表面血管，在DMEM/F12的細(xì)胞培養(yǎng)液中漂洗，用細(xì)吸管吹打瓶?jī)?nèi)組織碎塊至完全散開(kāi)，制成細(xì)胞懸液，經(jīng)100目不銹鋼網(wǎng)過(guò)濾，制成單細(xì)胞懸液；經(jīng)分胎藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞，加入含B27和EGF、bFGF的DMEM/F12無(wú)血清培養(yǎng)基，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞，調(diào)整活細(xì)胞濃度為lX105/ml，將原代細(xì)胞種植于培養(yǎng)瓶，37°C，5% CO2條件下靜置培養(yǎng)； 所述傳代培養(yǎng)及單細(xì)胞克隆、傳代步驟包括將原代培養(yǎng)7天后的細(xì)胞克隆懸液用吸管輕柔吹打進(jìn)行機(jī)械分離，制成單細(xì)胞懸液，用含B27和bFGF的無(wú)血清培養(yǎng)液將細(xì)胞懸液按I X IO4Inr1濃度傳代接種于培養(yǎng)瓶，在37°C，5 % CO2條件下靜置培養(yǎng)7天，同時(shí)進(jìn)行克隆形成實(shí)驗(yàn)，計(jì)數(shù)每代的克隆形成率，每7-9天機(jī)械分離傳代，方法同前；采用有限稀釋法將原代克隆細(xì)胞制成的單細(xì)胞懸液，稀釋到401111'于96孔培養(yǎng)板中滴加稀釋的細(xì)胞懸液,選取僅有一個(gè)細(xì)胞的培養(yǎng)孔作記號(hào)，并動(dòng)態(tài)觀察；待長(zhǎng)成單細(xì)胞克隆球后機(jī)械分離成單細(xì)胞懸液，再將一個(gè)克隆的所有細(xì)胞種至培養(yǎng)瓶中，待次代克隆長(zhǎng)成后連續(xù)傳代，最后得到大量來(lái)自某單個(gè)細(xì)胞的亞克?。? 所述克隆誘導(dǎo)分化步驟包括分別選取部分傳代及單細(xì)胞克隆的細(xì)胞種植于多個(gè)多聚賴氨酸包被的玻片上，并加入含血清培養(yǎng)基，觀察其生長(zhǎng)分化情況，分別于7天、14天行免疫熒光檢測(cè)； 所述間接免疫熒光檢測(cè)步驟包括將克隆細(xì)胞滴至多聚賴氨酸包被的玻片上，貼壁12小時(shí)后用4%多聚甲醒固定,進(jìn)行Nestin抗體免疫熒光染色；分別將傳代及單細(xì)胞克隆的細(xì)胞種植于預(yù)置多聚賴氨酸包被玻片的含血清培養(yǎng)集中，于7天、14天時(shí)取出，進(jìn)行Nestin, NeuN, GFAP, CNP抗體的免疫熒光單標(biāo)染色及NeuN和CNP抗體的免疫熒光雙標(biāo)染色。
全文摘要
本發(fā)明提供一種胚源性神經(jīng)干細(xì)胞原代細(xì)胞分離及傳代培養(yǎng)方法，其包括以下步驟原代神經(jīng)干細(xì)胞的分離和培養(yǎng)，傳代培養(yǎng)及單細(xì)胞克隆、傳代，克隆誘導(dǎo)分化，以及間接免疫熒光檢測(cè)。本發(fā)明采用無(wú)血清培養(yǎng)和單細(xì)胞克隆技術(shù)從胚齡12周的新鮮人胚皮層中分離和培養(yǎng)出具有自我更新和多分化潛能的一株神經(jīng)干細(xì)胞，在3周后可形成大量神經(jīng)干細(xì)胞，該細(xì)胞具有連續(xù)克隆能力，可傳達(dá)培養(yǎng)，表達(dá)神經(jīng)巢蛋白抗原；分化后的細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)元細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞的特異性抗原，解決了胚源性神經(jīng)干細(xì)胞較難培養(yǎng)的問(wèn)題。
文檔編號(hào)C12N5/0797GK103013919SQ20121050711
公開(kāi)日2013年4月3日 申請(qǐng)日期2012年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月30日
發(fā)明者陸華 申請(qǐng)人:陸華