專利名稱：人胚中腦神經(jīng)干細(xì)胞的原代細(xì)胞的分離傳代培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種人胚中腦神經(jīng)干細(xì)胞的原代細(xì)胞的分離傳代培養(yǎng)方法，其應(yīng)用于人胚中腦神經(jīng)干細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)及分化過(guò)程。
背景技術(shù)：
神經(jīng)干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)是神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的重大突破，為神經(jīng)發(fā)育和神經(jīng)組織移植等研究領(lǐng)域開辟了廣闊前景。神經(jīng)干細(xì)胞是一種具有自我更新及廣泛分化潛能的細(xì)胞，它處于分化的非終末狀態(tài)，可通過(guò)對(duì)稱或不對(duì)稱分裂出新的干細(xì)胞或分化潛能逐漸變小的子細(xì)胞，最終產(chǎn)生中樞神經(jīng)系統(tǒng)的三種主要細(xì)胞，即神經(jīng)元細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞。一般認(rèn)為神經(jīng)干細(xì)胞主要存在于哺乳動(dòng)物胎腦的紋狀體、小腦半球、腦室區(qū)等 ，成年哺乳動(dòng)物腦的側(cè)腦室壁和海馬等區(qū)。有關(guān)哺乳動(dòng)物胚胎階段和成年動(dòng)物在特定腦區(qū)存在神經(jīng)干細(xì)胞已不斷得到證實(shí)，但對(duì)人類神經(jīng)干細(xì)胞的研究尚少。本實(shí)驗(yàn)采用無(wú)血清培養(yǎng)和單細(xì)胞克隆技術(shù)嘗試從人胚中腦中分離得到具有自我更新和多分化潛能的神經(jīng)干細(xì)胞，并采用免疫熒光染色予以鑒定。

發(fā)明內(nèi)容
為獲得穩(wěn)定、大量的神經(jīng)干細(xì)胞，本發(fā)明提供一種人胚中腦神經(jīng)干細(xì)胞的原代細(xì)胞的分離傳代培養(yǎng)方法，其應(yīng)用于人胚中腦神經(jīng)干細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)及分化過(guò)程。所述人胚中腦神經(jīng)干細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)及分化過(guò)程，是從人胚中腦中分離培養(yǎng)并鑒定神經(jīng)干細(xì)胞。其是利用無(wú)血清培養(yǎng)和單細(xì)胞克隆技術(shù)在人胚皮層中分離具有單細(xì)胞克隆能力的細(xì)胞，并進(jìn)行培養(yǎng)、傳代，貼壁分化觀察，采用間接免疫熒光檢測(cè)克隆細(xì)胞的神經(jīng)巢蛋白抗原和分化后特異性成熟神經(jīng)細(xì)胞抗原的表達(dá)。具體的，本發(fā)明的人胚中腦神經(jīng)干細(xì)胞的原代細(xì)胞的分離傳代培養(yǎng)方法包括如下步驟原代中腦神經(jīng)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)，原代細(xì)胞的傳代培養(yǎng)，細(xì)胞誘導(dǎo)分化，免疫細(xì)胞化學(xué)染色以及細(xì)胞計(jì)數(shù)；其中所述原代中腦神經(jīng)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)的步驟具體為取胚齡10 13周水囊引產(chǎn)的新鮮人胚胎，在顯微鏡下無(wú)菌分離出胚胎中腦組織，剝除腦膜及表面血管，在PBS液中漂洗三次，用細(xì)吸管反復(fù)吹打組織碎塊至完全散開，離心洗滌后吹打制成細(xì)胞懸液，經(jīng)100目不銹鋼濾網(wǎng)過(guò)濾，制成單細(xì)胞懸液，加入含B27、EGF、bFGF的DMEM/F12無(wú)血清培養(yǎng)基，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞，調(diào)整活細(xì)胞濃度為lX105/ml，將原代細(xì)胞種植于25平方厘米培養(yǎng)瓶，在37°C，5% CO2條件下靜置培養(yǎng)；所述原代細(xì)胞的傳代培養(yǎng)的步驟具體為原代克隆形成后用0.25%胰酶371消化15 30分鐘或采用機(jī)械切割分離或吹打方式，制成單細(xì)胞懸液，用含B27、EGF、bFGF的無(wú)血清培養(yǎng)基將細(xì)胞懸液按IX 106/ml濃度傳代接種于培養(yǎng)瓶，在37°C，5% CO2條件下靜置培養(yǎng)，直至次代克隆球的產(chǎn)生；平均5 7天傳代一次；所述細(xì)胞誘導(dǎo)分化的步驟具體為將不同代數(shù)的神經(jīng)球體外培養(yǎng)7天后種植入多聚賴氨酸包被的含胎牛血清培養(yǎng)基培養(yǎng)皿中，體外3小時(shí)，10天，14天各進(jìn)行一次免疫細(xì)胞化學(xué)染色。所述免疫細(xì)胞化學(xué)染色的步驟包括以間接免疫熒光法檢測(cè)剛貼壁3小時(shí)神經(jīng)球中神經(jīng)巢蛋白表達(dá)，及檢測(cè)神經(jīng)球體外分化14天后，分化細(xì)胞中神經(jīng)微絲、膠質(zhì)纖維酸性蛋白、半乳糖腦苷的表達(dá)；用SABC組織化學(xué)染色試劑盒檢測(cè)在神經(jīng)球分化10天后，分化細(xì)胞中酪氨酸羥化酶的表達(dá)；所述細(xì)胞計(jì)數(shù)的步驟具體為將化學(xué)染色后的細(xì)胞樣本倒置顯微鏡下對(duì)分化的細(xì)胞隨機(jī)選擇4個(gè)獨(dú)立視野計(jì)數(shù)免疫細(xì)胞及總細(xì)胞數(shù)。


通過(guò)下面結(jié)合附圖的詳細(xì)描述，本發(fā)明前述的和其他的目的、特征和優(yōu)點(diǎn)將變得顯而易見。其中圖1所示為本發(fā)明的人胚中腦神經(jīng)干細(xì)胞的原代細(xì)跑的分離及傳代培養(yǎng)方法的步驟流程示意圖。
具體實(shí)施例方式如圖1所示的本發(fā)明的人胚中腦神經(jīng)干細(xì)胞的原代細(xì)胞的分離傳代培養(yǎng)方法的步驟流程示意圖，所述方法是通過(guò)以下步驟具體實(shí)現(xiàn)S1:原代中腦神經(jīng)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)取胚齡10 13周水囊引產(chǎn)的新鮮人胚胎，在顯微鏡下無(wú)菌分離出胚胎中腦組織，剝除腦膜及表面血管，在PBS液(磷酸鹽緩沖液)中漂洗三次，用細(xì)吸管反復(fù)吹打組織碎塊至完全散開，離心洗滌后吹打制成細(xì)胞懸液，經(jīng)100目不銹鋼濾網(wǎng)過(guò)濾，制成單細(xì)胞懸液，加入含1: 50的B27(人體白細(xì)胞抗原)、20ng/ml的 EGF(表皮生長(zhǎng)因子)、20ng/ml的bFGF (成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子)的DMEM/F12(1 I)無(wú)血清培養(yǎng)基，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞，調(diào)整活細(xì)胞濃度為IX 105/ml，將原代細(xì)胞種植于25平方厘米培養(yǎng)瓶，或8ml細(xì)胞懸液瓶，在37°C，5% CO2條件下靜置培養(yǎng)。S2 :原代細(xì)胞的傳代培養(yǎng)原代克隆形成后用0. 25%胰酶37°C消化15 30分鐘或采用機(jī)械切割分離或吹打方式，制成單細(xì)胞懸液，用含B27和EGF、bFGF的無(wú)血清培養(yǎng)基將細(xì)胞懸液按I X 106/ml濃度傳代接種于培養(yǎng)瓶，在37°C ,5% CO2條件下靜置培養(yǎng)，直至次代克隆球的產(chǎn)生；平均5 7天傳代一次。S3 :細(xì)胞誘導(dǎo)分化將不同代數(shù)的神經(jīng)球體外培養(yǎng)7天后種植入多聚賴氨酸包被的含胎牛血清培養(yǎng)基(DMEM/F12+B27+10% FBS)培養(yǎng)皿中，體外3小時(shí)，10天，14天各進(jìn)行一次免疫細(xì)胞化學(xué)染色。S4 :免疫細(xì)胞化學(xué)染色,具體為以間接免疫熒光法檢測(cè)剛貼壁3小時(shí)神經(jīng)球中神經(jīng)巢蛋白(Nestin蛋白)表達(dá)，及檢測(cè)神經(jīng)球體外分化14天后,分化細(xì)胞中神經(jīng)微絲(NF neurofilament)、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)、Galc (半乳糖腦苷)的表達(dá)；所用一抗為抗NestinlgG、抗NF IgG、抗GFAPIgG、抗 Galc IgG，二抗為 FITC 熒光二抗；用SABC(Strept Avidin-Biotin Complex, 一種顯示組織和細(xì)胞中抗原分布的簡(jiǎn)便而敏感的免疫組化染色方法)組織化學(xué)染色試劑盒檢測(cè)在神經(jīng)球分化10天后，分化細(xì)胞中酪氨酸羥化酶(TH)的表達(dá)。SABC法細(xì)胞染色具體染色步驟參照染色試劑盒說(shuō)明。S5 :細(xì)胞計(jì)數(shù)免疫細(xì)胞化學(xué)染色TH(+)的細(xì)胞代表多巴胺能神經(jīng)元，蘇木精復(fù)染，蘭色細(xì)胞核數(shù)代表總細(xì)胞數(shù)。倒置顯微鏡下(20 X)對(duì)分化的細(xì)胞隨機(jī)選擇4個(gè)獨(dú)立視野計(jì)數(shù)TH(+)細(xì)胞及總細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析如下一、人胚中腦原代細(xì)胞成圓形球狀，懸浮生長(zhǎng)，經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞在80%以上，7天后細(xì)胞數(shù)目明顯增加，培養(yǎng)瓶中可見許多懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞團(tuán)塊成球形，稱神經(jīng)球。此類神經(jīng)球體外NESTIN染色強(qiáng)陽(yáng)性，并在體外能分化成NF (+)，GFAP (+)及Galc (+)細(xì)胞。
二、原代神經(jīng)球經(jīng)O. 25%胰酶37°C消化后，形成細(xì)胞懸液，10% 30%細(xì)胞死亡，2 3天后，培養(yǎng)基中出現(xiàn)大量新的小神經(jīng)球成桑椹樣生長(zhǎng)，并逐漸增大，形成次代神經(jīng)球。三、人胚中腦神經(jīng)干細(xì)胞體外分化產(chǎn)生TH(+)細(xì)胞隨傳代次數(shù)增加而逐漸減少。在原代神經(jīng)干細(xì)胞(Ptl)分化IOd后，免疫細(xì)胞化學(xué)染色示TH⑴細(xì)胞占總細(xì)胞比例約5. 65 % ±1. 39 %，體外培養(yǎng)7天后傳代得到P1代神經(jīng)干細(xì)胞，分化10天后免疫細(xì)胞化學(xué)染色示TH⑴細(xì)胞占總細(xì)胞比例降至1. 56% ±0. 37%。隨著體外培養(yǎng)時(shí)間及傳代次數(shù)的增加，TH(+)細(xì)胞也迅速下降，至第三代以后TH(+)細(xì)胞少于O. 01%。本發(fā)明并不局限于所述的實(shí)施例，本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不脫離本發(fā)明的精神即公開范圍內(nèi)，仍可作一些修正或改變，故本發(fā)明的權(quán)利保護(hù)范圍以權(quán)利要求書限定的范圍為準(zhǔn)。
權(quán)利要求
1.一種人胚中腦神經(jīng)干細(xì)胞的原代細(xì)胞的分離傳代培養(yǎng)方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟原代中腦神經(jīng)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)，原代細(xì)胞的傳代培養(yǎng)，細(xì)胞誘導(dǎo)分化，免疫細(xì)胞化學(xué)染色以及細(xì)胞計(jì)數(shù)；其中， 所述原代中腦神經(jīng)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)的步驟具體為取胚齡10 13周水囊引產(chǎn)的新鮮人胚胎，在顯微鏡下無(wú)菌分離出胚胎中腦組織，剝除腦膜及表面血管，在PBS液中漂洗三次，用細(xì)吸管反復(fù)吹打組織碎塊至完全散開，離心洗滌后吹打制成細(xì)胞懸液，經(jīng)100目不銹鋼濾網(wǎng)過(guò)濾，制成單細(xì)胞懸液，加入含B27、EGF、bFGF的DMEM/F12無(wú)血清培養(yǎng)基，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞，調(diào)整活細(xì)胞濃度為I X 105/ml，將原代細(xì)胞種植于25平方厘米培養(yǎng)瓶，在37°C,5% CO2條件下靜置培養(yǎng)； 所述原代細(xì)胞的傳代培養(yǎng)的步驟具體為原代克隆形成后用O. 25%胰酶37°C消化15 30分鐘或采用機(jī)械切割分離或吹打方式制成單細(xì)胞懸液，用含B27、EGF、bFGF的無(wú)血清培養(yǎng)基將細(xì)胞懸液按IX 106/ml濃度傳代接種于培養(yǎng)瓶，在37°C，5% CO2條件下靜置培養(yǎng)，直至次代克隆球的產(chǎn)生；平均5 7天傳代一次； 所述細(xì)胞誘導(dǎo)分化的步驟具體為將不同代數(shù)的神經(jīng)球體外培養(yǎng)7天后種植入多聚賴氨酸包被的含胎牛血清培養(yǎng)基培養(yǎng)皿中，體外3小時(shí)，10天，14天各進(jìn)行一次免疫細(xì)胞化學(xué)染色； 所述免疫細(xì)胞化學(xué)染色的步驟包括以間接免疫熒光法檢測(cè)剛貼壁3小時(shí)神經(jīng)球中神經(jīng)巢蛋白表達(dá)，及檢測(cè)神經(jīng)球體外分化14天后，分化細(xì)胞中神經(jīng)微絲、膠質(zhì)纖維酸性蛋白、半乳糖腦苷的表達(dá)；以及用SABC組織化學(xué)染色試劑盒檢測(cè)在神經(jīng)球分化10天后，分化細(xì)胞中酪氨酸羥化酶的表達(dá)； 所述細(xì)胞計(jì)數(shù)的步驟具體為將化學(xué)染色后的細(xì)胞樣本倒置顯微鏡下對(duì)分化的細(xì)胞隨機(jī)選擇4個(gè)獨(dú)立視野計(jì)數(shù)免疫細(xì)胞及總細(xì)胞數(shù)。
全文摘要
本發(fā)明提出一種人胚中腦神經(jīng)干細(xì)胞的原代細(xì)胞的分離傳代培養(yǎng)方法，其應(yīng)用于人胚中腦神經(jīng)干細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)及分化過(guò)程，所述體外分離培養(yǎng)及分化過(guò)程是從人胚中腦中分離培養(yǎng)并鑒定神經(jīng)干細(xì)胞。其包括步驟原代中腦神經(jīng)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)、原代細(xì)胞的傳代培養(yǎng)、細(xì)胞誘導(dǎo)分化、免疫細(xì)胞化學(xué)染色以及細(xì)胞計(jì)數(shù)。本發(fā)明采用無(wú)血清培養(yǎng)和單細(xì)胞克隆技術(shù)從從人胚中腦中成功建立一株人胚神經(jīng)干細(xì)胞，并進(jìn)行培養(yǎng)、傳代，貼壁分化觀察，該細(xì)胞具有連續(xù)克隆能力，可傳達(dá)培養(yǎng)，表達(dá)神經(jīng)巢蛋白抗原，分化后的細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)元細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞的特異性抗原。
文檔編號(hào)C12N5/0797GK103013918SQ20121050570
公開日2013年4月3日 申請(qǐng)日期2012年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月30日
發(fā)明者陸華 申請(qǐng)人:陸華