專利名稱：人原始間葉干細(xì)胞群的分離、體外培養(yǎng)、制備及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有多向分化潛能，可分化成成骨、軟骨、脂肪、平滑肌、腱、內(nèi)皮細(xì)胞等多種間葉組織的具有自我更新能力的人原始間葉干細(xì)胞群(Human Totipotent Mesenchymal Stem Cells簡(jiǎn)寫為HTMSC)。涉及一種人原始間葉干細(xì)胞群的分離及體外培養(yǎng)、制備方法。特別涉及采用人原始間葉干細(xì)胞群以及基因修飾后的人原始間葉干細(xì)胞群的應(yīng)用，包括骨骼修復(fù)、改善肌萎縮、基因缺陷性疾病(血友病A、B、粘多糖貯積病等)、放療、化療后及再障病員的骨髓微循環(huán)的重建、促造血、增強(qiáng)免疫、疫苗、抗腫瘤。
人體干細(xì)胞系具有自我更新多向分化的原始細(xì)胞，包括(1)從胚胎或胎肝組織分離的胚胎干組織，可分化成人體各種組織；(2)從成人骨髓分離出的造血干組織，可形成淋巴、粒系、紅系各種造血細(xì)胞及腦細(xì)胞；(3)從胎腦分離的神經(jīng)原干細(xì)胞，可分化為神經(jīng)原以及神經(jīng)膠質(zhì)；(4)從成人骨髓分離的間葉干細(xì)胞(MesenchymalStem Cells)可分化成骨骼、軟骨、肌肉、腱等。近年來(lái)，干細(xì)胞特有生物學(xué)特征及潛在生物學(xué)應(yīng)用價(jià)值成為生物學(xué)領(lǐng)域最熱點(diǎn)課題，SCIENCE(1998年11月)報(bào)道了體外分離的原始胚胎干細(xì)胞可維持其未分化狀態(tài)4月余，并可分化成各種人體組織細(xì)胞。SCIENCE(1999年3月)再次報(bào)道了胚胎干細(xì)胞有其局限性(1)體外極難于模擬微環(huán)境使胚胎干細(xì)胞定向分化成所需組織；(2)胚胎干細(xì)胞具有相當(dāng)大的腫瘤發(fā)生潛在性。因此，越來(lái)越多科學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，間葉干細(xì)胞具有比以往認(rèn)為更多更實(shí)際的生物學(xué)應(yīng)用價(jià)值。
以往研究表明人間葉干細(xì)胞系具有自我更新多向分化增殖能力的原始骨髓細(xì)胞。體內(nèi)外在較合適的環(huán)境可分化成成骨細(xì)胞[Haynes Worth,S.E.etal,Bone,1992；13:69-80]、軟骨細(xì)胞[Johnstone,B.etal,Ortho.Res.Soc.,1996；21:65]、脂肪細(xì)胞[Pittenger,M.F.etal,Mol.Biol.Cell.,1996；7:305]、平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、骨髓基質(zhì)細(xì)胞及多種血管內(nèi)皮細(xì)胞。早期間葉干細(xì)胞可體內(nèi)外長(zhǎng)期生長(zhǎng)。
目前國(guó)際上分離人間葉干細(xì)胞多采用已知的間葉干細(xì)胞表面標(biāo)志，Simmon等采用STRO-1單抗識(shí)別成纖維集落形成細(xì)胞(CFU-F)，命名為基質(zhì)干細(xì)胞。STRO-1陽(yáng)性的基質(zhì)細(xì)胞可分化為網(wǎng)織細(xì)胞、脂肪細(xì)胞及骨骼細(xì)胞。該細(xì)胞具有CD10、CD13、CDW90、CD106表面標(biāo)志，該方法分離的間葉干細(xì)胞局限于僅富集了STRO-1陽(yáng)性的人間葉干細(xì)胞，STRO-1陽(yáng)性率僅占間葉干細(xì)胞5-10％，絕大多數(shù)尤其是原始間葉干細(xì)胞可能丟失于分離過程。Caplan等克隆了SB1至SB5系列單克隆抗體可識(shí)別間葉祖細(xì)胞分化成不同時(shí)期的成骨細(xì)胞，而且克隆了SH2、SH3及SH4抗體以識(shí)別間葉祖細(xì)胞，該細(xì)胞可分化成骨骼、軟骨、脂肪等。該著重于骨骼發(fā)生以及應(yīng)用研究。
以往人間葉干細(xì)胞研究分離方法的缺陷為分離的間葉干細(xì)胞不能經(jīng)體外培養(yǎng)分化為間葉組織中的內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞。換言之，分離的細(xì)胞可能不含有較原始的干細(xì)胞，具有平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞分化能力的原始人間葉干細(xì)胞。本方法研制的干細(xì)胞，即具有平滑肌細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞分化潛能的人原始間葉干細(xì)胞，往往已成為骨細(xì)胞特異轉(zhuǎn)錄因子陽(yáng)性間葉干細(xì)胞，CBFA1陽(yáng)性，可分化成成骨細(xì)胞祖細(xì)胞、軟骨細(xì)胞祖細(xì)胞、脂肪細(xì)胞祖細(xì)胞、成纖維細(xì)胞祖細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞。參見

圖1。
體內(nèi)研究已表明間葉干細(xì)胞不僅可自我更新骨髓微環(huán)境，提供人骨髓造血微環(huán)境，包括有助于造血干、祖細(xì)胞分化、增殖和表達(dá)、分泌粘附因子及造血因子，而且可分化成各種間葉組織。顯示了間葉干細(xì)胞具有多種生物學(xué)應(yīng)用價(jià)值。因此，體外建立一種分離及培養(yǎng)人原始間葉干細(xì)胞群制備系統(tǒng)至關(guān)重要。
本發(fā)明的目的之一為國(guó)際上首次從骨髓中分離出具有內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞分化能力的人原始間葉干細(xì)胞群；本發(fā)明的另一目的是以優(yōu)化的培養(yǎng)體系體外長(zhǎng)期培養(yǎng)人原始間葉干細(xì)胞群，最大限度維持間葉干細(xì)胞原始狀態(tài)，而且在特定培養(yǎng)基可誘導(dǎo)定向分化為多種間葉細(xì)胞；本發(fā)明的再一目的是人原始間葉干細(xì)胞群的多種應(yīng)用以及基因修飾后的人原始間葉干細(xì)胞群的應(yīng)用，(如治療基因缺陷性疾病、化療、放療后及再障病員骨髓微環(huán)境重建、骨骼修復(fù)、改善肌萎縮，以及促造血、增強(qiáng)免疫、疫苗、抗腫瘤等多向用途)。因?yàn)樵奸g葉干細(xì)胞具有更多細(xì)胞分化潛能。
本發(fā)明的目的是通過下述方法實(shí)現(xiàn)的一、人原始間葉干細(xì)胞群的分離1、單個(gè)核細(xì)胞的分離采集人體骨髓細(xì)胞或臍帶血細(xì)胞，經(jīng)密度梯度離心1600轉(zhuǎn)/分骨髓細(xì)胞20分鐘，獲得單個(gè)核骨髓細(xì)胞，經(jīng)含1％牛血清白蛋白磷酸緩沖液清洗細(xì)胞2遍后，懸浮細(xì)胞于磷酸緩沖液。
2、人原始間葉干細(xì)胞群的初篩采用包被抗鼠免疫球蛋白M抗體的磁珠與鼠抗人CD45抗原及抗CD39的單克隆抗體結(jié)合后，再與骨髓單個(gè)核細(xì)胞室溫作用半小時(shí)，將與飽和濃度特異性抗體反應(yīng)的骨髓細(xì)胞放置于磁場(chǎng)槽中，經(jīng)磷酸緩沖液沖洗并收集與磁珠分離的骨髓細(xì)胞。
含人原始間葉干細(xì)胞群的骨髓細(xì)胞進(jìn)一步與抗人CD45、CD39及CD14標(biāo)記有熒光素抗體反應(yīng)，經(jīng)過流式細(xì)胞儀分析，分離去除CD45、CD14及CD39陽(yáng)性的骨髓細(xì)胞。該過程去除了骨髓成熟的淋巴細(xì)胞、巨核、單核及紅細(xì)胞母細(xì)胞等。收集含人原始間葉干細(xì)胞群的成熟細(xì)胞表型陰性的細(xì)胞，該細(xì)胞群可分為大與小體積細(xì)胞，小體積細(xì)胞約占2％，而大體積細(xì)胞為人原始間葉干細(xì)胞群，約占骨髓細(xì)胞0.03-0.06％。
特點(diǎn)該分離人原始間葉干細(xì)胞制備方法所獲得人原始間葉干細(xì)胞群，不同于以往人間葉干細(xì)胞分離方法。以往使用特異識(shí)別人間葉干細(xì)胞的單克隆抗體如SH2、SH3、STRO-1等，僅限于分離SH2、SH3、STRO-1陽(yáng)性的人間葉干細(xì)胞。該間葉干細(xì)胞可分化成成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等，但尚無(wú)平滑肌細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞分化潛能報(bào)道。本分離方法不同于以往分離方法，不局限于收集SH2、SH3或STRO-1陽(yáng)性的干細(xì)胞。本發(fā)明分離富集不僅具有以往間葉干細(xì)胞分化潛能，而且可分化成為平滑肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞的原始間葉干細(xì)胞。參見圖2人原始間葉干細(xì)胞群的分離、培養(yǎng)增殖及多向分化。其中1為采集人骨髓細(xì)胞，2．為密度梯度離心獲得單個(gè)核細(xì)胞層，3．為磁場(chǎng)槽，4．為免疫吸附在磁場(chǎng)分離出含有人間葉細(xì)胞骨髓細(xì)胞，5．為小體積具有間葉細(xì)胞表型細(xì)胞，6．為大體積人原始間葉干細(xì)胞群，表型為CD13、CD44、CDW90、1B10、激活白細(xì)胞粘附分子陽(yáng)性；CD50、CD39、DR、CD45、CD68陰性，7．為流式細(xì)胞儀用于分析、分離免疫熒光標(biāo)記的間葉細(xì)胞。
二、人原始間葉干細(xì)胞群的體外培養(yǎng)及多向分化、增殖1．人原始間葉干細(xì)胞群的體外培養(yǎng)將獲得的人原始間葉干細(xì)胞群放置于經(jīng)Fibronectin(FN)包被的培養(yǎng)板培養(yǎng)。比較研究了三種不同的培養(yǎng)條件，包括①無(wú)血清②含低小牛血清③含12％小牛血清、12％馬血清的培養(yǎng)體系。結(jié)果表明①無(wú)血清僅含有血小板衍化生長(zhǎng)因子、內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，地塞米松、硒、轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素、亞油酸、牛白蛋白、抗壞血酸、抗菌素DMEM及MCDB培養(yǎng)基和②含12％小牛血清、馬血清，氫化考的松及β硫基乙醇的培養(yǎng)條件，不利于人原始間葉干細(xì)胞群體無(wú)分化的細(xì)胞生長(zhǎng)。在含有低小牛血清、地塞米松、BB血小板衍化生長(zhǎng)因子及內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，硒、轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素、亞油酸、白蛋白、抗壞血酸、10毫升/升抗霉菌素、/1萬(wàn)單位青霉素、/1萬(wàn)微克鏈霉素、25微克二性要素B、F-12營(yíng)養(yǎng)混合物的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，人原始間葉干細(xì)胞群體外長(zhǎng)期生長(zhǎng)且維持未分化狀態(tài)呈人原始間葉干細(xì)胞表型。細(xì)胞呈紡錘體形，每4天換培養(yǎng)液去除懸浮細(xì)胞，以含1毫摩爾EDTA的0、25％胰酶消化細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞傳代。人原始間葉干細(xì)胞群細(xì)胞免疫表型為CD13、CD44、CD49b、CDW90、1B10、激活白細(xì)胞粘附分子陽(yáng)性，CD50、CD39、DR陰性。
以往研究表明，SH2、SH3或STRO-1陽(yáng)性間葉干細(xì)胞約占1/1-10萬(wàn)個(gè)單個(gè)核骨髓細(xì)胞，本發(fā)明采用有限稀釋方法確定了人原始間葉干細(xì)胞群約1/1-5百萬(wàn)單個(gè)核骨髓細(xì)胞。以往培養(yǎng)條件采用10％血清的培養(yǎng)條件培養(yǎng)間葉干細(xì)胞。本發(fā)明采用較低血清濃度接近人生理?xiàng)l件的培養(yǎng)條件，以維持最佳細(xì)胞未分化原始狀態(tài)的體外生長(zhǎng)。
2、人原始間葉干細(xì)胞群的多向分化。
經(jīng)4代培養(yǎng)后，人原始間葉干細(xì)胞群可多向分化成骨骼細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞、肌細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞等，其中平滑肌細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞分化潛能為以往間葉干細(xì)胞未見報(bào)道的。
①分化成骨細(xì)胞經(jīng)含地塞米松、抗壞血酸、β磷酸甘油及β轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子超家族蛋白(如骨形成蛋白2、3)，生長(zhǎng)因子如纖維生長(zhǎng)因子，前列腺素等的培養(yǎng)體系培養(yǎng)7天后，細(xì)胞內(nèi)鹼性磷酸酶達(dá)峰值。14天后，Von Kossa染色及熒光鈣骨礦化測(cè)定人間葉干細(xì)胞分化成成骨細(xì)胞。成骨細(xì)胞分泌及形成骨樣細(xì)胞間葉物質(zhì)。
②分化軟骨細(xì)胞經(jīng)含β轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子或抑制素A、軟骨刺激活性因子骨形成蛋白4等培養(yǎng)2-3天，組織學(xué)鑒定甲苯胺藍(lán)染色陽(yáng)性為軟骨細(xì)胞。免疫組化分析，軟骨細(xì)胞標(biāo)志CSPG-M陽(yáng)性。
③分化內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)含人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子培養(yǎng)2周后，細(xì)胞表型為CD36、CD34及Von Willerband因子陽(yáng)性為內(nèi)皮細(xì)胞。
④分化肌細(xì)胞經(jīng)含5-azacytidine誘導(dǎo)1天后，2周后細(xì)胞免疫組化測(cè)定，肌原蛋白陽(yáng)性為肌細(xì)胞。在早期分化過程中，多種轉(zhuǎn)錄因子如MyoD、Myf5、Myf6及Myogenin分別表達(dá)陽(yáng)性。
⑤基質(zhì)細(xì)胞在特異性細(xì)胞因子如白介素1α或白介素2等誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)人原始間葉干細(xì)胞群，30％細(xì)胞密度傳代培養(yǎng)，經(jīng)3天誘導(dǎo)分化，收集過濾上清，測(cè)定已分化為基質(zhì)細(xì)胞的新分泌的細(xì)胞因子，包括白介素3、6、G-CSF、GM-CSF、白血病抑制因子、干細(xì)胞生長(zhǎng)因子、β2轉(zhuǎn)代生長(zhǎng)因子。經(jīng)誘導(dǎo)的基質(zhì)細(xì)胞分泌相當(dāng)高水平的上述細(xì)胞因子，而未分化細(xì)胞僅白介素6表達(dá)水平較高。
⑥脂肪細(xì)胞分化在含地塞米松、1甲基3異丁黃嘌呤、胰島素及茚甲新，小牛血清培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)間葉干細(xì)胞群2-3天，然后經(jīng)含胰島素及原小牛血清及營(yíng)養(yǎng)成分培養(yǎng)基1天后，第2天后開始形成脂質(zhì)空洞。
特點(diǎn)體外誘導(dǎo)分化人原始間葉干細(xì)胞群系迅速、均一干細(xì)胞分化發(fā)展過程，該細(xì)胞工程具有廣泛應(yīng)用價(jià)值。a、純化的人原始間葉干細(xì)胞群不含有不利于多向分化的細(xì)胞生物因子；b、體外可以控制細(xì)胞分化期，尤其為骨骼不同發(fā)育時(shí)期；c、體外可模擬所需分化細(xì)胞亞型，如肌肉形成快或慢肌細(xì)胞；d、體外分化均一、迅速，人原始間葉干細(xì)胞群同時(shí)暴露于較適劑量誘導(dǎo)生物活性因子以定向分化，而體內(nèi)往往為部分微環(huán)境逐漸誘導(dǎo)分化，歷時(shí)長(zhǎng)，具有多態(tài)分化性。
人原始間葉干細(xì)胞群較以往間葉干細(xì)胞具有更多的分化潛能，包括平滑肌細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞，加之均一迅速體外分化優(yōu)勢(shì)，為其實(shí)現(xiàn)廣泛應(yīng)用奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。
3、人原始間葉干細(xì)胞群的體外生長(zhǎng)人原始間葉干細(xì)胞群增殖迅速，第1周可增殖1千倍，第4周可增殖3萬(wàn)倍，第8周可增殖約1千萬(wàn)倍。人原始間葉干細(xì)胞群體外觀察2月余仍保持未分化狀態(tài)呈指數(shù)增殖。參見圖2。其中8．為細(xì)胞培養(yǎng)皿用于FN包被培養(yǎng)人原始間葉干細(xì)胞群，每4天換液，以去除懸浮細(xì)胞，9．為人原始間葉干細(xì)胞群顯微鏡下呈紡錘體形，具有間葉干細(xì)胞表型，10．為人原始間葉干細(xì)胞群第一周可擴(kuò)增1千倍，第八周可達(dá)1千萬(wàn)倍，11．為誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞，12．為誘導(dǎo)分化為軟骨細(xì)胞，13．為誘導(dǎo)分化為內(nèi)皮細(xì)胞，14．為誘導(dǎo)分化為肌細(xì)胞，15．為誘導(dǎo)分化為其他組織細(xì)胞。
三、基因修飾人原始間葉干細(xì)胞群的應(yīng)用設(shè)計(jì)采用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體如MSCV-IRES-EGFP特點(diǎn)為1，具有較強(qiáng)啟動(dòng)子啟始外源基因，尤其在造血干細(xì)胞高效表達(dá)。2，克服了第一代逆轉(zhuǎn)錄病毒載體所致功能基因Silencing缺點(diǎn)。3，該載體保留了分泌高滴度病毒上清的優(yōu)勢(shì)。
采用內(nèi)核糖體啟始序列(IRES)起始表達(dá)功能基因及篩選基因，可使單啟動(dòng)子同時(shí)翻譯IRES引導(dǎo)的上、下游基因，以獲得相同水平雙蛋白表達(dá)，克服了以往載體內(nèi)源啟動(dòng)子自相抑制蛋白表達(dá)作用。
采用最佳篩選基因綠熒光蛋白(GFP)，經(jīng)64、65位點(diǎn)突變的增強(qiáng)綠熒光蛋白(EGFP)，特點(diǎn)為無(wú)需反應(yīng)底物，熒光強(qiáng)度增至100倍，可獲得含修飾基因表達(dá)的熒光陽(yáng)性細(xì)胞，24小時(shí)可經(jīng)流式細(xì)胞儀快捷分離、應(yīng)用研究。
修飾基因可為多向分化誘導(dǎo)基因(骨形成蛋白基因、β轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子等)、基因缺陷疾病缺失基因(凝血因子Ⅷ、Ⅸ血友病基因、粘多糖病基因IDS等)，促造血、增強(qiáng)免疫的細(xì)胞因子、抗腫瘤基因。如圖3所示，將修飾基因克隆，酶切后連接于上游BglⅡ或XhoⅠ、下游EcoRⅠ酶切位點(diǎn)。參見圖3逆轉(zhuǎn)錄病毒載體設(shè)計(jì)，共轉(zhuǎn)染及富集高滴度病毒上清轉(zhuǎn)導(dǎo)人原始間葉干細(xì)胞群。其中X．代表任一基因?qū)⑥D(zhuǎn)導(dǎo)人原始間葉干細(xì)胞群，B．為BglⅡ或XhoⅠ酶切位點(diǎn)，E．為EcoRⅠ酶切位點(diǎn)，1．為MSCV逆轉(zhuǎn)錄病毒啟動(dòng)子，2．為IRES內(nèi)核糖體啟始療列，3．為EGFP增強(qiáng)綠熒光蛋白，4．為CMV啟動(dòng)子。
四．制備含修飾基因的高滴度病毒上清及基因轉(zhuǎn)染人原始間葉干細(xì)胞群1．采用PCL-Ampho質(zhì)?？焖俎D(zhuǎn)染系統(tǒng)，與逆轉(zhuǎn)錄病毒載體共轉(zhuǎn)染293Kj細(xì)胞。將PCL及病毒載體20微克質(zhì)粒DNA加入725微升(0、25M)氯化鈣與(PH7、0)725微升2倍HBS緩沖液混勻，再與2百萬(wàn)個(gè)293Kj細(xì)胞共培養(yǎng)(37℃)6小時(shí)。取出轉(zhuǎn)染液加入15％甘油緩沖液5毫升，休克細(xì)胞1分鐘，加入5毫升培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞，第二及第三天收集含修飾基因的病毒上清液。
2．采用VSV-G質(zhì)粒富集病毒系統(tǒng)，與病毒載體及PCL質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染后，收集的病毒上清經(jīng)Beckman L3-50超離心50000g(4℃)90分鐘，然后以0.1％Hanks液4℃溶解病毒沉淀12小時(shí)。經(jīng)該系統(tǒng)病毒可濃縮200-2000倍，病毒上清滴度可達(dá)2×109(集落形成單位/毫升)。
3．基因轉(zhuǎn)染采用膠原包被轉(zhuǎn)孔膜培養(yǎng)板、流式病毒轉(zhuǎn)染方法。將膠原包被的0.4μm孔轉(zhuǎn)孔器放置于細(xì)胞培養(yǎng)板，病毒上清持續(xù)穿流轉(zhuǎn)膜，以富集病毒上清，與被轉(zhuǎn)染細(xì)胞共培養(yǎng)24小時(shí)2次，中間相隔12小時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)及基因轉(zhuǎn)染全過程在低血清培養(yǎng)基進(jìn)行。該病毒轉(zhuǎn)染可獲得人間葉干細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染陽(yáng)性率高達(dá)20-50％。參見圖3。其中5．為VSV-G用以富集病毒上清，6．為CMV LN增強(qiáng)子啟動(dòng)子，7．為gag基因，8．為pol基因，9．為Ampho基因，10．為293kj細(xì)胞，11．為L(zhǎng)3-50超離心機(jī)，12．為富集的病毒，13．為轉(zhuǎn)孔細(xì)胞培養(yǎng)板，14．為人原始間葉干細(xì)胞群與病毒共培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染細(xì)胞，15．為基因修飾的人原始間葉干細(xì)胞群回輸病員，以滿足多種臨床用途。
五．人原始間葉干細(xì)胞群的應(yīng)用1．基因修飾后的人原始間葉干細(xì)胞群應(yīng)用于骨骼愈合骨骼生長(zhǎng)發(fā)育中經(jīng)過三個(gè)主要過程細(xì)胞趨化、有絲分裂及分化成骨細(xì)胞。創(chuàng)傷后等可誘發(fā)后天性骨骼再建，骨形成蛋白可誘導(dǎo)成骨祖細(xì)胞，已定向成骨祖細(xì)胞無(wú)需外源信號(hào)可形成前成骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞及骨細(xì)胞。
基因修飾后的人原始間葉干細(xì)胞群應(yīng)用于骨骼愈合病理性骨不聯(lián)合、骨延期愈合、粉碎性骨折或全關(guān)節(jié)的修復(fù)等病員，尤其有效應(yīng)用于因自體骨移植或可提供骨不足造成骨缺失的愈合。
富集人原始間葉干細(xì)胞，選擇誘導(dǎo)成骨細(xì)胞生成培養(yǎng)基培養(yǎng)，并將具有誘導(dǎo)成骨細(xì)胞的基因(骨形成蛋白2或4或胰島素生成因子等)克隆于IRES的上游MSCV-IRES-EGFF載體成為MSCV-X-IRES-EGFP載體，共轉(zhuǎn)染293Kj細(xì)胞，收集病毒上清轉(zhuǎn)導(dǎo)人原始間葉干細(xì)胞群，流式細(xì)胞儀分析收集基因修飾的間葉細(xì)胞(最終將分化成成骨細(xì)胞)。以5×106細(xì)胞/每毫升與填充物以3比1容積混勻，注入骨缺失部位。填充物為均一，潴留間葉細(xì)胞群、允許血管內(nèi)生長(zhǎng)的物質(zhì)(如羥磷灰石及磷酸三鈣等)。
2．肌營(yíng)養(yǎng)原蛋白基因修飾改善肌營(yíng)養(yǎng)退行性變肌營(yíng)養(yǎng)不良系進(jìn)行性近端肌萎縮，可波及心臟等。特征為血肌酸激酶增加，肌纖維蛋白降解，分子水平為平滑肌缺乏肌營(yíng)養(yǎng)原蛋白，如波及胃腸可導(dǎo)致胃酸排空延遲、急性胃擴(kuò)張、假性腸阻塞。
以往動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明肌原蛋白基因表達(dá)50倍可糾正肌營(yíng)養(yǎng)不良功能。將含有肌原蛋白基因克隆于IRES上游，將突變tyr22DHFR基因替代EGFP基因，構(gòu)建成MSCV-肌原蛋白-IRES-tyr22DHFR基因修飾載體，該載體特點(diǎn)為tyr22DHFR基因?yàn)榧讱淙~酸(MTX)耐藥基因(Zhao,RCH.,etal,Blood,1997；12:4687)，可加壓誘導(dǎo)引起該肌原蛋白-IRES-tyr22DHFR基因考貝數(shù)增加，以獲得基因高表達(dá)糾正肌營(yíng)養(yǎng)不良。
人原始間葉干細(xì)胞群在較佳的誘導(dǎo)肌細(xì)胞生成培養(yǎng)基培養(yǎng)，將含MSCV-肌原蛋白-IRES-tyr22DHFR基因病毒上清轉(zhuǎn)導(dǎo)間葉細(xì)胞，即病毒考貝與人間葉細(xì)胞20比1，在含有8微克魚精蛋白低血清培養(yǎng)基共培養(yǎng)24小時(shí)二次，中間相隔12小時(shí)。經(jīng)甲氫葉酸(0.25微摩爾)含胎牛血清培養(yǎng)基篩選2周，將表達(dá)該載體的人間葉細(xì)胞注射肌營(yíng)養(yǎng)不良患處，含肌原蛋白修飾的肌細(xì)胞將與病理性肌纖維融合，最終糾正肌營(yíng)養(yǎng)不良。
3．基因治療基因缺陷性疾病①血友病A、B系凝血因子Ⅷ、Ⅸ缺乏所致的出血性疾病。重型血友病凝血因子低于正常水平1％。目前血漿或重組因子替代治療為主要治療手段。該常規(guī)治療的不足為藥物昂貴及凝血因子體內(nèi)半衰期短。
②粘多糖貯積病為致命溶酶體貯積失調(diào)，由于缺乏IDS所致嚴(yán)重骨、神經(jīng)癥狀。唯一治療系對(duì)癥治療及骨髓移植，但療效不顯。
③囊性纖維變性系囊性纖維化轉(zhuǎn)膜調(diào)控蛋白缺陷所致。
④多種基因缺陷性疾病均需要建立長(zhǎng)期穩(wěn)定體細(xì)胞基因表達(dá)分泌系統(tǒng)。人原始間葉干細(xì)胞群具備體外大量擴(kuò)增，且具有體內(nèi)外長(zhǎng)期分化、增殖特性，聯(lián)合逆轉(zhuǎn)錄病毒可穩(wěn)定整合體細(xì)胞基因組染色體DNA，克服逆轉(zhuǎn)錄病毒不易轉(zhuǎn)導(dǎo)非增殖性靶細(xì)胞弱點(diǎn)。
該發(fā)明采用MSCV逆轉(zhuǎn)錄病毒具有較強(qiáng)的啟始基因功效，可10倍高效表達(dá)于造血干細(xì)胞，并克服基因silencing不足。奠定了該系統(tǒng)實(shí)施基因治療的有效性和可行性。
該基因治療特點(diǎn)為較低水平表達(dá)可糾正基因缺陷，即使整合基因高水平表達(dá)也無(wú)明顯副作用。
采用MSCV病員缺陷的正?；?IRES-EGFP轉(zhuǎn)導(dǎo)人原始間葉干細(xì)胞群，篩選陽(yáng)性基因攜帶細(xì)胞，凍存細(xì)胞，定量回輸病員，評(píng)估基因表達(dá)水平，觀察治療效果。
4．骨髓微環(huán)境重建及促造血基因應(yīng)用①病員經(jīng)大量放療、化療后，起支持骨髓造血干細(xì)胞的大量骨髓基質(zhì)細(xì)胞受損傷，不能分泌必需造血因子和表達(dá)重要粘附因子以維持正常骨髓微環(huán)境。
骨髓微環(huán)境的重建是扶持造血干細(xì)胞骨髓重新生長(zhǎng)、分化至關(guān)重要的因素，也是骨髓移植后病員度過早期危險(xiǎn)期的關(guān)鍵。
大量放療、化療前，采集病員骨髓，體外培養(yǎng)人原始間葉干細(xì)胞群，凍存，待骨髓移植后回輸病員，為病員恢復(fù)提供最佳的骨髓微環(huán)境。
②再障病員造血微環(huán)境受不同程度的破壞，治療可采集人原始間葉干細(xì)胞群?？寺?gòu)建表達(dá)人白介素3因子的病毒載體，轉(zhuǎn)導(dǎo)MSCV-白介素3-IRES-EGFP基因于人原始間葉干細(xì)胞群，回輸再障病員，白介素3在骨髓內(nèi)表達(dá)具有治療再生障礙性貧血的作用。
③貧血，尤其慢性病(如炎癥性疾病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、嚴(yán)重感染、腫瘤等)導(dǎo)致的貧血。將含促紅細(xì)胞生成素的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)人原始間葉干細(xì)胞群，回輸慢性疾病引起貧血的病員。
5．增強(qiáng)免疫、腫瘤疫苗等用途腫瘤疫苗的基因治療涉及細(xì)胞及分子水平的免疫系統(tǒng)的調(diào)控，組織細(xì)胞增殖、分化、存亡的調(diào)節(jié)。多數(shù)腫瘤經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞因子如GM-CSF、白介素2、4、6、干擾素等因子可誘導(dǎo)體內(nèi)特異性腫瘤抗原，以增強(qiáng)體內(nèi)識(shí)別與特異性殺傷如黑色素細(xì)胞瘤特異性腫瘤抗原Magel,Martl,gpioo，酪氨酸酶的誘導(dǎo)表達(dá)。
該基因治療可用于免疫機(jī)能低下或免疫識(shí)別障礙所導(dǎo)致的腫瘤。γ-干擾素已廣泛地應(yīng)用于毛狀細(xì)胞白血病、慢性粒細(xì)胞白血病(慢粒)、Kaposi肉瘤、惡性黑色素瘤等。
采用人原始間葉干細(xì)胞群，具有正常造血、免疫潛能早期骨髓細(xì)胞，經(jīng)細(xì)胞因子修飾后，具有增強(qiáng)免疫、腫瘤疫苗及抗腫瘤作用。
①慢性粒細(xì)胞性白血病，為造血干細(xì)胞惡性腫瘤，大量中、晚幼粒細(xì)胞在外周血惡性增殖。α-干擾素為有效治療慢?；熤唬瑢⒑笑?干擾素基因的MSCV-α-干擾素IRES-EGFP病毒基因轉(zhuǎn)導(dǎo)人原始間葉干細(xì)胞群，回輸病員，可持續(xù)骨髓內(nèi)α-干擾素治療慢粒病員。
②采用同樣方案可以γ-干擾素治療慢性粒細(xì)胞白血病、毛狀細(xì)胞白血病等。
③轉(zhuǎn)導(dǎo)白介素2、γ-干擾素可治療全身轉(zhuǎn)移性腫瘤。
六、人原始間葉干細(xì)胞群分離、體外培養(yǎng)、制備及應(yīng)用的例作1、獲得病員骨髓原始間葉干細(xì)胞群①分離單個(gè)核骨髓細(xì)胞采集病員的骨髓細(xì)胞，經(jīng)密度梯度離心1600轉(zhuǎn)/分骨髓細(xì)胞20分鐘，獲得單個(gè)核骨髓細(xì)胞，經(jīng)含1％牛血清白蛋白磷酸緩沖液清洗細(xì)胞2遍后，懸浮細(xì)胞于磷酸緩沖液。
②富集病員原始間葉干細(xì)胞群采用包被抗鼠免疫球蛋白M抗體的磁珠與鼠抗人CD45抗原及抗CD39的單克隆抗體結(jié)合后，再與骨髓單個(gè)核細(xì)胞室溫作用半小時(shí)，將與飽和濃度特異性抗體反應(yīng)的骨髓細(xì)胞放置于磁場(chǎng)槽中，經(jīng)磷酸緩沖液沖洗并收集與磁珠分離的骨髓細(xì)胞。將含病員原始間葉干細(xì)胞群的骨髓細(xì)胞進(jìn)一步與抗人CD45、CD39及CD14標(biāo)記有熒光素抗體反應(yīng)，經(jīng)過流式細(xì)胞儀分析，分離去除CD45、CD14及CD39陽(yáng)性的骨髓細(xì)胞。該過程去除了骨髓成熟的淋巴細(xì)胞、巨核、單核及紅細(xì)胞母細(xì)胞等。收集病員原始間葉干細(xì)胞群。
2、體外病員原始間葉干細(xì)胞群的培養(yǎng)將獲得病員原始間葉干細(xì)胞群放置于經(jīng)FN包被的培養(yǎng)板培養(yǎng)。在含有低小牛血清、地塞米松、BB血小板衍化生長(zhǎng)因子及內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，硒、轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素、亞油酸、白蛋白、抗壞血酸、10毫升/升抗霉菌素、/1萬(wàn)單位青霉素、/1萬(wàn)微克鏈霉素、25微克二性要素B、F-12營(yíng)養(yǎng)混合物的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，病員原始間葉干細(xì)胞群體外長(zhǎng)期生長(zhǎng)且維持未分化狀態(tài)。
3、克隆構(gòu)建MSCV-IFN-α-IRES-EGFP逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將病員α干擾素基因下游端酶切后，以Klenow酶反應(yīng)4℃,20分鐘補(bǔ)平，DNA經(jīng)純化后，以XhoⅠ酶切α干擾素基因上游，獲得677bp(XhoⅠ--平端)α干擾素基因。同樣，MSCV載體以EcoRⅠ酶切后Klenow酶補(bǔ)平，再經(jīng)XhoⅠ酶切產(chǎn)生相匹配的連接位點(diǎn)。將α干擾素基因克隆至XhoⅠ--平端的MSCV逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，DNA序列分析證實(shí)獲得MSCV-IFN-α-IRES-EGFP載體參見圖4。
4、獲得高滴度含α干擾素的病毒上清體外大量擴(kuò)增MSCV-IFN-α-IRES-EGFP,MSCV及PCL質(zhì)粒DNA，將20微克上述DNA混勻于725微升0.25摩爾的氯化鈣，再與725微升HBS緩沖液(8.2克氯化鈉，5.9克HEPES,0.21克磷酸氫二鈉，加水至500毫升)振勻形成勻細(xì)的DNA沉淀物。
以2×106細(xì)胞/每10毫升DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)293Kj細(xì)胞于明膠包被的10厘米直徑培養(yǎng)皿，次日待細(xì)胞密度為40％，將上述DNA沉淀物加入293Kj細(xì)胞共培養(yǎng)37℃,6小時(shí)，去掉細(xì)胞培養(yǎng)上清，加入5毫升含15％甘油磷酸緩沖液室溫作用細(xì)胞1分鐘，以磷酸緩沖液洗293Kj細(xì)胞后，加入5毫升DMEM培養(yǎng)基放置于37℃5％的二氧化碳孵育箱培養(yǎng)細(xì)胞，第1、2天后收集病毒上清。
5、α干擾素轉(zhuǎn)導(dǎo)慢粒細(xì)胞系K562抑制其細(xì)胞生長(zhǎng)將被轉(zhuǎn)導(dǎo)的K562細(xì)胞放置于轉(zhuǎn)孔培養(yǎng)板上腔，然后加入含高滴度α干擾素病毒上清或陰性對(duì)照MSCV病毒上清，與K562細(xì)胞共同培養(yǎng)24小時(shí)2次，中間相隔12小時(shí)以細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)。第2天后，采用流式細(xì)胞儀分離、同時(shí)表達(dá)綠熒光蛋白和α干擾素的K562細(xì)胞及僅綠熒光蛋白表達(dá)的MSCV對(duì)照組K562細(xì)胞，觀察α干擾素對(duì)K562細(xì)胞的生長(zhǎng)影響。
①PCR檢測(cè)α干擾素轉(zhuǎn)導(dǎo)的K562細(xì)胞α干擾素基因設(shè)計(jì)α干擾素上游引物，5’-CAG TTC CAG AAG GCT CAA GC-3’及下游引物5’-ACC TCC TGC ATC ATA CAG GC-3’和內(nèi)源性對(duì)照基因β-Actin上、下游引物，抽取及純化α干擾素或MSCV轉(zhuǎn)導(dǎo)的K562細(xì)胞DNA，體外在95℃,1分鐘；58℃,1分鐘；72℃,1分鐘；30循環(huán)后72℃延伸7分鐘，以擴(kuò)增α干擾素基因。α干擾素轉(zhuǎn)導(dǎo)K562細(xì)胞可擴(kuò)增173bp長(zhǎng)度α干擾素基因，而MSCV對(duì)照組為陰性。證實(shí)α干擾素基因已攜帶于K562細(xì)胞DNA中。
②α干擾素抑制K562細(xì)胞生長(zhǎng)觀察α干擾素轉(zhuǎn)導(dǎo)K562細(xì)胞生長(zhǎng)，對(duì)照組采用MSCV轉(zhuǎn)導(dǎo)K562細(xì)胞，將慢粒細(xì)胞系K562細(xì)胞以1×105/每孔放置12孔細(xì)胞培養(yǎng)板，繼續(xù)觀察細(xì)胞增殖。測(cè)定1至4天細(xì)胞增殖數(shù)，每次取50微升細(xì)胞懸液與胎盤藍(lán)染色活性細(xì)胞計(jì)數(shù)。結(jié)果表明對(duì)照組與α干擾素轉(zhuǎn)導(dǎo)的K562細(xì)胞第1天細(xì)胞增殖相當(dāng)為12×104/每毫升，自第2天α干擾素轉(zhuǎn)導(dǎo)K562細(xì)胞生長(zhǎng)開始受到抑制，第4天細(xì)胞顯著受抑制，對(duì)照組細(xì)胞數(shù)為90×104/每毫升，而α干擾素轉(zhuǎn)導(dǎo)K562細(xì)胞僅30×104/每毫升。
6、α干擾素轉(zhuǎn)導(dǎo)骨髓CD34陽(yáng)性細(xì)胞無(wú)抑制集落形成作用采用同樣方法將α干擾素基因轉(zhuǎn)導(dǎo)CD34陽(yáng)性細(xì)胞，經(jīng)流式細(xì)胞儀分離α干擾素陽(yáng)性骨髓CD34細(xì)胞。觀察α干擾素基因?qū)撬鐲D34陽(yáng)性細(xì)胞集落形成的影響。對(duì)照組為MSCV轉(zhuǎn)導(dǎo)的CD34陽(yáng)性細(xì)胞，測(cè)定造血細(xì)胞CFU-GM集落生長(zhǎng)采用CD34陽(yáng)性的5000細(xì)胞放置于含10毫微克/毫克白介素6、白介素3、G-CSF以及3單位/每毫升促紅細(xì)胞生成素的半固體瓊脂培養(yǎng)體系。經(jīng)37℃含5％二氧化碳孵育箱培養(yǎng)2周后，在倒置顯微鏡下觀察GM集落形成單位及BFU-E(紅系集落形成單位)并計(jì)數(shù)。結(jié)果表明對(duì)照組與α干擾素組集落相當(dāng)，約為250單位。提示α干擾素基因無(wú)明顯骨髓CD34陽(yáng)性細(xì)胞集落形成抑制作用。
7、α干擾素轉(zhuǎn)導(dǎo)人原始間葉干細(xì)胞群將α干擾素病毒上清用以轉(zhuǎn)導(dǎo)人原始間葉干細(xì)胞群，獲得38％高效轉(zhuǎn)導(dǎo)人原始間葉干細(xì)胞。經(jīng)流式細(xì)胞儀富集α干擾素陽(yáng)性病員原始間葉干細(xì)胞群，凍存，分批回輸病員，應(yīng)用于慢粒病員的治療。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是1．分離人原始間葉干細(xì)胞群簡(jiǎn)捷、可行、重復(fù)好。
2．人原始間葉干細(xì)胞群可體外大量擴(kuò)增，第八周多達(dá)1千萬(wàn)倍，且仍保持原間葉干細(xì)胞分化、增殖潛能及表型。
3．人原始間葉干細(xì)胞群可多向分化成成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肌細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、骨髓基質(zhì)細(xì)胞，以及本發(fā)明首次報(bào)道可分化的多種血管內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞等。
4、人原始間葉干細(xì)胞群，克服了胚胎干細(xì)胞的來(lái)源困難，體外無(wú)法誘導(dǎo)分化成特異組織等不足，又可提供多種造血干細(xì)胞所無(wú)法提供的間葉組織細(xì)胞。
5．人原始間葉干細(xì)胞群結(jié)合逆轉(zhuǎn)錄病毒為有效、可行的基因治療系統(tǒng)?？砷L(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)經(jīng)病毒整合人體細(xì)胞染色體DNA的修飾基因，達(dá)到基因治療目的。人原始間葉干細(xì)胞群大量增殖允許逆轉(zhuǎn)錄病毒穩(wěn)定整合人基因組染色體DNA；轉(zhuǎn)染后，該細(xì)胞仍保持間葉干細(xì)胞原有分化、增殖潛能，體內(nèi)外可長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)修飾的基因。
克服腺病毒、腺病毒相關(guān)病毒(AAV)極少地轉(zhuǎn)導(dǎo)基因人基因組DNA的不足，以及該病毒產(chǎn)物所致的體內(nèi)不良免疫反應(yīng)?？朔﨤enti病毒不善安全等不足。
6、MSCV逆轉(zhuǎn)錄病毒載體具高效表達(dá)修飾基因于干細(xì)胞，無(wú)silencing；采用IRES無(wú)內(nèi)源啟動(dòng)子所致基因表達(dá)干擾；選用增強(qiáng)綠熒光蛋白快捷分離含修飾基因的陽(yáng)性細(xì)胞。
7、采用快速轉(zhuǎn)染富集病毒系統(tǒng)，可三天內(nèi)獲得病毒上清高達(dá)2×109。
8．采用包被轉(zhuǎn)孔培養(yǎng)器流式病毒轉(zhuǎn)染，可獲得基因轉(zhuǎn)染人間葉干細(xì)胞率高達(dá)20-50％。
9．人原始間葉干細(xì)胞群可誘導(dǎo)多向分化，應(yīng)用于骨骼修復(fù)、平滑肌基因治療、造血微環(huán)境重建、基因缺陷性疾病基因治療、抗腫瘤疫苗、增強(qiáng)造血、免疫等多種用途。
權(quán)利要求
1.一種人原始間葉干細(xì)胞群(HTMSC)的分離、體外培養(yǎng)、制備及應(yīng)用方法，其特征在于以免疫的方法采用磁場(chǎng)去除成熟骨髓細(xì)胞，結(jié)合流式細(xì)胞儀分離體積大的人原始間葉干細(xì)胞群，經(jīng)體外含有較低血清濃度的優(yōu)化培養(yǎng)體系培養(yǎng)，誘導(dǎo)多向分化，迅速擴(kuò)增。人原始間葉干細(xì)胞群及基因修飾后的人原始間葉干細(xì)胞群廣泛應(yīng)用于人體臨床。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人原始間葉于細(xì)胞群，其特征在于可分化成成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、腱、骨髓基質(zhì)細(xì)胞、特別是平滑肌細(xì)胞、多種血管內(nèi)皮細(xì)胞等多種間葉組織的具有自我更新能力的人原始間葉干細(xì)胞群。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于提取人體骨髓細(xì)胞或臍帶血細(xì)胞離心，采用包被抗鼠免疫球蛋白M抗體的磁珠與鼠抗人CD45抗原、抗CD39抗體的單克隆抗體結(jié)合，在磁場(chǎng)槽中收集與磁珠分離的骨髓細(xì)胞，經(jīng)流式細(xì)胞儀分析，去除骨髓成熟細(xì)胞，收集大體積的人原始間葉干細(xì)胞群。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于對(duì)人原始間葉干細(xì)胞群采用含有低濃度小牛血清及地塞米松、BB血小板衍化生長(zhǎng)因子及內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、硒、轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素、亞油酸、白蛋白、抗壞血酸、抗霉菌素、青霉素、鏈霉素、二性要素B、F-12營(yíng)養(yǎng)混合物的較低血清濃度的優(yōu)化培養(yǎng)體系培養(yǎng)，可體外大量擴(kuò)增呈指數(shù)增殖，仍保持人間葉干細(xì)胞未分化原始狀態(tài)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于人原始間葉干細(xì)胞群在特定培養(yǎng)基中可迅速、均一誘導(dǎo)定向分化為多種間葉細(xì)胞①經(jīng)含地塞米松、抗壞血酸、β磷酸甘油及β轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子超家族蛋白、生長(zhǎng)因子等成分的培養(yǎng)體系培養(yǎng)分化為成骨細(xì)胞②經(jīng)含β轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子或抑制素A、軟骨刺激活性因子骨形成蛋白4等成分的培養(yǎng)體系培養(yǎng)分化為軟骨細(xì)胞。③經(jīng)含特異性細(xì)胞因子等誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)分化為基質(zhì)細(xì)胞④經(jīng)含地塞米松、1甲基3異丁黃嘌呤、胰島素及茚甲新培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)分化為脂肪細(xì)胞。⑤經(jīng)含人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子培養(yǎng)基培養(yǎng)分化為內(nèi)皮細(xì)胞。⑥經(jīng)含5-azacytidine培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化為肌細(xì)胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是以采用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，整合基因于人原始間葉干細(xì)胞群高效表達(dá)，采用內(nèi)核糖體啟始序列起始表達(dá)耐藥篩選基因以及采用最佳篩選基因熒光蛋白完成原始間葉干細(xì)胞基因修飾。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是以采用PCL-Ampho質(zhì)粒快速轉(zhuǎn)染系統(tǒng)與逆轉(zhuǎn)錄病毒載體共轉(zhuǎn)染293Kj細(xì)胞、采用VSV-G質(zhì)粒富集病毒系統(tǒng)，與病毒載體及PCL質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染以及采用包被轉(zhuǎn)孔培養(yǎng)器流式病毒轉(zhuǎn)染方法，以富集病毒上清與被轉(zhuǎn)染細(xì)胞共培養(yǎng)，制備含修飾基因的高滴度病毒上清及基因轉(zhuǎn)染人間葉干細(xì)胞。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是人原始間葉干細(xì)胞群及基因修飾后的人原始間葉干細(xì)胞群，廣泛應(yīng)用于人體臨床①基因修飾骨骼愈合。將具有誘導(dǎo)成骨細(xì)胞的基因克隆于IRES的上游MSCV-IRES-EGFP載體成為MSCV-X-IRES-EGFP載體，共轉(zhuǎn)染293Kj細(xì)胞，經(jīng)流式細(xì)胞儀分析、收集基因修飾的人間葉細(xì)胞并與填充物按比例容積混勻，注入骨缺失部分。②肌營(yíng)養(yǎng)原蛋白基因修飾改善肌營(yíng)養(yǎng)退行性變。將含MSCV-肌原蛋白-IRES-tyr22DHFR基因病毒上清轉(zhuǎn)導(dǎo)人原始間葉干細(xì)胞群在魚精蛋白低血清培養(yǎng)基共培養(yǎng)，經(jīng)甲氫葉酸含胎牛血清培養(yǎng)基篩選后，將表達(dá)該載體人間葉細(xì)胞注射肌營(yíng)養(yǎng)不良患處，糾正肌營(yíng)養(yǎng)不良。③基因治療基因缺陷性疾病。采用MSCV病員缺陷的人正?；?IRES-EGFP轉(zhuǎn)導(dǎo)人原始間葉干細(xì)胞群，篩選陽(yáng)性基因攜帶細(xì)胞，凍存，定量回輸血友病A、B系凝血因子Ⅷ、Ⅸ缺乏所致出血性疾病、粘多糖貯積病、囊性纖維變性等多種基因缺陷性疾病病員。較低水平表達(dá)可糾正基因缺陷、整合基因高水平表達(dá)無(wú)明顯副作用。④骨骼微環(huán)境重建及促造血基因。(1)采集病員骨髓，體外培養(yǎng)人原始間葉干細(xì)胞群，凍存，待病員放療、化療、骨髓移植后回輸病員，為放療、化療病員恢復(fù)提供最佳骨髓微環(huán)境。(2)克隆構(gòu)建表達(dá)人白介素3因子的病毒載體，轉(zhuǎn)導(dǎo)MSCV-白介素3-IRES-EGFP基因于人原始間葉干細(xì)胞群，回輸再障病員，治療再生障礙性貧血。(3)將含促紅細(xì)胞生成素的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)人原始間葉干細(xì)胞群，回輸病員，治療慢性疾病引起的貧血。⑤增強(qiáng)免疫、腫瘤疫苗。將含有α-干擾素基因的MSCV-α-干擾素-IRES-EGFP病毒基因轉(zhuǎn)導(dǎo)人原始間葉干細(xì)胞群，回輸病員，治療慢性粒細(xì)胞性白血病。采用上述同樣方式，可以γ-干擾素治療慢性粒細(xì)胞白血病、毛狀細(xì)胞白血病等。轉(zhuǎn)導(dǎo)白介素2、γ-干擾素治療全身轉(zhuǎn)移性腫瘤。
全文摘要
本發(fā)明公開一種人原始間葉干細(xì)胞群(HTMSC)的分離、體外培養(yǎng)、制備及應(yīng)用方法。采用抗人CD45抗原、抗CD39抗體免疫方法,經(jīng)磁場(chǎng)分離出人原始間葉干細(xì)胞群。在體外含有較低血清濃度的優(yōu)化培養(yǎng)體系培養(yǎng),誘導(dǎo)多向分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、腱、骨髓基質(zhì)細(xì)胞、特別是平滑肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等多種間葉組織具有自我更新能力的人原始間葉干細(xì)胞群?？裳杆贁U(kuò)增。人原始間葉干細(xì)胞群及基因修飾后的人原始間葉干細(xì)胞群廣泛應(yīng)用于人體臨床。
文檔編號(hào)C12N5/0789GK1287166SQ99117589
公開日2001年3月14日 申請(qǐng)日期1999年9月8日 優(yōu)先權(quán)日1999年9月8日
發(fā)明者何清華 申請(qǐng)人:何清華