專利名稱：一種干細(xì)胞分離液及其用于干細(xì)胞分離的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及干細(xì)胞分離和純化的領(lǐng)域，尤其是涉及一種干細(xì)胞分離液及其用于干細(xì)胞分離的方法。
背景技術(shù)：
美國Thomson和Gearhart兩實(shí)驗(yàn)室于1998年分別報道人體胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell，ES細(xì)胞)和胚胎生殖干細(xì)胞(Embryonic germ cell，EG細(xì)胞)建系成功，啟迪和激起人們對ES細(xì)胞及其定向分化的研究的熱情。這一科技成就將成為新近的最具發(fā)展和應(yīng)用前景的研究領(lǐng)域。近年來干細(xì)胞的研究使人們看到了新的希望。干細(xì)胞是正常人體內(nèi)存在的細(xì)胞群體，具有高度自我復(fù)制和高度的分化能力。隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)利用干細(xì)胞可再生各種組織器官，如肝臟、胰腺、神經(jīng)組織、骨骼、肌腱等。
ES細(xì)胞也稱多能干細(xì)胞，是從早期哺乳類動物胚胎或原始生殖細(xì)胞中分離的具有發(fā)育全能性的細(xì)胞系，ES細(xì)胞具有自我更新能力和高度增殖以及多向分化的潛能，可以定向誘導(dǎo)分化為幾乎所有種類的細(xì)胞，甚至可以形成復(fù)雜的組織和器官，其建系體外擴(kuò)增，定向誘導(dǎo)分化、調(diào)控機(jī)制、細(xì)胞性能、組織重構(gòu)等方面的研究將在發(fā)育生物學(xué)、細(xì)胞及組織的分化、基因功能、藥物開發(fā)、細(xì)胞治療和組織細(xì)胞替代治療等領(lǐng)域發(fā)揮重要作用，并將成為細(xì)胞組織和器官移植的新資源。
ES細(xì)胞具有潛在的醫(yī)學(xué)研究價值(1)它是基因功能研究的有效手段。ES細(xì)胞具有種系傳遞功能，根據(jù)同源基因重組的原理，可利用基因打靶技術(shù)進(jìn)行遺傳操作，實(shí)現(xiàn)動物基因組內(nèi)指定基因的失活或替代，可以研究人體重要基因的功能或在生物體內(nèi)特定部位表達(dá)重組的目的基因和蛋白質(zhì)藥物。(2)有可能成為今后細(xì)胞替代療法和組織，器官移植的最佳來源，ES細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化成各種有臨床應(yīng)用價值的組織細(xì)胞是目前最受人們關(guān)注的研究熱點(diǎn)。
目前，在干細(xì)胞領(lǐng)域研究最多和最清楚的仍是造血干細(xì)胞(hematopoieticstem cells，HSC)，HSC在基礎(chǔ)與臨床應(yīng)用研究現(xiàn)仍處干細(xì)胞的最前沿，并不斷為其它干細(xì)胞研究提供理論和實(shí)踐的指導(dǎo)和依據(jù)。
干細(xì)胞可分為長期亞群和短期亞群，長期亞群具有無限的自我更新能力，在個體中持續(xù)終生，短期亞群自我更新能力有限，如短期HSC的自我更新能力僅維持8周左右；根據(jù)分化功能不同，干細(xì)胞分為全能性干細(xì)胞、多能性干細(xì)胞和單能性干細(xì)胞，個體形成中最早的干細(xì)胞為全能性干細(xì)胞，包括受精卵及胚泡的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)。全能性干細(xì)胞進(jìn)一步形成原始的生殖干細(xì)胞及體干/祖細(xì)胞，并最終分化形成各種組織細(xì)胞。
骨髓移植，HSC細(xì)胞可以擴(kuò)增約100倍，盡管用飼養(yǎng)層細(xì)胞可以長期培養(yǎng)HSC細(xì)胞，但其擴(kuò)增能力同體內(nèi)相比是不可同日而語。因此，研究人員采用了一系列的方法而促進(jìn)體外增培養(yǎng)中HSC細(xì)胞擴(kuò)增或獲得永生細(xì)胞系，如信號途徑的基因干預(yù)，信號分子，轉(zhuǎn)錄分子等，但其結(jié)果卻不理想，要么擴(kuò)增不成功，要么導(dǎo)致類白血病的產(chǎn)生。
鑒于干細(xì)胞在體外擴(kuò)增的局限性和成瘤性，目前一般采用原代的干細(xì)胞進(jìn)行臨床試驗(yàn)。雖然胚胎干細(xì)胞更具有全能性，理論上可生成任何組織，容易分化為一些組織如心臟等，但胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化的細(xì)胞和組織若用于病人的細(xì)胞和組織替代性治療，相當(dāng)于異體移植，存在免疫排斥的問題，而且胚胎干細(xì)胞能否分化為腫瘤樣的組織，尚是個未知數(shù)。成體干細(xì)胞可取自于病人的自身組織如骨髓和外周血等，定向誘導(dǎo)分化后移植回給病人，不存在免疫排斥的問題。因此，成體干細(xì)胞在臨床應(yīng)用方面可能有更廣闊的前景。
因來源和分離的原因，現(xiàn)階段臨床應(yīng)用的干細(xì)胞主要有成人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和造血干細(xì)胞，人外周血干細(xì)胞，人胚胎來源的干細(xì)胞和臍帶血造血干細(xì)胞及胎盤或臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。按HSC來源分為骨髓移植(BMT)、外周血造血干細(xì)胞移植(PBSCT)、臍帶血干細(xì)胞移植、純化的CD34+細(xì)胞移植、胎肝HSCT。按免疫遺傳學(xué)分為異基因干細(xì)胞移植、同基因干細(xì)胞移植、自體干細(xì)胞移植。
目前，分離干細(xì)胞的方法主要有以下四種一、貼壁分離法。該法主要利用干細(xì)胞具有在塑料培養(yǎng)瓶中貼壁生長的特性將干細(xì)胞與其它細(xì)胞相分離，這種分離方法分離細(xì)胞有限，且干細(xì)胞極易分化，因而影響其臨床應(yīng)用價值。而且，分離得到的貼壁細(xì)胞中除了有干細(xì)胞外，同時含有貼壁的成纖維細(xì)胞，從形態(tài)上二者相似不易區(qū)分。
二、流式細(xì)胞分選法。該法是根據(jù)干細(xì)胞體積小、相對缺少顆粒的特性對其加以分離。
三、免疫磁珠法。該法是根據(jù)免疫學(xué)原理，利用包備有抗體的磁珠與干細(xì)胞表面的一些特殊標(biāo)志如CD34特異結(jié)合，通過一定強(qiáng)度磁場時被滯留而分選。
采用流式細(xì)胞分選法或免疫磁珠法分離得到的干細(xì)胞純度較大，但所獲細(xì)胞數(shù)量極少，且易造成細(xì)胞損傷，細(xì)胞存活率極低。
四、密度梯度離心法。該法是根據(jù)干細(xì)胞與其它細(xì)胞的密度不同，實(shí)驗(yàn)證明間質(zhì)干細(xì)胞位于低密度細(xì)胞層。所采用的常用梯度分離液有Percoll和Ficoll，F(xiàn)icoll法或Peroll法可有效地將造血干細(xì)胞從骨髓中分離出來，且純度較高，細(xì)胞存活好。但是，用Ficoll分離的細(xì)胞中?；煊衅渌募?xì)胞(如成纖維細(xì)胞、骨髓或血液中的非單個核細(xì)胞)。
上述方法多用于分離骨髓間質(zhì)干細(xì)胞，而目前的實(shí)驗(yàn)表明，用上述方法都無法從人類、鼠胎肝中有效地分離出肝干細(xì)胞。
我們在實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，用淋巴細(xì)胞分離液、Ficoll法或Peroll法無法從人類、鼠胎肝中有效地分離出肝干細(xì)胞，經(jīng)提高干細(xì)胞分離液的比重，可有效地分離出肝干細(xì)胞，并將其用于神經(jīng)干細(xì)胞和造血干細(xì)胞，也獲得了很好的效果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種干細(xì)胞分離液，可通過調(diào)整該分離液中組分的含量來提高分離液的比重，以達(dá)到分離特定的干細(xì)胞并提高干細(xì)胞數(shù)量和純度的目的。
本發(fā)明所述的一種干細(xì)胞分離液，按重量份數(shù)包括以下組分泛影葡胺0-10份，羥甲基纖維素 0-10份，氯化銫0-1.0份，聚蔗糖0-10份；由以下方法制備濃縮液將上述成分混合，加入0.01mol/L磷酸鹽緩沖液配成所述的干細(xì)胞分離液的濃縮液；由以下方法制備工作液將所述的濃縮液用0.01mol/L磷酸鹽緩沖液稀釋至所需的比重，比重范圍為1.080-1.120g/ml。
優(yōu)選的，所述的泛影葡胺為3份。
優(yōu)選的，所述的羥甲基纖維素為2份。
優(yōu)選的，所述的氯化銫為0.2份。
優(yōu)選的，所述的聚蔗糖為3份。
本發(fā)明所述的干細(xì)胞分離液采用泛影葡胺、羥甲基纖維素、氯化銫、聚蔗糖等能提高分離液比重的成分，可配成成型的干粉或液體，用于實(shí)驗(yàn)室操作或臨床干細(xì)胞的試驗(yàn)研究和臨床應(yīng)用。本發(fā)明所述的干細(xì)胞分離液可用于骨髓干細(xì)胞、肝干細(xì)胞、臍血干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞及相應(yīng)的人類或動物不同組織干細(xì)胞的分離純化。
本發(fā)明的另一目的是提供將所述的干細(xì)胞分離液用于干細(xì)胞分離的方法，其原理是根據(jù)干細(xì)胞與紅細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和成熟組織細(xì)胞的比重不同，通過提高干細(xì)胞分離液的比重來達(dá)到分離干細(xì)胞的目的。
本發(fā)明所述的干細(xì)胞分離液用于肝干細(xì)胞分離的方法，包括以下步驟A)鼠胚肝細(xì)胞的制備取12-14日齡的鼠胚，將肝臟剪碎，置0.06％IV型膠原酶溶液中，37℃下振蕩消化30分鐘；B)過濾，在0-4℃下以200r/min離心10分鐘，傾去上清液，用F12培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，得細(xì)胞懸液；C)按細(xì)胞懸液分離液體積比為1∶2的比例將細(xì)胞懸液加入到所述的干細(xì)胞分離液的最上層，于0-4℃下以1000r/min離心10分鐘；D)吸取第二層細(xì)胞，該層為肝干細(xì)胞層，用Hanks液洗細(xì)胞1-3次；E)0-4℃以1000r/min離心15分鐘，棄上清液；將細(xì)胞團(tuán)沉淀懸浮于培養(yǎng)液中，臺盼藍(lán)染色，計算活細(xì)胞率；F)用肝干細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)并進(jìn)行觀察和肝干細(xì)胞染色。
本發(fā)明所述的干細(xì)胞分離液用于哺乳動物骨髓干細(xì)胞分離的方法，包括以下步驟A)骨髓的采集按常規(guī)方法抽取哺乳動物骨髓；B)將骨髓加入磷酸鹽緩沖液PBS中輕勻，按細(xì)胞懸液∶分離液體積比為2∶1的比例將細(xì)胞懸液加入到所述的干細(xì)胞分離液中；
C)常溫離心機(jī)中以1500r/min進(jìn)行密度梯度離心15分鐘；D)小心吸取富含有核細(xì)胞的中間細(xì)胞層；E)將獲取的單個核細(xì)胞加入到含10％小牛血清的高糖DM EM培養(yǎng)基中，接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)中，在37℃、5％CO2孵育箱連續(xù)培養(yǎng)并適時觀察。
本發(fā)明所述的干細(xì)胞分離液用于人骨髓干細(xì)胞分離的方法，包括以下步驟A)骨髓的采集采集臨床志愿者髂骨內(nèi)骨髓，按臨床常規(guī)骨髓穿刺操作取得紅骨髓；B)將骨髓加入磷酸鹽緩沖液PBS中輕勻，按細(xì)胞懸液∶分離液體積比為2∶1的比例將細(xì)胞懸液加入到所述的干細(xì)胞分離液中，低溫離心機(jī)0-4℃以1500r/min進(jìn)行密度梯度離心15分鐘；C)小心吸取富含有核細(xì)胞的中間細(xì)胞層；D)將獲取的單個核細(xì)胞加入到含10％小牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中，接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)中，在37℃、5％CO2、飽和濕度孵育箱連續(xù)培養(yǎng)并適時觀察。
本發(fā)明所述的干細(xì)胞分離液用于臍血干細(xì)胞分離的方法，包括以下步驟A)按常規(guī)方法抽取健康足月順產(chǎn)新生兒臍帶血，按細(xì)胞懸液∶分離液體積比為1∶2的比例將細(xì)胞懸液緩慢加入所述的干細(xì)胞分離液中；B)常溫離心機(jī)20℃以2500r/min離心15分鐘；C)離心管中液體分為四層，吸取血清層和分離層之間的呈白色云霧狀的有核細(xì)胞層；D)以磷酸鹽緩沖液PBS洗滌，800r/min常溫離心4分鐘；E)棄上清，加入培養(yǎng)基充分吹打混勻制成單細(xì)胞懸液，接種至培養(yǎng)瓶，在37℃、5％CO2、飽和濕度孵箱中連續(xù)培養(yǎng)并適時觀察。
與現(xiàn)有的常規(guī)密度梯度離心方法相比，利用本發(fā)明所述的干細(xì)胞分離液，對于各種干細(xì)胞的分離效果均有明顯的提高，見以下實(shí)施例的具體分析。所得的干細(xì)胞可用于人類各種干細(xì)胞領(lǐng)域的技術(shù)研究和肝病、糖尿病、動脈粥樣硬化及心、腦疾病等各種相關(guān)疾病的治療。


圖1為用淋巴細(xì)胞分離液分離所得的細(xì)胞，40×10倍(顯微鏡下)；圖2為用干細(xì)胞分離液分離所得的細(xì)胞，40×10倍(顯微鏡下)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例一干細(xì)胞分離液的配制一、材料1、泛影葡胺(Sigma)、羥甲基纖維素(Sigma)、氯化銫(Sigma)、聚蔗糖(Ficoll400，phamacia)2、磷酸二氫鉀，氫氧化鈉(廣州化學(xué)試劑廠)3、比重計(1.000-1.100、1.100-1.200)二、方法稱取泛影葡胺3g、羥甲基纖維素2g、氯化銫0.2g、聚蔗糖3g。將上述組分依次加入100ml的量筒中，加0.01mol/L磷酸鹽緩沖液至100ml，即得干細(xì)胞分離液的濃縮液。用比重計測得其比重為1.123g/ml。
使用時，將上述干細(xì)胞分離液的濃縮液用0.01mol/L磷酸鹽緩沖液稀釋至所需的比重，即為工作液。
本實(shí)施例所用的上述原料，主要以最終比重為限量，至于各種的用于增加比重的添加原料如泛影葡胺、羥甲基纖維素、氯化銫、聚蔗糖等的比例可以不一樣。對各組份的具體比例也不加限定。通常，各組分的用量是一個范圍泛影葡胺0-10份，羥甲基纖維素0-10份，氯化銫0-1.0份，聚蔗糖0-10份。并且，對上述用于增加比重的原料也可不予以限定，還可增加其它原料(如淀粉、聚乙二醇等)用于增加比重。
本實(shí)施例所配制的干細(xì)胞分離液將用于以下各分離實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)。
實(shí)施例二鼠肝干細(xì)胞的分離本實(shí)施例利用實(shí)施例一所得的干細(xì)胞分離液。
一、材料1、孕12-14天的BALB/C小鼠。
2、進(jìn)口特級胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS，Gibco)、進(jìn)口FBS和國產(chǎn)新生小牛血清(newborn calf serum，NCS；由杭州四季青生物工程材料研究所提供)。DM EM/F12(sigma)，非必需氨基酸(×100，Gibco)，人堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF，10ug，Gibco)，β-巰基乙醇(β-Mercaptoethanol，β-ME；Nacalai Tesoue INC Kyota，Japan)，牛血清白蛋白(BSA)，伴白蛋白(Conalbumin，Sigma)。四氯化碳(carbontetrachloride，CCl4)、D-氨基半乳糖(D-galactosamine，D-Galn)。
3、肝干細(xì)胞培養(yǎng)基5％FBS(國產(chǎn)或進(jìn)口)，10％國產(chǎn)NCS，0.14mM的β-ME，40ng.ml-1伴白蛋白，10ng.ml-1的人bFGF，1％非必需氨基酸的DMEM/F12培養(yǎng)基。
4、快藍(lán)BB鹽(Fast blue BB salt，Sigma，Lot No 118H5081)和萘酚-AS-MX(Naphthol ASMX phosphate，Sigma，Lot No 20K5227)。
5、C34，OV6等的抗體及免疫組化檢測試劑盒，LSAB免疫組化檢測試劑盒。
6、淋巴細(xì)胞分離液(上海試劑二廠)，比重為1.076g/ml。
二、方法1、鼠胚肝細(xì)胞的制備取鼠胚(12-14日齡)，將肝臟剪碎，置0.06％IV型膠原酶溶液中，37℃下振蕩消化30分鐘。
2、過濾。在0-4℃下，以200r/min離心10分鐘。傾去上清液，用F12培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞。
3、將干細(xì)胞分離液濃縮液(實(shí)施例一)配成比重為1.120、1.096、1.091、1.086和1.080的肝干細(xì)胞離心液(工作液)，將2ml細(xì)胞懸液置于4ml肝干細(xì)胞分離液的最上層。同時于將2ml細(xì)胞懸液置于另一管4ml淋巴細(xì)胞分離液(比重為1.076)的最上層。0-4℃下，以1000r/min離心10分鐘。
4、小心吸取第二層細(xì)胞，該層為肝干細(xì)胞層。用Hanks洗細(xì)胞2次。細(xì)胞計數(shù)。
5、離心(1000r/min)，棄上清液。將細(xì)胞團(tuán)重懸浮于培養(yǎng)液中，臺盼藍(lán)染色，拒染細(xì)胞為活細(xì)胞，計算活細(xì)胞率。
6、將細(xì)胞用肝干細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋，細(xì)胞數(shù)為1×105個/ml，用Castar 24孔板進(jìn)行培養(yǎng)，內(nèi)置蓋玻片，用于堿性磷酸酶和C34、OV6等的免疫組化染色。
三、結(jié)果1、細(xì)胞生長情況觀察鼠胚肝細(xì)胞在肝干細(xì)胞培養(yǎng)液中能貼壁生長，約在第三天能長出干細(xì)胞團(tuán)。肝干細(xì)胞集落，細(xì)胞小，排列緊密，界限不清，集落呈團(tuán)狀或鳥巢狀生長。經(jīng)堿性磷酸酶和C34，OV6等的免疫組化染色證實(shí)為肝干細(xì)胞團(tuán)。
2、不同比重干細(xì)胞分離液所獲細(xì)胞數(shù)見表1。
表1不同比重干細(xì)胞分離液分離肝細(xì)胞所獲細(xì)胞數(shù)

結(jié)果顯示，比重為1.120的分離液所獲細(xì)胞數(shù)最多，經(jīng)細(xì)胞涂片、瑞氏染色和顯微鏡下觀察為淋巴細(xì)胞、肝細(xì)胞和部分紅細(xì)胞。
3、不同比重干細(xì)胞分離液所獲細(xì)胞在肝干細(xì)胞培養(yǎng)基中生成肝干細(xì)胞團(tuán)的數(shù)量見表2。
表2不同比重干細(xì)胞分離液所得細(xì)胞形成肝干細(xì)胞團(tuán)的數(shù)量

結(jié)果顯示，經(jīng)堿性磷酸酶和C34、OV6等的免疫組化染色證實(shí)，比重為1.120的分離液所獲肝干細(xì)胞團(tuán)數(shù)最多。
四、結(jié)論采用比重為1.081-1.120的干細(xì)胞分離液均可成功分離胎鼠肝中的肝干細(xì)胞，其中，比重為1.120的干細(xì)胞分離液的分離效果最好。
實(shí)施例三豬骨髓干細(xì)胞的分離本實(shí)施例利用實(shí)施例一所得的干細(xì)胞分離液。
一、材料1、設(shè)備超凈工作臺，水平離心機(jī)，倒置顯微鏡和普通顯微鏡。離心管和平衡天平，骨髓穿剌針和采血袋。流式細(xì)胞儀，干燥箱，手套和手術(shù)衣。
2、試劑泛影葡胺(Sigma公司)，羥甲基纖維素(Sigma公司)，氯化銫(Sigma公司)，聚蔗糖(Ficoll-400，Phamacia公司)，磷酸二氫鉀、氫氧化鈉(均為廣州化學(xué)試劑廠)，羅丹明123(Sigma公司)。
3、BD Procount progenitor Cell Enumeration Kit(BD公司，干細(xì)胞計數(shù)試劑盒，批號NO.340498)。
4、淋巴細(xì)胞分離液(上海試劑二廠)，比重為1.076g/ml。
5、細(xì)胞培養(yǎng)基含10％小牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司)。
6、實(shí)驗(yàn)用的試驗(yàn)豬均為雌性，體重10kg，由廣州市芳村屠宰場提供。
二、方法1、實(shí)驗(yàn)豬進(jìn)行骨髓抽取手術(shù)，其步驟如下按每公斤實(shí)驗(yàn)豬體重使用30mg/kg量的戊巴比妥鈉，對實(shí)驗(yàn)豬進(jìn)行腹腔麻醉，對所有手術(shù)器械進(jìn)行高壓滅菌，手術(shù)間紫外消毒，用電推剪將實(shí)驗(yàn)豬腿部體表的毛發(fā)剪去，用75wt％酒精對實(shí)驗(yàn)豬進(jìn)行體表消毒，鋪巾，利多卡因局部麻醉后抽取豬髂骨內(nèi)骨髓30ml。
2、骨髓成功抽取后按以下方法分離豬骨髓細(xì)胞將骨髓加入到磷酸鹽緩沖液(PBS)中輕勻，常溫離心機(jī)中以1500r/min離心15分鐘，棄上清，將沉淀物用磷酸鹽緩沖液(PBS)輕輕懸浮，得細(xì)胞懸液。
將干細(xì)胞分離液濃縮液(實(shí)施例一)配成比重為1.080、1.083、1.086、1.089和1.092的肝干細(xì)胞離心液(工作液)。
將細(xì)胞懸液按2∶1比例緩慢加入上述不同比重的干細(xì)胞分離液和淋巴細(xì)胞分離液(比重為1.076)中，20℃以2500r/min離心10分鐘。離心管中液體分為四層，小心吸取富含有核細(xì)胞的中間細(xì)胞層，以PBS洗滌，800r/min常溫離心4分鐘。細(xì)胞計數(shù)。胎盤藍(lán)染色，活細(xì)胞計數(shù)。瑞氏染色和有核細(xì)胞分析。
3、將獲取的細(xì)胞加入到特殊的DMEM培養(yǎng)基中，接種于50mL培養(yǎng)瓶內(nèi)中。在37℃飽和濕度條件下，5％CO2孵育箱中連續(xù)培養(yǎng)并適時觀察。
4、用羅丹明拒染實(shí)驗(yàn)鑒定豬骨髓干細(xì)胞羅丹明染色步驟如下新鮮分離的細(xì)胞以1×106接種在培養(yǎng)板上培養(yǎng)2小時，加入1μg羅丹明123，37℃孵育1小時后，用PBS洗去細(xì)胞外羅丹明123，流式細(xì)胞儀觀察羅丹明123在細(xì)胞內(nèi)的分布情況。
5、用干細(xì)胞計數(shù)試劑盒和流式細(xì)胞儀鑒定豬骨髓干細(xì)胞將新鮮分離的細(xì)胞加入Eppendoff管(106細(xì)胞/管)，以1500rpm轉(zhuǎn)速離心5分鐘，PBS洗1次，加入冷丙酮1ml，0-4℃固定8分鐘；離心，棄上清后加入一抗(CD34、CD45)，混勻后37℃反應(yīng)45分鐘，1500rpm轉(zhuǎn)速離心10分鐘，PBS洗3次，離心棄上清后加入帶二抗標(biāo)記的IgG，混勻后37℃反應(yīng)30分鐘，PBS洗滌兩次，離心后視沉淀物的量加入PBS，制備成細(xì)胞懸液，流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。
三、結(jié)果1、各種分離液所得細(xì)胞經(jīng)胎盤藍(lán)染色顯示，細(xì)胞存活率均達(dá)90％以上，均未顯示對豬骨髓細(xì)胞有毒性作用。細(xì)胞計數(shù)
計算公式

注本實(shí)驗(yàn)中，每離心管所加骨髓血量為5ml。
經(jīng)計算后細(xì)胞計數(shù)結(jié)果如表3所示表3干細(xì)胞分離液分離豬骨髓細(xì)胞所獲細(xì)胞數(shù)

管1為淋巴細(xì)胞分離液。
管2-6為本發(fā)明所述的干細(xì)胞分離液(配制方法見實(shí)施例一)。
結(jié)果顯示比重為1.092的干細(xì)胞分離液所得的細(xì)胞數(shù)比淋巴細(xì)胞分離液的細(xì)胞數(shù)多5倍。
2、用瑞氏染色法鑒定，淋巴細(xì)胞分離液獲得的細(xì)胞主要為淋巴細(xì)胞，細(xì)胞核較大(如圖1所示)，而用干細(xì)胞分離液分離所得細(xì)胞主要為干細(xì)胞，細(xì)胞小，如紅細(xì)胞大小，核染色深，胞質(zhì)很少(如圖2所示)。
3、羅丹明123拒染試驗(yàn)結(jié)果根據(jù)干細(xì)胞不主動吸收熒光染料羅丹明123的特點(diǎn)，可用羅丹明123拒染試驗(yàn)鑒定骨髓血中的干細(xì)胞。
用不同比重干細(xì)胞分離液分離豬骨髓細(xì)胞中羅丹明123拒染細(xì)胞的比例見表4。
表4干細(xì)胞分離液分離豬骨髓細(xì)胞羅丹明123拒染細(xì)胞比例


管1為淋巴細(xì)胞分離液。
管2-6為本發(fā)明所述的干細(xì)胞分離液(配制方法見實(shí)施例一)。
結(jié)果顯示用比重為1.092的干細(xì)胞分離液所得的羅丹明123拒染細(xì)胞比例為5.18％，而淋巴細(xì)胞分離液所得細(xì)胞羅丹明拒染細(xì)胞僅為0.43％。比重為1.092的干細(xì)胞分離液所得的羅丹明123拒染細(xì)胞數(shù)為淋巴細(xì)胞分離液所得細(xì)胞羅丹明拒染細(xì)胞的12倍。
4、用干細(xì)胞標(biāo)志試劑盒和流式細(xì)胞儀鑒定豬骨髓干細(xì)胞的結(jié)果干細(xì)胞標(biāo)志試劑盒主要用于鑒定骨髓造血干細(xì)胞，其中CD34用于標(biāo)志造血干細(xì)胞，CD45用于標(biāo)志淋巴細(xì)胞，PI主要用于標(biāo)志有核細(xì)胞。
經(jīng)流式細(xì)胞儀測定，經(jīng)干細(xì)胞分離液所得細(xì)胞懸液中CD34、CD45和有核細(xì)胞比例見表5。
表5干細(xì)胞分離液分離豬骨髓細(xì)胞各種標(biāo)志的細(xì)胞比例

管1為淋巴細(xì)胞分離液。
管2-3為本發(fā)明所述的干細(xì)胞分離液(配制方法見實(shí)施例一)。
結(jié)果提示用比重為1.086的干細(xì)胞分離液所得的CD34陽性細(xì)胞數(shù)比淋巴細(xì)胞分離液所得的CD34陽性數(shù)多12倍。
5、細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)1-7天，在相差顯微鏡觀察，結(jié)果如下新鮮分離的的骨髓單個核細(xì)胞呈圓球狀分散懸浮于培養(yǎng)液中，有少量造血細(xì)胞。換液去除非黏附細(xì)胞后，留下來的細(xì)胞的形態(tài)大多和骨髓基質(zhì)細(xì)胞接近，貼壁生長，呈梭形。非黏附細(xì)胞經(jīng)離心換液，繼續(xù)培養(yǎng)7天，可見成團(tuán)細(xì)胞生長。其中以干細(xì)胞分離液所得的細(xì)胞，細(xì)胞成團(tuán)生長活躍。
四、結(jié)論采用本發(fā)明所述的干細(xì)胞分離液(比重為1.081-1.092)均可成功分離豬骨髓干細(xì)胞。該干細(xì)胞分離液所得骨髓細(xì)胞數(shù)比淋巴細(xì)胞分離液多5倍，而CD34+細(xì)胞比例增加13.6倍，兩者相乘，干細(xì)胞分離液所得的干細(xì)胞數(shù)為淋巴細(xì)胞分離液所得干細(xì)胞數(shù)的80倍。說明該干細(xì)胞分離液能有效地分離和富集骨髓血中的干細(xì)胞。
實(shí)施例四干細(xì)胞分離液對骨髓干細(xì)胞分離回收率的影響本實(shí)施例測定干細(xì)胞分離液對骨髓血中有核細(xì)胞回收率。
本實(shí)施例利用實(shí)施例一所得的干細(xì)胞分離液。
一、材料1、設(shè)備超凈工作臺，水平離心機(jī)，普通顯微鏡。離心管，骨髓穿剌針和采血袋。
2、試劑泛影葡胺(Sigma公司)，羥甲基纖維素(Sigma公司)，氯化銫(Sigma公司)，聚蔗糖(Ficoll-400，Phamacia公司)，磷酸二氫鉀、氫氧化鈉(均為廣州化學(xué)試劑廠)。
3、淋巴細(xì)胞分離液(上海試劑二廠)，比重為1.076g/ml。
4、細(xì)胞培養(yǎng)基含10％小牛血清的高糖DM EM培養(yǎng)基(Gibco公司)。
5、實(shí)驗(yàn)用的試驗(yàn)豬為雌性，體重10kg，由廣州市芳村屠宰場提供。
二、方法1、實(shí)驗(yàn)豬進(jìn)行骨髓抽取手術(shù)，其步驟如下按每公斤實(shí)驗(yàn)豬體重使用30mg/kg量的戊巴比妥鈉，對實(shí)驗(yàn)豬進(jìn)行腹腔麻醉，對所有手術(shù)器械進(jìn)行高壓滅菌，手術(shù)間紫外消毒，用電推剪將實(shí)驗(yàn)豬腿部體表的毛發(fā)剪去，用75wt％酒精對實(shí)驗(yàn)豬進(jìn)行體表消毒，鋪巾，利多卡因局部麻醉后抽取豬髂骨內(nèi)骨髓30ml。
2、將骨髓血加入到磷酸鹽緩沖液(PBS)中輕勻，常溫離心機(jī)中以1500r/min離心1 5分鐘，棄上清，將沉淀物用磷酸鹽緩沖液(PBS)輕輕懸浮，細(xì)胞懸液按2∶1比例緩慢加入到比重為1.12的干細(xì)胞分離液中，20℃以2500r/min離心10分鐘。離心管中液體分為四層，小心吸取富含有核細(xì)胞的中間細(xì)胞層，以PBS洗滌，800r/min常溫離心4分鐘。
3、將沉淀物再用15ml磷酸鹽緩沖液(PBS)輕輕懸浮，細(xì)胞計數(shù)。將干細(xì)胞分離液濃縮液(實(shí)施例一)配成比重為1.080、1.083、1.086、1.089和1.092的肝干細(xì)胞離心液(工作液)。將細(xì)胞懸液按2∶1比例緩慢加入到上述不同比重的干細(xì)胞分離液和淋巴細(xì)胞分離液中，每管加細(xì)胞懸液2ml，20℃以1500r/min離心10分鐘后，用2mlPBS收集管底細(xì)胞，細(xì)胞計數(shù)，計算細(xì)胞損失率。瑞氏染色和有核細(xì)胞分析。
三、結(jié)果1、不同比重干細(xì)胞分離液對骨髓有核細(xì)胞回收率的影響(表6)回收率＝(懸液細(xì)胞數(shù)-管底細(xì)胞數(shù))/所加細(xì)胞懸液細(xì)胞數(shù)×100％表6干細(xì)胞分離液對豬骨髓細(xì)胞回收率的影響

管1為淋巴細(xì)胞分離液管2-6為本發(fā)明所述的干細(xì)胞分離液(配制方法見實(shí)施例一)2、管底細(xì)胞涂片檢查，主要為小核細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)隨干細(xì)胞分離液的比重增加而減少，至比重為1.089和1.092的干細(xì)胞分離液的管底有核細(xì)胞很少見。
四、結(jié)論采用本發(fā)明所述的干細(xì)胞分離液可有效地提高骨髓造血干細(xì)胞的回收率。
實(shí)施例五人骨髓干細(xì)胞的分離本實(shí)施例利用實(shí)施例一所得的干細(xì)胞分離液。
一、材料1、設(shè)備超凈工作臺，水平離心機(jī)，倒置顯微鏡和普通顯微鏡。離心管和平衡天平，骨髓穿剌針和采血袋。流式細(xì)胞儀，干燥箱，手套和手術(shù)衣。
2、試劑泛影葡胺(Sigma公司)，羥甲基纖維素(Sigma公司)，氯化銫(Sigma公司)，聚蔗糖(Ficoll-400，Phamacia公司)，磷酸二氫鉀、氫氧化鈉(均為廣州化學(xué)試劑廠)。
3、細(xì)胞培養(yǎng)基含10％小牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司)。
4、淋巴細(xì)胞分離液(上海試劑二廠)，比重為1.076g/ml。
二、方法1、采集臨床志愿者髂骨內(nèi)骨髓，按臨床常規(guī)骨髓穿刺操作每次取得紅骨髓200ml。
2、將20ml骨髓加入到磷酸鹽緩沖液(PBS)中輕勻，常溫離心機(jī)中以1500r/min進(jìn)行離心15分鐘，棄上清，將沉淀物用磷酸鹽緩沖液(PBS)輕輕懸浮，細(xì)胞懸液按2∶1比例緩慢加入到比重為1.089的干細(xì)胞分離液(配制方法見實(shí)施例一)和淋巴細(xì)胞分離液中，20℃以2500r/min離心10分鐘。離心管中液體分為四層，小心吸取富含有核細(xì)胞的中間細(xì)胞層，以PBS洗滌，800r/min常溫離心4分鐘。細(xì)胞計數(shù)。胎盤藍(lán)染色，活細(xì)胞計數(shù)。瑞氏染色和有核細(xì)胞分析。
3、用羅丹明拒染實(shí)驗(yàn)鑒定骨髓干細(xì)胞羅丹明染色步驟如下新鮮分離的細(xì)胞以1×106接種在培養(yǎng)板上培養(yǎng)2小時，加入1μg羅丹明123，37℃孵育1小時后，用PBS洗去細(xì)胞外羅丹明123，流式細(xì)胞儀觀察羅丹明123在細(xì)胞內(nèi)的分布情況。
三、結(jié)果1、各種分離液所得細(xì)胞經(jīng)胎盤藍(lán)染色顯示，細(xì)胞存活率均達(dá)90％以上，均未顯示對骨髓細(xì)胞有毒性作用。細(xì)胞計數(shù)計算公式

注本實(shí)驗(yàn)中，每離心管所加骨髓血量為5ml。
經(jīng)計算后細(xì)胞計數(shù)結(jié)果如表7所示表7干細(xì)胞分離液分離骨髓細(xì)胞所獲細(xì)胞數(shù)

管1為淋巴細(xì)胞分離液。
管2為本發(fā)明所述的干細(xì)胞分離液(配制方法見實(shí)施例一)。
結(jié)果顯示比重為1.089的干細(xì)胞分離液所得的細(xì)胞數(shù)比淋巴細(xì)胞分離液的細(xì)胞數(shù)多6倍。
2、用瑞氏染色法鑒定，淋巴細(xì)胞分離液獲得的細(xì)胞主要為淋巴細(xì)胞，細(xì)胞核較大，而用干細(xì)胞分離液分離所得細(xì)胞主要為干細(xì)胞，細(xì)胞小，如紅細(xì)胞大小，核染色深，胞質(zhì)很少。
3、羅丹明123拒染試驗(yàn)結(jié)果根據(jù)干細(xì)胞不主動吸收熒光染料羅丹明123的特點(diǎn)，可用羅丹明123拒染試驗(yàn)鑒定骨髓血中的干細(xì)胞。
用不同比重干細(xì)胞分離液分離骨髓細(xì)胞中羅丹明123拒染細(xì)胞的比例見表8。
表8骨髓細(xì)胞羅丹明123拒染細(xì)胞比例

管1為淋巴細(xì)胞分離液。
管2為本發(fā)明所述的干細(xì)胞分離液(配制方法見實(shí)施例一)。
結(jié)果顯示用比重為1.089的干細(xì)胞分離液所得的羅丹明123拒染細(xì)胞比例為3.62％，而淋巴細(xì)胞分離液所得細(xì)胞羅丹明拒染細(xì)胞僅為0.16％。比重為1.089的干細(xì)胞分離液所得的羅丹明123拒染細(xì)胞數(shù)為淋巴細(xì)胞分離液所得細(xì)胞羅丹明拒染細(xì)胞的22倍。
四、結(jié)論采用本發(fā)明所述的干細(xì)胞分離液(比重為1.089)可成功分離人骨髓干細(xì)胞。該干細(xì)胞分離液所得骨髓細(xì)胞數(shù)比淋巴細(xì)胞分離液多6倍，而羅丹明123拒染細(xì)胞比例增加20倍，兩者相乘，干細(xì)胞分離液所得的干細(xì)胞數(shù)為淋巴細(xì)胞分離液所得干細(xì)胞數(shù)的120倍。說明干細(xì)胞分離能有效地分離和富集人骨髓血中的干細(xì)胞。
實(shí)施例六人的臍血干細(xì)胞的分離本實(shí)施例利用實(shí)施例一所得的干細(xì)胞分離液。
一、材料1、設(shè)備超凈工作臺，水平離心機(jī)，倒置顯微鏡和普通顯微鏡。離心管和平衡天平，采血袋。
2、試劑泛影葡胺(Sigma公司)，羥甲基纖維素(Sigma公司)，氯化銫(Sigma公司)，聚蔗糖(Ficoll-400，phamacia公司)，磷酸二氫鉀、氫氧化鈉(均為廣州化學(xué)試劑廠)。
3、淋巴細(xì)胞分離液(上海試劑二廠)，比重為1.076g/ml。
4、細(xì)胞培養(yǎng)基含10％小牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司)。
二、方法采集健康足月順產(chǎn)新生兒臍帶血20ml。分別緩慢加入20ml淋巴細(xì)胞分離液和20ml自制的干細(xì)胞分離液(實(shí)施例一)之上，每管加10ml。20℃以1500r/min離心15分鐘，離心管中液體分為四層，吸取血清層和分離層之間的白色云霧狀有核細(xì)胞層。以PBS洗滌，800r/min常溫離心4分鐘，細(xì)胞計數(shù)。胎盤藍(lán)染色，活細(xì)胞計數(shù)。瑞氏染色和有核細(xì)胞分析。
三、結(jié)果兩種分離液所得細(xì)胞經(jīng)胎盤藍(lán)染色顯示，細(xì)胞存活率均達(dá)90％以上，均未顯示對細(xì)胞有毒性作用。細(xì)胞計數(shù)計算公式

注本實(shí)驗(yàn)中，每離心管所加骨髓血量為10ml。
經(jīng)計算后細(xì)胞計數(shù)結(jié)果如表9所示表9干細(xì)胞分離液分離臍帶血所獲細(xì)胞數(shù)

管1為淋巴細(xì)胞分離液。
管2為本發(fā)明所述的干細(xì)胞分離液(配制方法見實(shí)施例一)。
四、結(jié)論采用本發(fā)明所述的干細(xì)胞分離液(比重為1.083)均可成功分離臍帶血干細(xì)胞。該干細(xì)胞分離液所得臍帶血有核細(xì)胞數(shù)比淋巴細(xì)胞分離液多3倍。
權(quán)利要求
1.一種干細(xì)胞分離液，其特征在于，按重量份數(shù)包括以下組分泛影葡胺 0-10份，羥甲基纖維素 0-10份，氯化銫0-1.0份，聚蔗糖0-10份；由以下方法制備濃縮液將上述成分混合，加入0.01mol/L磷酸鹽緩沖液配成所述的干細(xì)胞分離液的濃縮液；由以下方法制備工作液將所述的濃縮液用0.01mol/L磷酸鹽緩沖液稀釋至所需的比重，比重范圍為1.080-1.120g/ml。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的干細(xì)胞分離液，其特征在于所述的泛影葡胺為3份。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的干細(xì)胞分離液，其特征在于所述的羥甲基纖維素為2份。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的干細(xì)胞分離液，其特征在于所述的氯化銫為0.2份。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的干細(xì)胞分離液，其特征在于所述的聚蔗糖為3份。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5之一所述的干細(xì)胞分離液，其特征在于所述的干細(xì)胞分離液配成成型的干粉。
7.如權(quán)利要求1所述的干細(xì)胞分離液用于肝干細(xì)胞分離的方法，其特征在于，包括以下步驟A)鼠胚肝細(xì)胞的制備取12-14日齡的鼠胚，將肝臟剪碎，置0.06％IV型膠原酶溶液中，37℃下振蕩消化30分鐘；B)過濾，在0-4℃下以200r/min離心10分鐘，傾去上清液，用F12培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，得細(xì)胞懸液；C)按細(xì)胞懸液∶分離液體積比為1∶2的比例將細(xì)胞懸液加入到所述的干細(xì)胞分離液的最上層，于0-4℃下以1000r/min離心10分鐘；D)吸取第二層細(xì)胞，該層為肝干細(xì)胞層，用Hanks液洗細(xì)胞1-3次；E)0-4℃以1000r/min離心15分鐘，棄上清液；將細(xì)胞團(tuán)沉淀懸浮于培養(yǎng)液中，臺盼藍(lán)染色，計算活細(xì)胞率；F)用肝干細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)并進(jìn)行觀察和肝干細(xì)胞染色。
8.如權(quán)利要求1所述的干細(xì)胞分離液用于哺乳動物骨髓干細(xì)胞分離的方法，其特征在于，包括以下步驟A)骨髓的采集按常規(guī)方法抽取哺乳動物骨髓；B)將骨髓加入磷酸鹽緩沖液PBS中輕勻，按細(xì)胞懸液∶分離液體積比為2∶1的比例將細(xì)胞懸液加入到所述的干細(xì)胞分離液中；C)常溫離心機(jī)中以1500r/min進(jìn)行密度梯度離心15分鐘；D)小心吸取富含有核細(xì)胞的中間細(xì)胞層；E)將獲取的單個核細(xì)胞加入到含10％小牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中，接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)中，在37℃、5％CO2孵育箱連續(xù)培養(yǎng)并適時觀察。
9.如權(quán)利要求1所述的干細(xì)胞分離液用于人骨髓干細(xì)胞分離的方法，其特征在于，包括以下步驟A)骨髓的采集采集臨床志愿者髂骨內(nèi)骨髓，按臨床常規(guī)骨髓穿刺操作取得紅骨髓；B)將骨髓加入磷酸鹽緩沖液PBS中輕勻，按細(xì)胞懸液∶分離液體積比為2∶1的比例將細(xì)胞懸液加入到所述的干細(xì)胞分離液中，低溫離心機(jī)0-4℃以1500r/min進(jìn)行密度梯度離心15分鐘；C)小心吸取富含有核細(xì)胞的中間細(xì)胞層；D)將獲取的單個核細(xì)胞加入到合10％小牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中，接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)中，在37℃、5％CO2、飽和濕度孵育箱連續(xù)培養(yǎng)并適時觀察。
10.如權(quán)利要求1所述的干細(xì)胞分離液用于臍血干細(xì)胞分離的方法，其特征在于，包括以下步驟A)按常規(guī)方法抽取健康足月順產(chǎn)新生兒臍帶血，按細(xì)胞懸液∶分離液體積比為1∶2的比例將細(xì)胞懸液緩慢加入所述的干細(xì)胞分離液中；B)常溫離心機(jī)20℃以2500r/min離心15分鐘；C)離心管中液體分為四層，吸取血清層和分離層之間的呈白色云霧狀的有核細(xì)胞層；D)以磷酸鹽緩沖液PBS洗滌，800r/min常溫離心4分鐘；E)棄上清，加入培養(yǎng)基充分吹打混勻制成單細(xì)胞懸液，接種至培養(yǎng)瓶，在37℃、5％CO2、飽和濕度孵箱中連續(xù)培養(yǎng)并適時觀察。
全文摘要
本發(fā)明涉及干細(xì)胞分離和純化的領(lǐng)域，尤其是涉及一種干細(xì)胞分離液及其用于干細(xì)胞分離的方法。本發(fā)明所述的一種干細(xì)胞分離液，按重量份數(shù)包括以下組分泛影葡胺0－10份，羥甲基纖維素0－10份，氯化銫0－1.0份，聚蔗糖0－10份；由以下方法制備濃縮液將上述成分混合，加入0.01mol/L磷酸鹽緩沖液配成所述的干細(xì)胞分離液的濃縮液；由以下方法制備工作液將所述的濃縮液用0.01mol/L磷酸鹽緩沖液稀釋至所需的比重，比重范圍為1.080－1.120g/ml。與現(xiàn)有的常規(guī)密度梯度離心方法相比，利用本發(fā)明所述的干細(xì)胞分離液，對于各種干細(xì)胞的分離效果均有明顯的提高。
文檔編號C12N5/08GK101089176SQ200610035900
公開日2007年12月19日 申請日期2006年6月12日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月12日
發(fā)明者鄒清雁, 孔祥平, 鄭業(yè)華, 楊聯(lián)萍, 劉惠平 申請人:中國人民解放軍第四五八醫(yī)院全軍肝病中心