專利名稱：新的可溶性補體受體i的糖型的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及可溶性補體受體1型(sCR1)的新的糖型(glycoform)，及其在補體活性相關(guān)疾病和各種炎性以及免疫性疾病的診斷和治療中的應(yīng)用。本發(fā)明也提供該糖型的生產(chǎn)，檢測和提純方法。
補體系統(tǒng)構(gòu)成正常血清中約10%球蛋白的補體系統(tǒng)由許多不同蛋白組成，這些蛋白在免疫系統(tǒng)對外來抗原的應(yīng)答方面是很重要的。當(dāng)補體系統(tǒng)的初級成份分裂，而分裂的碎片單獨的或者同其它蛋白一起激活另外的補體蛋白時，結(jié)果引起連鎖蛋白溶解反應(yīng)，于是便使補體系統(tǒng)激活。補體系統(tǒng)激活導(dǎo)致血管通透性增加，吞噬細(xì)胞趨化性、炎性細(xì)胞激活，外來顆粒受調(diào)理素影響，直接殺死細(xì)胞以及損傷組織。補體系統(tǒng)激活可由抗原-抗體復(fù)合物(經(jīng)典途徑)啟動，或者例如由病原體細(xì)菌細(xì)胞壁上存在的脂多糖引發(fā)(替代途徑)。
膜結(jié)合補體受體1型補體受體1型(CR1)存在于紅細(xì)胞、單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞，粒細(xì)胞、B細(xì)胞、某些T細(xì)胞、脾濾泡樹突細(xì)胞以及腎小球足狀突細(xì)胞的膜上。CR1可與補體成份C3b和C4b結(jié)合，并被稱之為C3b/C4b受體。CR1的結(jié)構(gòu)組織和初級序列是已知的(Klickstein 等人，1987，J.Exp.Med.165∶1095-1112;Klickstein等人，1988，J.Exp.Med.168∶1699-1717;Hourcade等人，1988，J.Exp.Med.168∶1255-1270)。它由含60-70個氨基酸的30個短的一致重復(fù)鏈(SCRs)組成，每個SCR中，平均65個氨基酸中的29個保持不變。推斷出各SCR均通過二硫鍵形成三維三環(huán)結(jié)構(gòu)，其中第3和第1半胱氨酸以及第4和第2半胱氨酸連于二硫鍵中。CR1進一步排列成各由7個SCRs組成的4個長的同源重復(fù)鏈(LHRs)。在引導(dǎo)序列(轉(zhuǎn)譯后除去)后，CR1分子由含C4b結(jié)合區(qū)的N-最末端LHR-A、含C3b結(jié)合區(qū)的兩個重復(fù)鍵LHR-B和LHR-C以及C最末端的LHRD組成，其后接有2個其它SCRs，一個是25殘基的推測橫跨膜區(qū)和一個是43殘基的細(xì)胞質(zhì)尾。
CR1系蛋白質(zhì)超科中一員，以該SCR同源性為特征。有C3/C4結(jié)合功能的某些超科成員包括CR2、C4結(jié)合蛋白、H因子、B因子和C2，而缺乏該功能的蛋白質(zhì)包括白細(xì)胞介素-2受體、β2-糖蛋白I、Clr，結(jié)合珠蛋白α鏈以及ⅩⅢb因子。
CR1被認(rèn)為是糖蛋白，其推斷氨基酸序列有用于胞外區(qū)N-連接糖基化作用(氨基酸一致序列NXS或NXT)的25個潛在位點。據(jù)載這些可利用的位點只有6-8個連接到低聚糖上(Sim，1985，Biochem.J.232∶883)。CR1的非糖基化形式于衣霉素存在下產(chǎn)生，表現(xiàn)出連接iC3能力降低(Lublin等人，1986，J.Biol.Chem.261∶5736)，看來糖蛋白N-末端被阻隔了。
目前為止，已鑒定出四種不同CR1等位基因型或異型，其大小上有30-50KDa增量之別。在人群中，這些異型的基因頻率各不相同(Holer 等人，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.USA84∶2459-2463)。F(或A)異型由4個LHR組成，其分子量約為250KDa;較大的S(或B)異型分子量約為290KDa，含有系LHR-B的5′半和LHR-A3′半嵌合體的第5LHR，預(yù)測它有第3個C3b連接位點(Wong等人，1989，J.Exp.Med.169∶847)。最小的F′(或C)異型(最大可能是由于LHR-B和一個C3b結(jié)合位點的缺失引起的)在全身性紅斑狼瘡(SLE)病人中含量增加(Van Dyne等人，1987，Clin.exp.Immunol.68∶570;Dykman 等人，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA80∶1698)。
可溶性補體受體1型天然出現(xiàn)的可溶性CR1在正常個體一和某些患SLE的個體的血漿中檢測出來(Yoon等人，1985，J.Immunol.134∶3332-3338)。其特征是結(jié)構(gòu)和功能上都與紅細(xì)胞(細(xì)胞表面)CR1相似。Hourcade等人(1988，J.Exp.Med.168∶1255-1270)也觀察到預(yù)料產(chǎn)生分泌形式CR1的人CR1轉(zhuǎn)錄單元中的其它聚腺苷酸化位點。由該平切序列編碼的mRNA含CR1的第一8.5SCRs，并且它編碼包括C4b結(jié)合區(qū)的約80KDa蛋白質(zhì)。當(dāng)相應(yīng)于上述平切序列的cDNA轉(zhuǎn)染于COS細(xì)胞并表達時，它表現(xiàn)出預(yù)料的C4b結(jié)合活性，但不結(jié)合C3b(Krych 等人，1989，F(xiàn)ASEB J.3∶A368)。Krych等人也在幾種人細(xì)胞系中觀察到相似于預(yù)期的一種mRNA，并假定這種具C4b結(jié)合活性的CR1平切可溶形式可以在人體中合成。
借助重組DNA方法，從正被表達的DNAs中消除橫跨膜區(qū)，已生成幾種可溶性CR1片斷(Fearon等人，Intl.Patent Publ.Wo89/09220，10/5/89;Fearon等人，Intl.Patent Publ.Wo91/05047，4/18/91)。該可溶性CR1片斷依據(jù)其所含的區(qū)而具有功能活性，可結(jié)合C3b和/或C4b、并表現(xiàn)出因子Ⅰ輔助因子活性。這樣的構(gòu)件于體外抑制補體激活所產(chǎn)生的后果，例如中性白細(xì)胞氧化破裂、補體介導(dǎo)血細(xì)胞溶解，以及C3a和C5a產(chǎn)生。一種可溶性構(gòu)件SCR1/pBSCR1C也表現(xiàn)出體內(nèi)逆轉(zhuǎn)被動局部過敏壞死反應(yīng)活性(Fearon 等人，1989，1991，前述文獻;Yeh 等人，1991，J.Immunol.146∶250)，也具抑制心肌缺血后感染及壞死活性(Fearon等人，上述文獻;Weisman等人，Science，1990，249∶146-151)，并且能提高移植后的成活率(Pruitt & Bollinger，1991，J.Surg.Res 50∶350;Pruitt等人，1991，Transplantation52;868)。此外，載體sCR1/pBSCRIC可溶性產(chǎn)物與對甲氧苯甲?；娜搜獫{酶原-鏈激酶-激活因子復(fù)合物(APSAC)的合劑也能產(chǎn)生與單用SCR1/pBSCR1C產(chǎn)物相似的抗溶血活性，這表明補體抑制劑sCR1與血栓溶解劑的組合是可行的(Fearon等人，同上)。
國際專利申請No.Wo89/09220(1989年10月5日公開)和No。WO91/05047(1991年4月18日公開)全文均引入本文作為參考。
本發(fā)明涉及新的可溶性補體受體1型蛋白(sCR1)的糖型以及它們在治療涉及補體活性的疾病和各種炎性以及免疫性疾病中的應(yīng)用。
本發(fā)明人已揭示，在一定生產(chǎn)條件下，可獲得sCR1的新的糖型，該糖型具有能延遲從血液中消除，而又保留其主要功能活性的所希望特性。此種長效半衰期使得便于簡單地團塊給藥及有助于發(fā)揮體內(nèi)效能。
本發(fā)明使用各種提純方法來溶解和富集特種sCR1糖型。因此本發(fā)明提供含一種或多種復(fù)合低聚糖結(jié)構(gòu)的可溶性補體受體1(sCR1)糖蛋白分子，該低聚糖結(jié)構(gòu)的一種或多種其末端帶有平均一個或多個唾液酸殘基。
在一個實施方案中，描述分子里含一種或多種復(fù)合低聚糖結(jié)構(gòu)的sCR1糖蛋白的制備，其中低聚糖結(jié)構(gòu)至少有40%平均含至少1個末端唾液酸殘基。優(yōu)選該分子含一種或多種復(fù)合低聚糖結(jié)構(gòu)，其中至少有70%平均含至少1個末端唾液酸殘基。
在一個實施方案中，一種sCR1制劑含有sCR1糖蛋白分子，其中占優(yōu)勢的糖型，經(jīng)色譜聚焦(chromatofocusing)法測定其等電點PI小于或等于5.1，而經(jīng)神經(jīng)氨酸苷酶處理后PI提高。
在另一實施方案中，一種sCR1制劑含有一種sCR1糖蛋白，其中唾液酸與甘露糖摩爾之比大于或等于0.25。
優(yōu)選的本發(fā)明sCR1制劑，具有至少25%的去糖基化sCR1的功能補體抑制活性。
優(yōu)選的本發(fā)明的分子或制劑的實施方案中，該sCR1糖蛋白的蛋白骨架含LHR-A、LHR-B、LHR-C、LHR-D、sCR29以及sCR30區(qū)，直達(和包括)橫跨膜區(qū)的第1丙氨酸殘基。
本發(fā)明也針對含有治療有效量的上述一種sCR1糖蛋白分子和一種藥物學(xué)上可接受載體或賦形劑的藥用組合物。在一個實施方案中，該藥用組合物還含有治療有效量的溶血栓劑。
優(yōu)選溶血栓選自如下藥劑組成的一類(a)血漿酶原激活劑或其突變蛋白;
(b)對甲氧苯甲酰化血漿酶原-鏈激酶激活劑復(fù)合物(APSAC);
(c)單鏈尿激酶;
(d)雙鏈尿激酶;
(e)鏈激酶;
(f)纖維蛋白溶解活性雜交蛋白，該蛋白包括第1雙鏈蛋白酶的一個鏈連于第2雙鏈蛋白酶的一個鏈上，所說第1和第2蛋白酶的至少一個有纖維蛋白溶解活性，因此，所說雜的交蛋白有作為纖維蛋白溶解活性之基礎(chǔ)的催化位點，它可以由能被除去的阻斷基團加以阻斷。
(g)在體內(nèi)可逆性阻隔的纖維蛋白溶解酶，其中作為所說酶的纖維蛋白溶解活性之基礎(chǔ)的催化位點由通過水解能除去的基團加以阻隔，其水解過程按在等滲水溶液中，PH7.4，37℃下以假一級水解速度常數(shù)在10-6sec-1至10-3sec-1的范圍內(nèi)的水解速度進行。
本發(fā)明也提供治療由炎癥或不適當(dāng)補體激活引起的疾病或失調(diào)的方法，包括給需要治療的患者施用上述治療有效量的sCR1藥物組合物。
本發(fā)明也提供治療血栓形成病態(tài)的方法，包括給需要此類治療的患者施用有效量的sCR1藥物組合物，或者優(yōu)選施用上述包括溶血栓劑的藥物組合物。
上述方法中，“患者”優(yōu)選人。
本發(fā)明進一步針對上述sCR1糖蛋白或sCR1制劑的制備方法，包括(a)在培養(yǎng)的哺乳動物宿主細(xì)胞中，表達編碼該sCR1蛋白骨架的DNA分子，該培養(yǎng)條件是細(xì)胞生長不受限于營養(yǎng)補充，且該宿主細(xì)胞能使低聚糖鏈唾液酸化(Sialylation)。
(b)從培養(yǎng)物中分離sCR1糖蛋白。
在優(yōu)選方案中，該方法進一步包括下述步驟(c)從步驟(b)所得物質(zhì)中分離出含唾液酸分子。
上述方法中，優(yōu)選培養(yǎng)條件包括一個流體化床生物反應(yīng)器，空心纖維生物反應(yīng)器，滾動瓶培養(yǎng)或攪拌罐生物反應(yīng)器體系，后兩體系帶有或不帶有細(xì)胞微載體。
上述細(xì)胞培養(yǎng)的sCR1糖蛋白產(chǎn)物可通過親和、體積排斥、離子交換或疏水相互作用色譜法來提純。為富集含唾液酸分子，優(yōu)選采用可收集更多酸級分的離子交換軟凝膠色譜或利用陽離子或者陰離子樹脂的HPPLC方法。含唾液酸分子也可通過色譜聚焦(chromatofocusing)或外源凝集素親和色譜來分離。
優(yōu)選哺乳動物宿主細(xì)胞系能表達唾液酸轉(zhuǎn)移酶者，其表達水平要能足以保證表達的sCR1糖蛋白中低聚糖的基本唾液酸化。適宜的宿主細(xì)胞包括CHO系，優(yōu)選DUX B11細(xì)胞系。
縮寫和定義APSAC＝甲氧苯甲?；难獫{酶原-鏈激酶激活劑復(fù)合物PI＝等電點HPLC＝高效液相色譜IH50%＝產(chǎn)生50%溶血抑制作用的濃度SRBC＝羊紅血細(xì)胞EIA＝酶免疫檢測W/V＝重量體積之比V/V＝體積與體積之比KDa＝千道爾頓ELISA＝酶聯(lián)免疫吸附檢測gu＝葡萄糖單元SDS-PAGE＝十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳glycoforms＝糖蛋白品種，例如本發(fā)明的可溶性CR1糖蛋白，以其碳水化合物成分，色譜表現(xiàn)和/或電荷為特征TP10HD＝一種特定可溶性CR1構(gòu)件，它含有LHR-A、LHR-B、LHR-C、LHR-D、SCR29、SCR30區(qū)直至(和包括)橫跨膜區(qū)的第一個丙氨酸殘基;TP10HD相當(dāng)于質(zhì)粒pBSCR1中的CR1編碼序列Fearon等人，Int′l Patent Publication No.WO 89/09220 1989年10月5日)
TP10HD-CC＝如本文所述由流體化床灌注生物反應(yīng)器中培養(yǎng)的細(xì)胞產(chǎn)生，并經(jīng)聯(lián)合色譜提純的.TP10HDTP10HD-CCW＝由制備型HPLC陽離子交換色譜分離的TP10HD-CC弱陽離子型TP10HD-CCS＝由制備型HPLC陽離子色譜分離的TP10HD-CC的強陽離子型TP10H-CX＝由空心纖維生物反應(yīng)器培養(yǎng)的細(xì)胞產(chǎn)生的，經(jīng)HPLC陽離子交換色譜提純的TP10HD(Fearon等人，同上)TP10HD-CXD＝以n-聚糖酶促除糖基化的TP10HD-CX附圖簡介

圖1是于280nm處的一系列吸收圖，表示以不同方法提純的TP10HD制劑的HPLC分析結(jié)果。修改的Hydropore-SCXHPLC純化法用于證明TP10HD糖型的存在。
其中A圖由親和色譜提純的TP10HD物質(zhì)，含有多種糖型，主要的糖型均為強陽離子型(即于約125mM NaCl洗脫)。
B圖由聯(lián)合色譜提純的TP10HD物質(zhì)，含多種糖型，弱陽離子糖型對強陽離子糖型濃度之比在70∶30至80∶20之間。
C圖由HPLC陽離子交換色譜提純的TP10HD，僅含強陽離子糖型。
圖2表示以50-250mM NaCl梯度液從S-瓊脂糖柱上洗脫T10HD剖面圖。表示出相應(yīng)于庫1和庫2的峰值，流速為2ml/分鐘，繪圖速度為0.25cm/min，在280nm滿刻度敏感度為0.2吸收單位。
圖3表示從圖2的S-瓊脂糖柱上洗脫的物質(zhì)的SDS-PAGE凝膠圖形。泳道1高分子量標(biāo)準(zhǔn)物;泳道5和8S-瓊脂糖庫1(各2.4μg);泳道6和9S-瓊脂糖庫2(分別5.0和6.7μg)。
圖4表示來自TP10HD-CCW(右邊一組)和來自TP10HD-CCS(左邊一組)的低聚糖鏈的四個放射電泳圖。其中下面兩圖表示經(jīng)唾液酸苷酶處理后的情況。
圖5表示來自TP10HD-CCS(A)和TP10HD-CCW(B)的低聚糖鏈的兩個色譜顯示尺寸及相對比例。
圖6表示TP10HD-CC(上)和TP10HD-CX(下)的色聚焦柱記錄圖。
本發(fā)明涉及可溶性補體受體1型蛋白(sCR1)的新糖型及其在診斷和治療補體活性相關(guān)疾病和各種炎性以及免疫性疾病中的應(yīng)用。
可溶性補體受體1(sCR1)在本文中定義為含所有30個胞外SCR區(qū)的可溶形式的人CR1。
sCR1及其制備方法曾公開于國際專利
發(fā)明者小·H·C·馬什, C·-J·G·葉, A·M·弗里曼, R·A·G·史密夫, J·里夫特, M·L·戈塞林 申請人:T細(xì)胞科學(xué)有限公司, 史密絲克萊恩比徹姆有限公司