專利名稱：可溶性β－淋巴毒素受體和抗淋巴毒素受體的抗體以及抗淋巴毒素配體的抗體的用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及包含封閉β-淋巴毒素受體信號傳導的“β-淋巴毒素受體封閉劑”的組合物和方法。β-淋巴毒素受體封閉劑可用于治療免疫性疾病，更具體地用于抑制抗體介導的免疫反應，調(diào)節(jié)地址素的表達和細胞運輸，以及影響小結(jié)樹突細胞的分化。本發(fā)明也涉及可溶形式的β-淋巴毒素受體胞外域，以及針對β-淋巴毒素受體或其配體、表面淋巴毒素產(chǎn)生的抗體，它們可作用為β-淋巴毒素受體的封閉劑。
背景技術：
獲得性免疫由兩部分組成，它們能夠聯(lián)合作用以達到清除抗原的共同目標，但它們受免疫系統(tǒng)的不同部分介導以達到不同的效果。獲得性免疫反應的一部分，體液免疫，主要是由B細胞和循環(huán)抗體介導。另一部分，被稱為細胞的或細胞介導免疫，由合成和釋放細胞因子以影響其它細胞的T細胞介導。
B細胞對大多數(shù)抗原應答活化和分化需要(1)B細胞通過它們抗原特異的受體、膜免疫球蛋白接受抗原信號，并且(2)B細胞接受來自活化T細胞的接觸依賴型和非依賴型信號。B細胞CD40受體與活化的T輔助細胞上表達的CD40配體的連接產(chǎn)生接觸依賴型共刺激信號。(Laman等，Crit.Rev.Immunol.,16，第59-108頁(1996)；Van Kooten和Banchereau，免疫學進展，61，第1-77頁(1996))。非接觸依賴型信號是由活化的T細胞合成和釋放的細胞因子介導的。接觸依賴型和非依賴型信號共同驅(qū)動B細胞分化為(1)記憶B細胞，當?shù)诙谓佑|抗原時，它將介導更快的反應，或(2)分泌抗體的漿細胞。漿細胞是B細胞的終末分化階段，合成和分泌抗體。
T輔助細胞(“Th”)在免疫系統(tǒng)中起多種作用。已表明免疫攻擊開始時由Th細胞釋放的細胞因子影響了隨后活化的免疫效應途徑。Th細胞的活化是通過其抗原特異的受體與呈現(xiàn)于抗原呈遞細胞(APCs)表面的多肽片段相互作用實現(xiàn)的，這些多肽片段是與主要組織相容性復合體Ⅱ類分子結(jié)合的經(jīng)加工后的外來抗原。反過來，活化的Th細胞分泌細胞因子(淋巴因子)以活化合適的免疫效應機制。
根據(jù)其細胞因子的分泌形式，Th細胞可分成三個亞群Tho,Th1和Th2(Fitch等，免疫學年鑒，11，第29-48頁(1993))。在小鼠中，未經(jīng)刺激的“天然”T輔助細胞合成IL-2。Th細胞的短期刺激可使Tho前體細胞合成包括IFN-α,IL-2,IL-4,IL-5和IL-10的多種細胞因子。Tho細胞的慢性刺激可使之分化成Th1或Th2細胞，于是細胞因子的表達形式發(fā)生了改變。某些細胞因子如IL-3,GM-CSF和TNF可由Th1和Th2細胞共同釋放。其它細胞因子只能由一種Th細胞亞群合成(Romagnani等，免疫學年鑒，12，第227-57頁(1994))。Th1細胞合成LT-α、IL-2和IFN-γ以活化巨噬細胞和與細胞免疫相關的炎癥反應并抵抗細胞內(nèi)感染。
Th2細胞合成細胞因子IL-4,IL-5,IL-6和IL-10以增加嗜酸性粒細胞和肥大細胞并促進B細胞的擴展和成熟。(Howard等，“T-細胞起源的細胞因子及其受體”，基礎免疫學，第3版；RavenPress,New york(1993))。Th2細胞也參與了產(chǎn)生B細胞記憶的產(chǎn)生、體細胞突變以及親和性成熟，并參與了調(diào)節(jié)從頭免疫球蛋白同種型轉(zhuǎn)換。例如，Th2細胞因子IL-4使活化的B細胞轉(zhuǎn)換成IgG1同時抑制其它同種型。IL-4也刺激Ⅰ型超敏反應中IgE的過量合成。Th2細胞因子IL-5誘導粘膜免疫中重要的IgA。
次級淋巴組織如淋巴結(jié)(LN)、脾和粘膜淋巴組織可有效地捕捉和富集外來物質(zhì)，因此是T和B淋巴細胞的抗原驅(qū)動活化和分化的主要部位。這些過程依賴于這些組織中細胞的多樣性和組成，提供了體液免疫反應諸多方面的框架如T/B細胞相互作用、生發(fā)中心(GC)形成、親和性成熟，免疫球蛋白類別轉(zhuǎn)換和細胞運輸(Klein,J.，免疫學，JohnWiley和Sons(1982))。還未完全弄清外周淋巴組織發(fā)育、結(jié)構(gòu)和功能維持的分子機制。
盡管次級淋巴組織的整體結(jié)構(gòu)明顯不同并且哺乳動物綱的不同種之間有差異，這些次級淋巴組織的精細結(jié)構(gòu)有些共同特征，如<1>抗原可接近性，<2>結(jié)構(gòu)特征保證抗原與淋巴細胞持續(xù)接觸，<3>T細胞富集區(qū)圍繞著B細胞，<4>B細胞富集的濾泡，<5>邊緣區(qū)型位點，<6>特化的內(nèi)皮細胞，以及<7>抗體合成位點，這一點將在下文進一步詳述。
次級淋巴組織可接觸到系統(tǒng)中的抗原。例如，抗原可通過竇狀血供應與脾接觸，通過輸入淋巴管與LN接觸，并可通過特化的上皮細胞運送到粘膜淋巴組織。
各種物種中的次級淋巴組織也有某些共同的結(jié)構(gòu)特征如小結(jié)樹突細胞(FDC)和交錯突細胞(IDC)，它們保證組織中淋巴細胞富集區(qū)域抗原的持續(xù)呈遞。
另一共同特征是T細胞富集區(qū)域圍繞著B細胞。T細胞富集區(qū)域包括，例如，脾臟白髓的動脈周圍淋巴鞘和LN的皮質(zhì)，它們包含大量的循環(huán)T細胞和IDC，繼而作為T和B細胞的附屬細胞。
另外，通常情況下，淋巴組織在脾的白髓和LN的皮質(zhì)內(nèi)有B細胞富集的初級和次級濾泡。這些淋巴組織中的次級濾泡也被稱為生發(fā)中心(GC)并且有一個濃密的FDC網(wǎng)絡以捕捉和呈遞抗原。
邊緣區(qū)型區(qū)域定義為鼠脾的組織學區(qū)域和人次級淋巴器官中較為彌散的位點。這些區(qū)域主要包括邊緣區(qū)巨噬細胞(MZM)、噬金屬性巨噬細胞(MM)、邊緣區(qū)B細胞和網(wǎng)狀細胞，但也可包括T細胞和樹突細胞(Kraal,Int.Rev.Cytol,132，第31-74頁(1992))。動脈血流入邊緣區(qū)域使抗原與這些細胞直接接觸并促進這個部位對抗原的細胞反應(Kraal,Int.Rev.Cytol.,132，第31-74頁(1992))。MZM的存在對于B細胞在脾白髓中的最佳運輸是必需的(Kraal,1992；Kraal等，免疫學，68，第227-232頁(1989))。
通常，血淋巴細胞通過特化的內(nèi)皮細胞進入次級淋巴組織，如淋巴結(jié)的微靜脈內(nèi)皮襯(毛細血管后微靜脈-HEV)和邊緣區(qū)樣結(jié)構(gòu)中的脾血竇狀隙的內(nèi)皮襯。這種內(nèi)皮細胞表達粘附分子和地址素，在細胞向次級淋巴組織的運輸中發(fā)揮作用。例如，外周淋巴結(jié)地址素(PNAd)與粘膜淋巴結(jié)地址素、MAdCAM-1不同，參與了淋巴細胞向粘膜淋巴組織包括腸系膜淋巴結(jié)、淋巴集結(jié)以及固有層的運輸。
并非所有的地址素都得到清楚地鑒定，例如將淋巴細胞定位于脾臟的地址素仍未得到鑒定。地址素的重量作用包括促進合適的抗原特異的淋巴細胞參與到免疫反應中，以及隨后的免疫反應在整個身體內(nèi)的傳播。
最后，可在與由抗原活化的前體B不同的部位檢測到產(chǎn)生抗體的漿細胞。例如，脾紅髓內(nèi)由漿細胞產(chǎn)生的抗體源自T細胞區(qū)B細胞的活化，淋巴結(jié)髓質(zhì)的漿細胞起源于同一節(jié)內(nèi)T細胞區(qū)內(nèi)活化的B細胞。同樣，骨髓內(nèi)漿細胞產(chǎn)生的抗體是脾和淋巴結(jié)內(nèi)活化的B細胞的衍生物，腸道固有層的漿細胞主要來源于腸系膜淋巴結(jié)或腸道淋巴組織內(nèi)活化的B細胞。
見例如，ICM Maclennan，“次級淋巴組織的結(jié)構(gòu)和功能”ClinicalAspects of Immunology第五版，P.J.Lachman,Sir D.K.Peters,F.S.Rosen,M.J.Walport，編，Blackwell Scientific Publications第13-30頁(1993)。
總的來說，對T依賴型抗原的體液免疫反應的細胞/組織事件如下(Toellner，等，實驗醫(yī)學雜志，183，第2303-2312頁(1996))在誘發(fā)期，抗原進入身體的最初幾天，天然B和T細胞被活化并參加到免疫反應中。在脾臟中，例如，在二次反應免疫后的12小時內(nèi)，記憶B細胞在邊緣區(qū)遇到來自血液的抗原然后離開邊緣區(qū)進入T細胞區(qū)。24小時內(nèi)可在T細胞區(qū)檢測到B細胞。在第二次接觸抗原后12小時內(nèi)可檢測到免疫球蛋白轉(zhuǎn)換轉(zhuǎn)錄子，這表明已經(jīng)發(fā)生了T-B細胞相互作用。然后B細胞轉(zhuǎn)移至出口區(qū)和紅髓內(nèi)增殖以形成B細胞母細胞并分化成漿細胞。B細胞也在IDC豐富的T細胞區(qū)繼續(xù)增殖。免疫后的4天內(nèi)，在生發(fā)中心增殖后，B記憶細胞形成開始。在初次應答中，發(fā)育好的生發(fā)中心在免疫后第10天比較明顯，14天時達到最大。
免疫后48-72小時，T細胞區(qū)內(nèi)T細胞增殖明顯，7天時達到高峰。T細胞的增殖歸因于T細胞依賴的B細胞的活化。隨著生發(fā)中心形成，T細胞區(qū)的增殖水平下降。T細胞也在生發(fā)中心增殖，同時，暗區(qū)的中心細胞(centrocytes)(B細胞)從IDC獲取抗原并將抗原呈遞至明區(qū)的T細胞。
T細胞依賴的抗原能夠活化邊緣區(qū)B細胞，地址素和粘附分子能夠?qū)⑿庐a(chǎn)生的天然B細胞和再循環(huán)淋巴細胞吸引至并保留在次級淋巴器官。天然B細胞與活化的B細胞在到達T細胞等方面具同樣的動力學。T細胞依賴的反應建成期次級淋巴器官濾泡中記憶B細胞的持續(xù)活化維持T細胞依賴反應的建成期。在這個階段幾乎沒有天然B細胞的加入，這時的反應主要是由保留于FDC上的抗原推動。生發(fā)中心對于產(chǎn)生最佳記憶、同種型轉(zhuǎn)換、體細胞突變以及免疫球蛋白的親和性成熟是必需的。
淋巴細胞反應的封固產(chǎn)生能夠以多種途徑在體內(nèi)循環(huán)的抗體，例如，抗體通過血液離開脾臟，通過輸出淋巴管離開淋巴結(jié)?？贵w由此遇到并與入侵的病原體結(jié)合。這種識別事件引發(fā)了一系列免疫效應機制，包括補體級聯(lián)的活化以及針對病原體對宿主進行間接保護的細胞反應。
抗體在某些病理反應中也起一定的作用，如超敏反應-與原來接觸過的抗原接觸后引發(fā)的不適當?shù)幕虿幌喾Q的免疫反應。超敏反應有四種類型。
Ⅰ型“即發(fā)型超敏反應”涉及過敏原誘發(fā)的Th2細胞活化以及Th2細胞因子釋放。Th2細胞因子IL-4刺激B細胞進行同種型轉(zhuǎn)換以產(chǎn)生IgE，繼而活化肥大細胞以產(chǎn)生急性炎癥反應從而導致濕疹、哮喘和鼻炎。
Ⅱ型和Ⅲ型超敏反應是由，針對細胞表面抗原或特異的組織抗原(Ⅱ型)或形成循環(huán)免疫復合物的可溶性血清抗原(Ⅲ型)產(chǎn)生的IgG和IgM引起的。
Ⅳ型“遲發(fā)性”超敏反應(DTH)是由Th1細胞介導的反應并可通過Th1細胞的轉(zhuǎn)移在小鼠間轉(zhuǎn)移，但不能僅通過轉(zhuǎn)移血清實現(xiàn)轉(zhuǎn)移。這一特征可將Ⅳ型超敏反應與其它三類超敏反應區(qū)分開，后者需要主要由抗體引起的體液免疫反應并可通過無細胞血清轉(zhuǎn)移。(Roitt等，免疫學，第19.1-22.12頁(Mosby-Year Book Europe Ltd，第三版1993))。
病理體液免疫反應與多種器官特異的和系統(tǒng)自身免疫條件有關，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡，韋格內(nèi)氏肉芽腫病，結(jié)節(jié)性多動脈炎(PAN)，快速進行性新月形腎小球型腎炎和自發(fā)性血小板減少紫癜，以及慢性炎癥疾病如突眼性甲狀腺腫和南美洲錐蟲病。體液免疫反應也參與移植組織和移植器官的排斥。
目前，利用免疫調(diào)節(jié)劑和免疫抑制劑治療多種免疫疾病。通常使用的三種免疫抑制劑是類固醇，環(huán)磷酰胺和咪唑硫嘌呤。
類固醇是多效抗炎劑，它可逆轉(zhuǎn)許多病理T細胞效應以抑制活化的巨噬細胞和抗原呈遞細胞的活性。環(huán)磷酰胺是烷化劑，通過抑制DNA復制和修復介導細胞死亡。咪唑硫嘌呤是抗增殖劑，可抑制DNA合成。這些非特異性免疫抑制劑需要的用量高因此增加了毒性(如腎和肝毒性)并帶來副作用。因此它們不適于長期治療。
由此，需要其它的試劑和治療方法以克服由常規(guī)治療帶來的問題。
發(fā)明概述本發(fā)明通過提供用于治療免疫疾病的藥物組合物和方法來解決上述問題，其中使用β-淋巴毒素受體封閉劑抑制β-淋巴毒素受體(LT-β-R)信號傳導。更詳細地說，此組合物和方法包含LT-β-R封閉劑，它可有效抑制抗體介導的免疫反應，調(diào)節(jié)地址素表達水平和細胞運輸，影響小結(jié)樹突細胞分化以及改變病理條件如系統(tǒng)性紅斑狼瘡和自發(fā)性血小板減少紫癜時產(chǎn)生的次級淋巴組織和相似淋巴結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)組成。另外，在某些實施方案中，本發(fā)明可用于改變免疫復合物和B細胞的結(jié)合性。更具體地，本發(fā)明的方法可阻止抗原在細胞上的呈遞或沉積，或換言之，基本上溶解或清除已在細胞上呈遞的抗原。
在另一實施方案中，LT-β-R封閉劑選自由可溶性淋巴毒素-β-R、直接針對LT-β-R產(chǎn)生的抗體和針對表面LT配體產(chǎn)生的抗體組成的群體。
在一個實施方案中，提供可溶形式的淋巴毒素-β受體胞外結(jié)構(gòu)域作為LT-β-R封閉劑。此實施方案的優(yōu)選組合物和方法包含的，具有與免疫球蛋白恒定區(qū)重鏈區(qū)域融合的LT-β-R胞外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的重組淋巴毒素-β受體融合蛋白。更優(yōu)選地，LT-β-R配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域與人的IgG Fc區(qū)域融合。
在本發(fā)明的另一實施方案中，提供了作為LT-β-R封閉劑的抗體。此實施方案的優(yōu)選組合物和方法包含一個或多個針對β-淋巴毒素受體產(chǎn)生的抗體。更優(yōu)選地，此抗體為單克隆抗體。此實施方案的其它優(yōu)選組合物和方法包含一個或多個針對表面淋巴毒素產(chǎn)生的抗體。更優(yōu)選地，此抗體是針對β-淋巴毒素產(chǎn)生的單克隆抗體。優(yōu)選的抗體包括抗人BT-β-RmAb BDA8和抗人LT-βmAb B9。
在其它實施方案中，本發(fā)明涉及通過施用含有治療有效劑量的LT-β-R封閉劑的藥物組合物以改變動物體液免疫反應的方法。在某些其它實施方案中，藥物組合物以足夠包被LT-β-R陽性細胞的劑量施用1-14天。此藥物組合物可在某些實施方案中進一步包含藥學上可接受的載體或佐劑。
在其它實施方案中，本發(fā)明的方法使用上述LT-β-R封閉劑抑制LT-β-R信號而不抑制TNF-R信號。治療、預防或消除哺乳動物中人免疫缺陷病毒的方法也包含在本發(fā)明中，包括單獨或與藥物載體、佐劑或其它本領域技術人員已知的用于治療或減輕HIV或AIDS的藥物結(jié)合使用LT-β-R封閉劑。
另外，本發(fā)明涉及移植領域，即移植排斥的治療方法。具體地，某些實施方案涉及了CD40途徑的封閉劑與LT途徑封閉劑的聯(lián)合使用。
附圖簡述

圖1是編碼人LTβ受體胞外區(qū)，即配體結(jié)合區(qū)域的序列。
圖2是對接受了LT-R-Ig或LFA-3-Ig融合蛋白和抗原多次注射后的小鼠脾的免疫組織化學分析。
圖3是免疫組織化學分析，表明LT-R-Ig處理以及MR-1(抗CD40配體的抗體)處理的小鼠脾中缺乏生發(fā)中心，并且MR-1而不是LT-β-R-Ig處理的小鼠脾中出現(xiàn)小結(jié)樹突細胞。以圖2中描述的方法注射融合蛋白和SRBC抗原。
圖4是免疫組織化學分析，表示了以LT-β-R-Ig連續(xù)處理子宮內(nèi)及出生后的小鼠淋巴結(jié)中地址素表達的改變。
圖5是對以LT-β-R-Ig連續(xù)處理子宮內(nèi)及出生后的小鼠(同圖4)的腸系膜淋巴結(jié)中淋巴細胞定位及巨噬細胞標記表達的免疫組織化學分析。
圖6是免疫組織化學分析，表示了用LT-β-R-Ig處理小鼠抑制了針對SRBC的抗體反應。
圖7表示了捕捉于FDC上的免疫復合物。
發(fā)明詳述為了使在此所述的發(fā)明被完全理解，先進行以下詳細的描述。
此處所用的術語“免疫球蛋白應答”或“體液應答”指動物對外來抗原的免疫應答，由此動物產(chǎn)生針對外來抗原的抗體。T輔助細胞中的Th2類對于有效產(chǎn)生高親和性的抗體是重要的。
此處所用的術語“生發(fā)中心”指抗原免疫后形成的次級B細胞濾泡。這個組織位點與抗體反應中產(chǎn)生最佳記憶，型別轉(zhuǎn)換，體細胞超突變及親和性成熟相關。
術語“邊緣區(qū)”或“邊緣-區(qū)型區(qū)域”指組織學上描述的次級淋巴組織的部分，主要包括邊緣區(qū)巨噬細胞(MZM)，嗜金屬巨噬細胞(MM)，邊緣區(qū)B細胞和網(wǎng)狀細胞，以及T細胞和樹突細胞。動脈血流開口于邊緣竇從而使抗原與這些細胞直接接觸以促進此位點針對抗原的細胞反應。
此處所用的術語“地址素”指參與淋巴細胞定位于次級淋巴器官的分子。這樣的分子表達于內(nèi)皮細胞，尤其是淋巴結(jié)中的毛細血管后微靜脈。脾地址素還未確定。MAdCAM-1是粘膜地址素，PNAd是外周地址素。
此處所用的術語“T輔助(Th)細胞”指T細胞的功能性亞類，它有助于產(chǎn)生細胞毒性T細胞并與B細胞合作以刺激產(chǎn)生抗體。輔助T細胞與Ⅱ類主要組織相容性復合物聯(lián)合識別抗原并向效應細胞提供接觸依賴型或非接觸依賴型(細胞因子)信號。
此處所用的術語“細胞因子”，指在細胞間傳遞信號的分子。“淋巴因子”指由淋巴細胞釋放的細胞因子。
術語“Th2”指T輔助細胞的一個亞類，它產(chǎn)生LTα,γ干擾素和IL-2(及其它細胞因子)；它與細胞即非免疫球蛋白應答聯(lián)合引發(fā)針對攻擊的炎癥反應。
術語“Th2”指T輔助細胞的一個亞類，它產(chǎn)生細胞因子，如IL-4,IL-5,IL-6和IL-10從而與針對攻擊的免疫球蛋白(體液)應答聯(lián)合作用。
術語抗體的“Fc區(qū)域”指分子的一部分，包括絞鏈區(qū)，CH2和CH3區(qū)，但缺少抗原結(jié)合位點。此術語也包括IgM或其它抗體同種型的相應區(qū)域。
術語“抗LTβ受體的抗體”指能夠與LTβ受體的至少一個表位特異結(jié)合的任何抗體。
術語“抗LT的抗體”指能夠與LTα,LTβ或LTα/β復合物的至少一個表位特異結(jié)合的任何抗體。
術語“LTβ-R信號傳導”指與LTβ-R途徑相關的分子反應以及由此產(chǎn)生的隨后的分子反應。
術語“LTβ-R封閉劑”指一種因子，它可減少配體與LTβ-R結(jié)合、細胞表面LTβ-R成簇或LTβ-R信號傳導，或能夠影響LTβ-R信號在細胞內(nèi)的解釋。
在配體-受體結(jié)合步驟起作用的LTβ-R封閉劑能抑制配體與LTβ-R的結(jié)合至少20％。Tβ-R封閉劑的例子包括可溶性LTβ-R-Fc分子及抗LTα、LTβ、LTα/β和LTβ-R的抗體。優(yōu)選地，這些抗體不與分泌形式的LTα發(fā)生交叉反應。
術語“LTβ-R生物學活性”指1)LTβ-R分子或其衍生物與可溶的或表面LTβ-R分子競爭與可溶的或表面LT配體結(jié)合的能力；或2)天然LTβ活性如刺激免疫調(diào)節(jié)應答或細胞毒性活性的能力。
術語“LT配體”指能夠與LTβ受體特異性結(jié)合的LTα/β異源復合物或其衍生物。
術語“LTβ-R配體結(jié)合區(qū)域”指參與特異地識別并與LT配體相互作用的LTβ-R部分。
術語“表面LT”和“表面LT復合物”指包含LTα和展示于細胞表面的膜結(jié)合的LTβ亞單位-包括突變、改變的以及一個或多個亞單位的嵌合形式-的復合物?！氨砻鎀配體”指能夠與LTβ受體特異結(jié)合的表面LT復合物或其衍生物。
術語“受試者”指動物或來自動物的一個或多個細胞。優(yōu)選地，此動物是哺乳動物。細胞可以任何形式出現(xiàn)，包括但不限于保留于組織中的細胞，細胞簇，固定的、轉(zhuǎn)染的或未轉(zhuǎn)染的細胞，以及來自生理或表型改變的動物的細胞。β淋巴毒素TNF家族的成員腫瘤壞死因子(TNF)相關的細胞因子是宿主防御和免疫調(diào)節(jié)的大家族。此家族的成員可以膜結(jié)合形式通過細胞-細胞接觸局部作用，或以分泌蛋白的形式對遠距離目標起作用。TNF相關受體的平行家族與這些細胞因子反應從而引發(fā)包括細胞死亡、細胞增殖、組織分化和促炎反應在內(nèi)的多種途徑。
TNF,α-淋巴毒素(LTα，也稱作TNFβ)和β-淋巴毒素(LTβ)是TNF配體家族的成員，此家族也包括Fas,CD27,CD30,CD40,OX-40和4-1BB受體的配體(Smith等，細胞，76，第959-62頁(1994))。TNF家族幾個成員-包括TNF,LTα,LTβ和Fas-的信號傳導能夠通過壞死或凋亡(程序細胞死亡)誘導腫瘤細胞死亡。在非致瘤細胞中，TNF和許多TNF家庭配體-受體相互作用影響免疫系統(tǒng)發(fā)育和對多種免疫攻擊的應答。
多數(shù)膜相關的LTα/β復合物(“表面LT”)具有LTα1/β2化學計量。(Browning等，細胞，72，第847-56頁(1993)；Browning等，免疫學雜志，154第33-46頁(1995))。表面LT配體不與TNF-R以高親和力結(jié)合也不活化TNF-R信號通路。LTβ受體(LTβ-R)并不以高親和力與這些表面淋巴毒素復合物結(jié)合(Crone等，科學，264，第707-10頁(1994))。
LTβ-R信號傳導與TNF-R信號傳導一樣，具抗增殖效應并對腫瘤細胞有毒性。在申請人共同未決的美國申請序號08/378,968中，公開了用LTβ-R活化因子選擇性地刺激LTβ-R的組合物和方法。LTβ-R活化因子可用于抑制腫瘤細胞生長，而不同時活化TNF-R誘導的促炎癥或免疫調(diào)節(jié)途徑。
最近的基因打靶研究證明LTα/β在次級淋巴器官發(fā)育中起作用(Banks等，免疫學雜志，155，第1685-1693頁(1995)；De Togni等，科學，264，第703-706頁(1994))。的確，缺失LTα的小鼠缺失淋巴結(jié)(LN)和淋巴集結(jié)(PP)。而且，其脾結(jié)構(gòu)遭到破壞，脾邊緣區(qū)細胞上功能標記的表達也改變了(Banks等，1995；De Togni等，科學，264，第703-706頁(1994),Matsumoto等，科學，271，第1289-1291頁(1996))。TNF受體敲除小鼠中未發(fā)現(xiàn)這些特征的任何一個(Erickson等，自然372，第560-563頁(1994)；Pfeffer等，細胞，73，第457-467頁(1993)；Rothe等，自然，364，第798-802頁(1993))。申請人通過表明在懷孕期間注射與人IgG1Fc部分融合的可溶形式的鼠LTβ-R(LTβ-R-Ig)產(chǎn)生的子代小鼠缺乏大部分的淋巴結(jié)并有破壞的脾結(jié)構(gòu)，從而確定了膜LTα/β復合物在次級淋巴器官發(fā)育中的作用(Rennert等，1996，“表面淋巴毒素α/β復合物是周圍淋巴器官發(fā)育所必需的”實驗醫(yī)學雜志，184,1999-2006)。在另一個研究中，含有相似LTβ-R-Ig構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因小鼠在出生后三天開始表達LTβ-R-Ig，表明具有LN。然而，其脾結(jié)構(gòu)遭到破壞并且脾邊緣區(qū)細胞的幾個標記未得到表達。(Ettinger等，“表達可溶性LTβ-R/IgG1融合蛋白的小鼠中脾結(jié)構(gòu)被破壞而淋巴結(jié)發(fā)育正?！泵绹鴩铱茖W院院報93:13102-7)。這些數(shù)據(jù)綜合表明膜LT對次級淋巴器官發(fā)育的調(diào)節(jié)效應有時間要求，但對脾結(jié)構(gòu)的效應沒有時間要求。
TNF系統(tǒng)在脾的發(fā)育中也起作用。TNF缺失小鼠的脾邊緣區(qū)細胞不表達巨噬細胞標記或MAdCAM-1(Alexopoulou等，第60屆國際TNF會議，歐洲細胞因子網(wǎng)絡，第228頁(1996)；Pasparakis等，第60屆國際TNF會議，歐洲細胞因子網(wǎng)絡，第239頁(1996))。TNF-R75缺失小鼠也缺失脾邊緣區(qū)的MAdCAM-1(但不缺失MOMA-1)。(Neumann等，實驗區(qū)學雜志，184，第259-264頁(1996),Matsumoto等，科學，271，第1289-1291頁(1996))。這些標記在TNF-R75缺失小鼠中的表達正常(Matsumoto等，科學，271，第1289-1291頁(1996))。
淋巴樣組織不僅在發(fā)育過程中出現(xiàn)，而且也在某些病理條件下如在被稱為新淋巴器發(fā)生過程的慢性炎癥中出現(xiàn)(Picker和Butcher，免疫學年簽，10，第561-591頁(1992),Kratz等，實驗醫(yī)學雜志，183，第1461-1471頁(1996))。顯然，TNF家族成員影響了這些過程。由大鼠胰島素啟動子驅(qū)動的TLα基因轉(zhuǎn)基因小鼠出現(xiàn)了LT誘導的有組織的淋巴組織特征的慢性炎癥病變(Kratz等，實驗醫(yī)學雜志，1183，第1461-1471頁(1996)；Picarella等，美國國家科學院院報，89，第10036-10040頁(1992))。
用LTα缺失小鼠評估T細胞依賴的免疫反應的功能，表明LT對于GC的形成，有組織的小結(jié)樹突細胞(FDCs)結(jié)構(gòu)的維持，以及體液應答是必需的(Banks等，免疫學雜志，155，第1685-1693頁(1995)；Matsumoto等，自然，382，第462-466頁(1996))。TNF-R55缺失小鼠也缺失FDCs，不能產(chǎn)生生發(fā)中心以及不能夠產(chǎn)生針對綿羊紅血細胞(SRBC)的最佳抗體應答。這表明TNF-R55也許是由引起這些反應的可溶性LT或TNF信號引發(fā)的(Le Hir等，實驗醫(yī)學雜志，183，第2367-2372頁(1996),Alexopoulou等，第60屆國際TNF會議，歐洲，細胞因子網(wǎng)絡，第228頁(1996)；Pasparakis等，第60屆國際TNF會議，歐洲，細胞因子網(wǎng)絡，第239頁(1996))。至今還未闡明表面LT/LTβ-R通路在體液免疫反應中的作用。
LTβ受體是TNF受體家族的成員，特異地與表面LT配體結(jié)合。LTβ-R與LT異源復合物結(jié)合(主要是LTα1/β2和LTα2/β1)但不與TNF或LTα結(jié)合(Crowe等，科學，264，第707-10頁(1994))。LTβ-R mRNA存在于人的脾，胸腺以及參與免疫系統(tǒng)的一般器官中。
盡管對于LTβ-R表達的研究尚處于早期，LTβ-R表達方式與TNF-R55相似，只是在外周血T和B細胞以及T和B細胞系上缺乏LTβ-R。
已在高水平表達LT的CD4+T細胞雜交瘤細胞(Ⅱ-23.D7)中鑒定了細胞表面淋巴毒素(LT)復合物(Browning等，免疫學雜志，147，第1230-37頁(1991)；Androlewicz等，生物化學雜志，267,第2542-47頁(1992)，兩者在此引用作為參考)。LTβ-R,LT亞基和表面LT復合物的表達及其生物學作用在C.F.Ware等，“淋巴毒素系統(tǒng)的配體和受體”，細胞溶解途徑，現(xiàn)代微生物學和免疫學專題，Springer-Verlag，第175-218頁(1995)中進行綜述，特地在此引用作為參考。
LTα表達的誘導及LTα的分泌主要是由活化的T和B淋巴細胞以及自然殺傷(NK)細胞完成的。在T輔助細胞中，LTα是由Th1而不是由Th2細胞合成的。在黑色素細胞中也可檢測到LTα。多發(fā)性硬化病人病灶中的小膠質(zhì)細胞和T細胞可被抗LTα抗血清染色(Selmaj等，臨床研究雜志，87，第949-954頁(1991))。
β淋巴毒素(也稱為P33)在人和鼠T淋巴細胞，T細胞系，B細胞系和淋巴因子活化的殺傷(LAK)細胞的表面表達。LTβ是申請人共同未決的以WO92/00329公布于1992年1月9日的國際申請PCT/US91/04588和以WO94/13808公布于1994年6月23日的國際申請PCT/US93/11669的主體，在此引用作為參考。
表面LT復合物主要是由活化的T和B淋巴細胞以及自然殺傷(NK)細胞表達，這可通過FACS分析或用抗LTα抗體或可溶性LTβ-R-Ig融合蛋白作的免疫組織學確定。在于1995年7月21日申請的申請人共同未決的美國申請序號08/505,606中，公開了用可溶性LTβ受體以及抗LTβ受體和配體的特異抗體作為治療方法用于由Th1細胞介導的免疫性疾病。在人細胞毒性T淋巴細胞(CTL)克隆活化的外周單核淋巴細胞(PML)、IL-2活化的外周血淋巴細胞(LAK細胞)商陸有絲分裂劑活化的或抗CD40活化的外周淋巴細胞(PBL)以及多種T和B細胞系的淋巴瘤上的表面LT也得到描述。具同種抗原的靶細胞參與特異地誘導CD8+和CD4+CTL克隆表達表面LT。
申請人在此描述了表面LT的幾種免疫學功能，以及LTα/β結(jié)合劑對免疫球蛋白反應的產(chǎn)生和特征的影響，對次級淋巴組織的細胞組成的維持包括對小結(jié)樹突細胞分化狀態(tài)和生發(fā)中心形成的影響，對影響細胞運輸?shù)牡刂匪氐谋磉_水平的影響。因此，申請人將治療性的申請定義為表面LTα/β和LTβ受體結(jié)合劑。
到目前，還未完全弄清楚LT-β-R信號通路對體液或免疫原性反應的影響。本發(fā)明人首次發(fā)現(xiàn)阻斷LT途徑。LT-β或LT-β-R可改變動物的體液免疫反應。因此，本專利申請的發(fā)明在廣泛實施方案中涉及了改變動物體液免疫反應的方法，包括使用包含治療有效量的LT途徑封閉劑，特別優(yōu)選地LT-β-R封閉劑的藥物組合物。
任何封閉劑可用于本發(fā)明，本領域技術人員很容易確定封閉LT-β-R的試劑。例如，這樣的封閉劑可包括小分子受體抑制劑、可溶性β-淋巴毒素受體、針對LT-β-R的抗體以及針對表面LT配體的抗體。在優(yōu)選實施方案中，封閉劑包括具有可選擇性地與表面LT配體結(jié)合的配體結(jié)合區(qū)的可溶性LT-β-R，更優(yōu)選地可溶性LT-β-R包括人免疫球蛋白Fc區(qū)。
在其它實施方案中，優(yōu)選的封閉劑包括針對LT-β-R的單克隆抗體，優(yōu)選地包括抗人LT-β-R的單抗BDA8和抗人LT-β的單抗B9。更優(yōu)選的抗體包括A1.D5.18、AO.D12.10和BB-F6。在某些情況下，用針對鼠表面LT配體的單克隆抗體更可取。
FDC的長期抗原呈遞對自身免疫疾病可能很重要，內(nèi)源或自身抗原導致的免疫系統(tǒng)的持續(xù)活化可使疾病長期發(fā)作。捕獲于FDC上的免疫復合物列于圖7。將免疫復合物從FDC去掉可減少免疫活化的數(shù)量并使疾病減輕甚至阻斷疾病發(fā)展。涉及異常抗體應答的自身免疫疾病顯然是LT通路抑制劑的目標，盡管其它更“經(jīng)典的”T細胞介導的自然免疫疾病或許具未被識別的體液成分，所以也可受到有益的影響。
同樣，在移植領域，移植排斥，即受體對移植疾病和移植對受體疾病需要抗原持續(xù)呈遞。在此所述的控制FDC的機制可運用于與非自身即移植識別相關的問題。
另外，抗原的持續(xù)呈遞或抗原記憶的維持在由分子模擬引起的自身免疫疾病中起作用。例如，對于Lyme氏疏螺旋體病感染因子Borreliaburgdorferi的免疫反應可導致關節(jié)炎樣病，可能的原因是此細菌的Saome抗原決定簇與正常的關節(jié)組成成分相似。去掉FDC保留的Lyme氏細菌抗原可減輕Lyme氏疏螺體病誘發(fā)的關節(jié)炎。這樣的治療方法可用于其它與感染因子相關的摸擬病例。
申請人驚奇地發(fā)現(xiàn)使用LT-β-R的封閉劑能夠干擾抗原在小結(jié)樹突細胞上的呈遞和/或沉積。通常，B細胞將抗原看作是結(jié)合于小結(jié)樹突細胞表面的免疫復合物。小結(jié)樹突細胞可將抗原保留一段未特別指出的時間。與保留于FDC上的抗原的周期性接觸與B細胞記憶保持有關。因此，本專利申請的方法包括多種依賴于抗原在樹突細胞呈遞的疾病狀態(tài)。本發(fā)明的封閉劑可在抗原引入動物前使用，在這種情況下，封閉劑將阻止所有或一部分抗原在小結(jié)樹突細胞上的積累，由此阻止，或減少預料中的免疫原性反應。選擇性地，本發(fā)明的封閉劑可在小結(jié)樹突細胞與抗原發(fā)生關聯(lián)后的某一點對動物施用。申請人專利申請的方法可破壞這種關聯(lián)，以使預料中的免疫原性反應減小或消失。因此，本發(fā)明的治療方法涉及清除已捕獲于B細胞濾泡上的全部或部分免疫復合物，或全部或部分地阻止免疫復合物捕獲在B細胞濾泡上。
破壞呈遞于小結(jié)樹突細胞的這些抗原與免疫復合物結(jié)合的能力是LT-β通路所特有的。例如，抗CD4OL(MR-1)是TNF家族的另一成員并且也在小結(jié)樹突細胞上表達。與LT-β-R/Ig一樣，MR-1可阻止生發(fā)中心形成但不影響FDC標記的表達?？笴D40-L不同于LT-β-R，不能阻止免疫復合物捕獲于小結(jié)樹突細胞上，也不能清除已捕獲于小結(jié)樹突細胞上的免疫復合物。另外，申請人已表明抗CD40-L不能影響原來產(chǎn)生的記憶B細胞的存活/維持。
盡管還不明確抗CD-40L和LT-β-R封閉劑的效果差異的精確基礎，推測CD40可向B細胞提供存活信號。然而，LT系統(tǒng)對于小結(jié)樹突細胞維持完全的分化和功能狀態(tài)是至關重要的。這種狀態(tài)是生發(fā)中心反應以及記憶B細胞的產(chǎn)生和維持所必需的。因此，封閉CD40/CD40L途徑可阻止記憶B細胞的產(chǎn)生，但不會影響已建成的記憶B細胞庫。另一方面，封閉LT途徑不僅阻止記憶B細胞的產(chǎn)生和維持，而且也影響了原來產(chǎn)生的記憶B細胞的維持。
抑制LT途徑進一步的應用在于治療在小結(jié)樹突細胞(FDC)區(qū)室中形成儲存庫的病毒。HIV病毒是一個恰如其分的例子。病毒感染后，大量的病毒滯留于次級淋巴器官B細胞濾泡的FDC上(Heathe等，1995，“小結(jié)樹突細胞和人免疫缺損病毒”，自然，377:740-4)。據(jù)猜測，病毒與補體或免疫球蛋白形成復合物并與Fc受體、補體受體或兩者結(jié)合。這樣，病毒可利用免疫系統(tǒng)的正常機制使抗原記憶保留很長時期。在發(fā)病過程中，淋巴細胞的主動侵染主要發(fā)生在這些部位。據(jù)計算，在感染的無癥狀期，在此小室內(nèi)的病毒庫比T細胞和單核細胞含有的病毒多10位以上(Cavert等，1997，“淋巴組分對HIV-1感染的抗病毒治療反應的動力學”，科學276:960-4)。目前的HIV治療模式聯(lián)合運用多種抗病毒因子以減少病毒量并防止抗性突變體的逃逸。這種治療方法的可能限制在于這種治療的非應變性并且在間隔中殘留病毒任意突變以產(chǎn)生抗性突變體從而逃避了治療過程。盡管FDC小室中病毒量在多藥治療受到很大影響，藥物本身主要是針對病毒復制機制并不針對FDC表面的非復制病毒。因此，F(xiàn)DC的病毒庫可作為藥物治療終止后的再接種物。而且，F(xiàn)DC能夠?qū)⒅泻偷牟《巨D(zhuǎn)變成感染形式從而進一步加強了這些細胞在HIV發(fā)病中的重要性。
因為抑制LT通路能夠使FDC釋放細胞表面的免疫復合物，以免疫組合物形式出現(xiàn)的HIV也被釋放。緊接多重治療體系之前應該將此區(qū)室內(nèi)的HIV病毒全部釋放出來，因為病毒應被加工并從體內(nèi)或在感染開始時清除掉，它對于藥物治療敏感。這樣的聯(lián)合可使病毒量減小至影響治療的最小量。在這種情況下，LTβ-R/Ig或針對配體或受體的封閉抗體是有效的。有力的治療方法涉及開始進行藥物治療，然后在幾天后，以LT通路抑制劑進行一次或幾次治療以釋放任何結(jié)合狀態(tài)的病毒。一旦降低了病毒量，進一步的治療不需要針對LT的試劑。
盡管HIV是經(jīng)特別詳盡地研究的例子，其它病毒很可能以靜止狀態(tài)滯留或藏在FDC上，等待可以導致大量附加抗原產(chǎn)生的免疫紊亂一類的事件，隨后釋放結(jié)合于FDC的病毒，這樣病毒重新出現(xiàn)。因此，本發(fā)現(xiàn)涉及任何抑制LT通路避免FDC結(jié)合病毒發(fā)作的方法。
此發(fā)現(xiàn)對于依賴于抗原在樹突細胞上呈遞和記憶B細胞產(chǎn)生應答的多種疾病有重要意義。LTα1/β2有效地傳遞信號并且是抗LTb封閉單克隆抗體有效治療的例子。另外，被命名為AOD12的抗人LTα的單克隆抗體能夠很好地封閉LTα1/β2信號通路，然而與大多數(shù)抗人LTα的單克隆抗體相比，對LTα的作用效果較差。以可溶性LTα1/β2配體免疫小鼠后得到的這些單克隆抗體發(fā)現(xiàn)了具獨特特異性的單克隆抗體。而且，我們認為只有經(jīng)這種免疫方式而不是單獨用LTα免疫才能得到優(yōu)先對LTα1/β2復合物具特異性的抗LTα單克隆抗體，由此包括了一群獨特的抗LTα抗體。
實施例材料和方法小鼠控制時間受孕的Bal b/c小鼠購自Jackson Laboratory(BarHarbor,ME)，飼養(yǎng)于常規(guī)隔柵屏障內(nèi)，并以指導性說明管理。通過帶孕小鼠的尾靜脈(靜脈內(nèi))注射受體-Ig蛋白或單克隆抗體。通過腹膜途徑(腹膜內(nèi))將融合蛋白注射給這些小鼠的子代以及5周齡雌性Balb/c小鼠(購自Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME)。
融合蛋白和抗體按(Force等，免疫學雜志，155，第5280-5288頁(1995)；Miller等，實驗醫(yī)學雜志，178，第211-222頁(1993))描述的方法制備包含有與人IgG1的鉸鏈區(qū)，CH2和CH3區(qū)融合的鼠LTβ-R，人TNF-R55或人LFA-3(不與鼠CD2結(jié)合)的胞外區(qū)融合蛋白。用作對照的純化的人IgG1購自Protos Immunorsearch(San Fran Cisco,CA)。MR1，抗小鼠CD40配體抗體購自Pharmingen(San Diego,CA)。
由小鼠嗜金屬巨噬細胞(MM)表達的標記特異的抗體(MPMA-1,ED3),(ED3識別唾酸粘附素)，或小鼠網(wǎng)狀纖維母細胞特異的抗體(ER-TR-7)購自Serotec(Oxon,UK)。小鼠B220,CD4和MadCAM-1特異的抗體(MECA367)購自Pharmingen(SanDiego,CA)。小鼠邊緣區(qū)巨噬細胞表達的標記特異的抗體(ER-TR-9)由Reina Mebins博士惠贈(Vrje Universiteit,Amsterdam)。小鼠小結(jié)樹突細胞(FDC)特異的抗體(FDC-M1和FDC-M2)已被描述過(Maeda等，免疫學雜志，148，第2340-2347頁(1992))?？剐∈驝R1抗體(也可將FDC染色)由Randolph J.Noelle博士惠贈(Dartmonth Medical School)。利用抗體MECA 79檢測周圍淋巴結(jié)地址素(PNAD)(細胞上清來自購自ATCC,Rockville,MD的細胞)。
抗原和免疫以100μl 10％的SRBC懸液腹膜內(nèi)免疫小鼠(購自Colorado SerumCompany)。每次免疫物相當于1-5×108個SRBC。
免疫組織化學將脾和淋巴結(jié)冷凍于OCT包埋劑(Miles,Elkhart,IN)并封固以進行恒冷箱切片。7-10mm厚的切片干燥后以丙酮固定。切片與經(jīng)Tris緩沖鹽溶液A稀釋(TBS-A,0.05M Tris,0.15M Nacl,0.05％Tween-20(v/v),0.25％牛血清白蛋白(BSA))的偶聯(lián)抗體于室溫下的濕室中溫育1小時，以TBS-B(0.05M Tris,0.15M NaCl,0.05％Tween-20)洗滌，在起始酶反應以前在甲醇中固定1分鐘。分別用DAB片劑底物盒(Sigma,st.Louis,MO)和5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸/硝基藍四氮唑(BCIP/NBT,Sigma)分別顯現(xiàn)辣根過氧化物酶(HRP)和堿性磷酸酶活性。組織切片在甲醇中固定5分鐘后以Giemsa(Fluka,Buchs,Switzerland)進行復染。
熒光圖像分析為了進行免疫熒光染色，用丙酮固定冷凍切片，令其空氣干燥；用以5μg/ml的濃度溶解于含0.25％BSA,0.05％Tween-20和10％熱凝集兔血清的Tris緩沖鹽水的抗CD16/CD32 Fc封閉劑(Pharmingen,San Diego；CA)預封閉。用下列單克隆抗體和檢測試劑在相同緩沖液中對切片進行染色10μg/ml生物素化的抗B220的單克隆抗體(pharmingen)，然后是20μg/ml鏈親和素-FITC(SouthernBiotechnology Associates,Birmingham,AL)；10μg/ml MECA 367；然后是10μg/ml PE-山羊F(ab’)2抗大鼠IgG(Southern BiotechnologyAssociates)；MECA 79培養(yǎng)上清，然后是20μg/ml FITC-小鼠抗大鼠IgM(pharmingen)；20μg/ml抗唾酸粘附素單克隆抗體，然后是10μg/ml PE-山羊F(ab’)2抗大鼠IgG(Southem BiotechnologyAssociates),50μg/ml生物素化的PNA(Vector Laboratiories,Burlingame,CA)，然后是10μg/ml鏈親和素-PE(SouthernBiotechnology Associates)；以1∶5稀釋的單克隆抗體MOMA-1細胞培養(yǎng)上清，然后是20μg/mL FITC-小鼠抗大鼠IgM(pharmingen)。有些切片以多種單克隆抗體同時染色以進行圖像遮蓋分析。所有的切片在50X光學顯微鏡下觀察并用Ektachrome P 1600拍照(Kodak,Rochester,NY)或用(Rennert等，實驗醫(yī)學雜志，(1996年11月，出版中))描述的方法將其捕捉為單獨的紅色和綠色圖像文件。
血細胞凝集實驗以PBS/1％葡萄糖在96孔微量滴定板上(Costar,Cambridge；M)連續(xù)稀釋血清。向每一孔中加入25μl 10％的SRBC懸液并將此板在潮濕的37℃孵箱中溫育1小時以測定SRBC特異的IgM的滴度。對于SRBC特異的IgG，每孔中加入20μl 1％2-巰基乙醇(體積/體積)(Bio-Rad,Richmond,CA)后將血清于37℃溫育30分鐘以清除IgM五聚體。然后每孔加入25ul 10％SRBC懸液，隨后每孔加入25ul山羊抗小鼠IgG(Southern Biotechology,Birmingham,AL)的10mg/ml溶液(PBS/1％葡萄糖)作為血細胞凝集的交聯(lián)劑。最后血細胞凝集明顯時的血清稀釋度的倒數(shù)確定為滴度。
ELISA將鼠LTβ-R(Browning等，底稿在準備中)、LFA-3(Miller等，實驗醫(yī)學雜志；178；第211-222頁(1993))或人IgG1的CH3特異的單克隆抗體直接固定于(10μg/ml)96孔微量滴定板上用于捕捉，用驢抗人IgG1-辣根過氧化物酶(HRP)檢測(Jackson Immuno Research,West Grove PA,1∶4000稀釋)，以分析血漿中受體Ig。
可溶性LTβ-R分子的制備本發(fā)明一個實施例中的LTβ-R封閉劑包括可溶性LTβ受體分子。圖1表示了人LTβ-R胞外部分的序列，它編碼配體結(jié)合區(qū)。運用圖1中的序列信息和本領域中眾所周知的重組DNA技術，將編碼LTβ-R配體結(jié)合區(qū)域的功能片段將克隆到載體中并在合適的宿主中表達以合成可溶性LTβ-R分子。根據(jù)申請人共同未決的美國申請序號08/505,606,1995年7月21日提交中描述的測定，與天然LTβ受體競爭結(jié)合LT配體的可溶性LTβ-R分子可選作LTβ-R封閉劑。
包含選自圖1所示的氨基酸序列的可溶性受體可與一個或多個異源蛋白區(qū)域(“融合區(qū)域”)相連接以提高受體結(jié)合蛋白在體內(nèi)穩(wěn)定性或調(diào)節(jié)其生物學活性或定位。
優(yōu)選地，穩(wěn)定的血漿蛋白質(zhì)-通常其在循環(huán)中的半衰期在20小時以上-可用于構(gòu)建受體融合蛋白。這樣的血漿蛋白質(zhì)包括但不限于免疫球蛋白，血清白蛋白，脂蛋白，載脂蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白。能夠?qū)⒖扇苄訪Tβ-R分子定位于特定細胞或組織類型，也可連接到LTβ-R配體結(jié)合區(qū)域以產(chǎn)生特定定位的可溶性LTβ-R融合蛋白。
包含LTβ-R受體結(jié)合區(qū)域的LTβ-R胞外區(qū)(圖1)的全部或部分可與人IgG1重鏈Fc區(qū)域一類的免疫球蛋白融合(Browning等，免疫學雜志，154，第33-46頁(1995))?？扇苄允荏wIgG融合蛋白是優(yōu)選的，是普通的免疫試劑，它們的構(gòu)建方法在本領域中為人所知(見如，美國專利號5,225,538，在此引入作為參考)。
功能性的LTβ-R配體結(jié)合區(qū)域可與IgG1以外的免疫球蛋白群或亞群的免疫球蛋白(Ig)Fc區(qū)域相融合。屬于不同Ig群或亞群抗體的Fc區(qū)能活化不同的次級效應功能?；罨l(fā)生于Fc區(qū)與同源Fc受體結(jié)合時，次級效應物功能包括活化補體系統(tǒng)的能力，通過胎盤的能力，與各種微生物蛋白結(jié)合的能力。不同免疫球蛋白群和亞群的特征在Roitt等，免疫學，第48頁(Mosby-Year BookEurope Ltd.，第3段1993)中有所描述。
補體系統(tǒng)的活化引發(fā)介導炎癥的級聯(lián)酶促反應。補體系統(tǒng)的產(chǎn)生具有多種功能，包括與細菌結(jié)合、內(nèi)吞作用、吞噬作用、細胞毒性、自由基形成和免疫復合物的溶解。
補體酶級聯(lián)由結(jié)合抗原的抗體IgG1,IgG3和IgM的Fc區(qū)活化。IgG2的Fc區(qū)效果較差，IgG4,IgA,IgD和IgE的Fc區(qū)不能活化補體。因此，可根據(jù)其相關的次級效應物功能對于特定的免疫反應或以LTβ-R-Ig融合蛋白治療的疾病是否可取來選擇Fc區(qū)。
如果損害或殺死具有LT配體靶細胞是有利的，可選擇具特別活性的Fc區(qū)(IgG1)以制備LTβ-Ig融合蛋白。替代地，如果將LTβ-R-Fc融合蛋白而不引發(fā)補體系統(tǒng)，則應選擇無活性的IgG4 Fc區(qū)。
已描述了降低或清除與Fc受體結(jié)合和補體活化的Fc區(qū)中的突變(S.Morrison，免疫學年鑒，10，第239-65頁(1992))?？蓡为毣蚵?lián)合使用這些或其它突變，以使用于構(gòu)建LTβ-R-Ig融合蛋白的Fc區(qū)的活性最佳。
包含與人免疫球蛋白Fc區(qū)融合的配體結(jié)合序列的可溶性人LTβ-R融合蛋白(hLTβ-R-Ig)的產(chǎn)生描述于實施例1。一個根據(jù)實施例1制備分泌h LTβ-R-Fc的CH0系被稱為“hLTβ-R；hG1CHO#14”。根據(jù)Bidapest條約的規(guī)定，這個細胞系的樣品于1995年7月21日貯存于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)(Rockville,MD)并指定其ATCC注冊號CRL11965。
可溶性鼠LTβ-R融合蛋白分子(LTβ-R-Ig)的產(chǎn)生在實施例2中進行了描述。一個根據(jù)實施例2制備的CHO系被稱為“mLTβ；R-hG1 CHO#1.3.BB。”根據(jù)Budapest條約的規(guī)定，這個細胞系的樣品于1995年7月21日貯存于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)(Rockville,MD)并指定其ATCC注冊號CRL11964。
一旦本申請被授予專利，上述ATCC保存物對公眾可得到性的所有限制將不可挽回地被撤消。
形成受體-Ig融合蛋白連接點的不同氨基酸殘基可改變可溶性融合蛋白的結(jié)構(gòu)，穩(wěn)定性及其最終的生物學活性?？蓪⒁粋€或多個氨基酸添加到所選LTβ-R片段的C末端從而用所選的融合區(qū)修飾連接點。
改變所選LTβ-R DNA片段插入重組表達載體時5’末端的切割位置可改變LTβ-R融合蛋白的N末端?？捎贸Ｒ?guī)實驗和此處所述的選擇LTβ-R封閉劑的實驗檢測和優(yōu)化每一LTβ-R融合蛋白的穩(wěn)定性和活性。
利用圖1中所示的胞外區(qū)內(nèi)的LTβ-R配體結(jié)合區(qū)的序列，可構(gòu)建氨基酸變異體以修飾可溶性受體或融合蛋白對LT配體的親和力。本發(fā)明的可溶性LTβ-R分子可與內(nèi)源性細胞表面LTβ受體競爭與表面LT配體結(jié)合。可以預想，任何包含能與細胞表面LTβ受體競爭與LT配體結(jié)合的可溶性分子是本發(fā)明范圍內(nèi)的LTβ-R封閉劑。
抗LTβ-R抗體的來源在本發(fā)明中的另一實施方案中，針對人LTβ受體的抗體(抗-LTβ-R抗體)可作為LTβ-R封閉劑。本發(fā)明的抗LTβ-R抗體可以是多克隆抗體或單克隆抗體(mAbs)并且可被修飾以優(yōu)化其封閉LTβ-R信號通路的能力，其體內(nèi)生物可利用性，穩(wěn)定性或其它希望的特征。
用常規(guī)技術通過用皮下注射方式將完全弗氏佐劑中的人LTβ受體-Ig融合蛋白(實施例1)注射山羊，兔子，大鼠，倉鼠或小鼠一類的動物，然后以不完全弗氏佐劑通過腹膜內(nèi)或皮下注射加強，以制備針對人LTβ受體的多克隆抗體血清。用常規(guī)免疫學方法對包含有希望的針對LTβ受體抗體的多克隆抗血清進行篩選。
針對人LTβ受體-Ig融合蛋白的小鼠單克隆抗體(mAb)可用申請人共同未決于1995年7月21日提交的美國申請序號08/505,606中所述的制備。根據(jù)Budapest條約的規(guī)定，合成小鼠抗人LTβ-R mAb BDA8的雜交瘤細胞系(BD.A8.AB9)于1995年1月12日貯存于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)(Rockville,MD)，并指定了注冊號HB11798。一旦本申請被授予專利，上述ATCC保存物對公眾可得到性的所有限制將不可挽回地被撤消。
用標準重組DNA技術(Winter和Milstein，自然，349，第293-99頁(1991))，可制備各種形式的抗LTβ-R抗體。例如，將動物抗體的抗原結(jié)合區(qū)與人恒定區(qū)連接以構(gòu)建“嵌合”抗體(如，Cabilly等，美國4,816,567；Morrison等，美國國家科學院院報，81，第6851-55頁(1984))。當用于人類臨床治療時，嵌合抗體減少了由動物抗體引發(fā)的免疫反應。
另外，可合成識別LTβ-R的重組“人源化抗體”。人源化抗體是主要包含插入有特定抗原結(jié)合區(qū)人IgG序列的嵌合體(如，WO94/04679)。以希望的抗原免疫動物，分離相應的抗體，移掉特異抗原結(jié)合的可變區(qū)序列。來自動物的抗原結(jié)合區(qū)克隆到刪除了抗原結(jié)合區(qū)的人抗體基因合適的位置。人源化抗體使人抗體中異源(種間)序列的使用降低至最小，在受治療對象中不可能引發(fā)免疫應答。
制備包含有抗LTβ-R可變區(qū)和從不同免疫球蛋白群分離的人恒定區(qū)(CH1,CH2,CH3)的嵌合或人源化抗體可構(gòu)建不同類的重組抗LTβ-R抗體。例如，將抗原結(jié)合位點克隆到攜帶人μ鏈恒定區(qū)的載體中可用重組方法制備具有提高了的抗原結(jié)合位點效價的抗LTβ-RIgM抗體(Arunlanandam等，實驗醫(yī)學雜志，177，第1439-50頁(1993)；Lane等，歐洲免疫學雜志，22，第2573-78頁(1993)；Traunecker等，自然，339，第68-70頁(1989))。
另外，通過改變抗原結(jié)合位點附近的氨基酸殘基，標準重組DNA技術可用于改變重組抗體與其抗原的結(jié)合親和力。根據(jù)分子模型進行的突變可提高人源化抗體的抗原結(jié)合親和力(Queen等，美國國家科學院院報，86，第10029-33頁(1989)；WO94/04679)。
依據(jù)靶組織類型或預想的特定治療計劃，也許希望提高或降低抗LTβ-R對LTβ-R的親和力。例如，對于半預防性治療而言，用LT-β路通傳遞信號能力低而具恒定水平的抗LTβ-R抗體治療病人是有利的。同樣，對LTβ-R有親和力增加的抑制性抗LTβ-R抗體對于短期治療是有利的。
抗表面LT配體抗體的來源本發(fā)明的另一優(yōu)選的實施方案涉及了包含有針對作為LTβ-R封閉劑的LT配體的抗體的組合物和方法。如上所述制備抗LTβ抗體的方法，作為LTβ-R封閉劑的抗LT配體抗體可以是多克隆抗體或單克隆抗體，可根據(jù)常規(guī)方法調(diào)節(jié)其抗原結(jié)合特征及其免疫原性對其進行修飾。
本發(fā)明的抗LT抗體可以是針對兩個LT亞單位中的任何一個，包括可溶性的，突變的，改變的和嵌合形式的LT亞單位。如果將LT亞單位作為抗原，優(yōu)選地是LTβ亞單位。如果使用LTα亞單位，優(yōu)選的與表面LT配體結(jié)合的抗LTα抗體不與分泌的LTα發(fā)生交叉反應或不調(diào)節(jié)TNF-R活性(根據(jù)1995年7月21日提交的申請人共同未決的美國申請序號08/505,606所述的實驗)。
替代地，可制備針對包含一個或多個LT亞單位的同源(LTβ)或異源(LTα/β)復合物并篩選作為LTβ-R封閉劑活性。優(yōu)選地，將LTAα1/β2復合物作為抗原。如上文所討論的，優(yōu)選的抗LTα1/β2抗體與表面LT配體結(jié)合而不與分泌的LTα結(jié)合也不影響TNF-R活性。
抗人LTα多克隆抗體的制備在申請人共同未決申請(WO94/13808)中有所描述。抗LTα和抗LTβ的單克隆抗體在(Browning等，免疫學雜志，154，第33-46頁(1995))中描述。
按1995年7月21日提交的申請人共同未決的美國申請序號08/505,606所述制備小鼠抗人LTβ單克隆抗體。根據(jù)Budapest條約的規(guī)定，合成小鼠抗人LTβ-R單克隆抗體B9的雜交瘤細胞系(B9、C9.1)于1995年7月21日貯存于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)(Rockville,MD)并指定了ATCC注冊號HB11962。
按1995年7月21日提交的申請人共同未決的美國申請序號08/505,606所述制備倉鼠抗小鼠LTα/β的單克隆抗體。根據(jù)Budapest條約的規(guī)定，合成倉鼠抗小鼠LTα/β的單克隆抗體BB.F6的雜交瘤細胞系(BB.F6.1)于1995年7月21日貯存于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)(Rockville,MD)并指定了ATCC注冊號HB11963。
一旦本申請被授予專利，上述ATCC保存物對化從可得到性的所有限制將不可挽回地被撤消。
用可溶性LTβ-R-Ig抑制表面LT復合物的免液功能。
我們表明了表面LT結(jié)合劑，由小鼠LTβ-R的胞外區(qū)和人IgG1的鉸鏈區(qū)，CH2及CH3組成的融合蛋白(LTβ-R-Ig)對于免疫球蛋白應答的產(chǎn)生和特征的影響，以于包括對小結(jié)樹突細胞分化狀態(tài)和生發(fā)中心形成影響的次級淋巴組織細胞結(jié)構(gòu)維持的影響，對于影響細胞運輸?shù)牡刂匪乇磉_水平的影響。
用LTβ-R-Ig多次注射改變脾淋巴細胞的結(jié)構(gòu)以及脾邊緣區(qū)細胞功能標記的表達。
連續(xù)將LTβ-R-Ig注射小鼠六周；每周一次，以觀察表面LT阻斷對脾結(jié)構(gòu)的影響。然后以SRBC免疫小鼠；4天后再注射一次LTβ-R-Ig。注射SRBC后10天將小鼠處死。冷凍脾切片的免疫組織化學染色揭示了幾種組織變化。組成正常小鼠脾B細胞室的濾泡經(jīng)LTβ-R-Ig處理后不再是分立的。相反，B細胞圍繞T細胞區(qū)形成彌散的帶(圖2B),T和B細胞之間的界限遭到破壞(圖2B)。相反，作為對照的LFA-3-Ig處理小鼠脾B細胞濾泡是分立的并且T和B細胞區(qū)之間有明顯的界限(圖2A)。
LTβ-R-Ig處理小鼠的脾邊緣區(qū)的兩種不同巨噬細胞群不表達被單克隆抗體ER-TR-9和MOMA-1識別的細胞表面標記。ER-TR-9染MZM上的標記(Dijkstra等，免疫學，55,23-30(1985),MOMA-1染嗜金屬巨噬細胞上的標記(Krael和Janse，免疫學，58,665-669,(1986))(分別是圖2D,F)。這些標記在對照(LFA-3-Ig)處理小鼠的細胞上表達(圖2C,E)。LTβ-R-Ig處理小鼠的鼠脾邊緣區(qū)MOMA-1陽性巨噬細胞的另一標記，唾酸粘附素，也不表達(數(shù)據(jù)未顯示)。
抗體EMCA-367與最初表達于淋巴集結(jié)，腸系膜淋巴結(jié)；腸粘膜和固有層內(nèi)皮細胞的粘附分子和粘附地址素MAdCAM-1結(jié)合(Briskin等，自然，363，第461-464頁(1993)；Nakache等，自然，337，第179-181頁(1989))。MAdCAM-1也在脾邊緣區(qū)(假定在開口于邊緣竇的小終端微動脈的內(nèi)皮細胞上表達)和生發(fā)中心內(nèi)的網(wǎng)眼上表達(Kraal等，美國病理學雜志，147，第763-771頁(1995))(圖2G)。LTβ-R-Ig處理的小鼠切片用MECA 367染色，表明脾不再表達MAdCAM-1(圖2H)。
同樣，分辨邊緣區(qū)網(wǎng)狀上皮細胞的ER-TR-7抗體染色(Van,vliet等，細胞化學，34，第883-890頁(1986))(圖2I)異常分化且LTβ-R-Ig處理后的動物白髓比LFA-3-Ig處理的動物白髓染色強(圖2J)。LTβ-R-Ig處理小鼠中觀察到的變化不依賴于抗原，因為染色模式與LTβ-R-Ig處理的未經(jīng)免疫小鼠的染色模式相同(數(shù)據(jù)未顯示)。
LTβ-R-Ig處理的小鼠脾中不再形成生發(fā)中心，也檢測不到小結(jié)樹突細胞為了在組織水平上檢測多次給小鼠注射LTβ-R-Ig是否影響對SRBC的免疫反應，對抗原引發(fā)下生發(fā)中心(GC)的形成和小結(jié)樹突細胞(FDC)的分布進行了分析。用商陸凝集素(PNA)對以圖2描述的方法經(jīng)LTβ-R-Ig或LFA-3-Ig多次預理的小鼠冷凍脾切片進行染色以顯現(xiàn)GC，以FDC-M1抗體染色以檢測FDC,FDC-M1是GC形成必需的細胞組分(Scrhriever和Nadter，免疫學進展，51，第243-284頁(1992)；Tew等，免疫學評述115，第185-211頁(1990))。CD40與CD40配體的相互作用對于GC形成也是至關重要的(Foy等，實驗醫(yī)學雜志，180，第157-163頁(1994))。因此為了進行比較，用抗小鼠CD40配體抗體MR1處理一組小鼠，然后進行可抑制GC形成的注射方法處理小鼠(Han等，免疫學雜志，155，第556-567頁(1995))。SRBC攻擊后10天，以對照LFA-3-Ig蛋白處理的小鼠脾中有很多PNA染亮的GC(圖3A)。LTβ-R-Ig或MR1-處理的小鼠脾中未檢測到GC(分別是圖3B、C)。然而，MR-1和LTβ-R-Ig的作用可由另外的兩項觀察區(qū)分開。LTβ-R-Ig處理小鼠脾中(圖3E)缺少GC內(nèi)FDCS(FDC-M1)染色(圖3D)然而MR1-處理小鼠內(nèi)仍有這種染色(圖3F)。用FDC-M2抗體對FDCS進行染色得到相似的結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)。因此，LTβ-R-Ig處理導致了脾中FDC表型改變并且不能形成GC。
除了染GC外，PNA也可對正常小鼠脾的邊緣區(qū)進行染色。LFA-3-Ig處理小鼠(圖3A)和MR1處理小鼠(圖3C)中也觀察到這種染色；而LTβ-R-Ig處理小鼠脾中沒有這種染色(圖3B)。
MR1處理小鼠的脾可正常表達唾酸粘附素，MOMA-1,ER-TR-9,ER-TR-7和MAdCAM-1(數(shù)據(jù)未顯示)，進一步區(qū)分干擾CD40和LTβ-R信號通路的分子效應。
LTβ-R-Ig誘導脾淋巴細胞組織和邊緣區(qū)細胞標記表達改變的動力學分析了影響脾淋巴細胞組織和邊緣區(qū)細胞標記表達所需的注射LTβ-R-Ig的次數(shù)。用LTβ-R-Ig通過腹膜內(nèi)一次或多次注射小鼠，如表1所示。在末次注射LTβ-R-Ig的當天，以SRBC免疫部分小鼠。分別檢測了經(jīng)處理小鼠的冷凍脾切片上B220和CD40的表達，以PNA(針對GC)和MECA367(針對MAdCAM-1),MOMA-1,ER-TR-9以及FDC-M1進行染色。對嗜金屬巨噬細胞，邊緣區(qū)巨噬細胞，MAdCAM-1,GCS以及FDCs染色消失的動力學是不同的。
注射1次LTβ-R-Ig足以使MAdCAM-1染色在一周后消失。每周一次，注射三次LTβ-R-Ig后，檢測不到GCs和FDCs染色，T/B淋巴細胞室被破壞。清除嗜金屬巨噬細胞染色至少需要注射4次LTβ-R-Ig。注射LTβ-R-Ig六次也不能完全清除用ER-TR-9抗體對邊緣區(qū)巨噬細胞進行的染色(如圖2D所示)。
在缺少抗原的情況下，對注射1次LTβ-R-Ig后，MOMA-1,MAdCAM-1,FDC-M1。FDC-M2和CR1染色的快速抑制進行了精確分析(表2)。表1成年小鼠對SRBC作出反應時，LTβ-R-Ig對脾組織和生發(fā)中心形成的影響

每周注射一次，每次100ug LTβ-R-Ig腹膜內(nèi)注射小鼠1-5周然后處死。除非特別說明，腹膜內(nèi)注射SRBC(100ul10％的懸液)之前使用LTβ-R-Ig，最后一次LTβ-R-Ig與抗原注射在同一天進行。注射SRBC后10天處死動物。用生物標記的大鼠抗小鼠B220和大鼠抗小鼠CD4雙染冷凍脾切片，然后分別使用鏈親和素堿性磷酸酶和小鼠抗大鼠Ig過氧化物酶。也用下列抗鼠抗體對脾切片進行染色大鼠抗邊緣區(qū)巨噬細胞(ER-TR9)，大鼠抗嗜金屬巨噬細胞(MOMA-1)；大鼠抗MAdCAM-1(MECA:367)和大鼠抗FDC(FDC-M1)，然后使用鼠抗大鼠Ig過氧化物酶。用生物素化的商陸凝集素(PNA-生物素)然后用鏈親和素過氧化物酶對另一套冷凍切片染色以檢測生發(fā)中心。每項觀察在每組至少3只動物的切片上進行。
*觀察染色強度用肉眼正常染色+++，染色減弱++，染色弱+，以及無色-。未處理動物和以LFA-3-Ig處理動物的切片的染色強度作為正常染色參照。
§每張脾切片中生發(fā)中心的數(shù)目記錄如下＞10+++；5-10++；1-5+；沒有-。
≠未接受SRBC的動物。
ND未做。表2:LTβ-R-Ig對MOMA-1,MAdCAM-1,CR1,FDC-M1和FDC-M2染色影響的精確計時單一注射LTβ-R-Ig后的天數(shù)0 1 3 5 7 10 14MOMA-1*++++++++++++ ++ ++ +MAdCAM-1*++++/-- - - --CR1*+++++++- ++ ++ ++ +FDC-M1*++++/-- - ---FDC-M2*++++/-- - - --Balb/c小鼠，5-6周接受1劑腹膜內(nèi)注射的100ug LTβ-R-Ig或人Ig。每組的小鼠在第0,1,3,5,7,10和14天被處死。冷凍脾切片以下列抗體染色大鼠抗小鼠嗜金屬巨噬細胞(MOMA-1)，大鼠抗小鼠MAdCAM-1(MECA 367)，大鼠抗小鼠FDC(FDC-M1)，大鼠抗小鼠FDC(FDC-M2)以及生物素標記的大鼠抗小鼠CR1，然后用小鼠抗大鼠Ig-過氧化物酶(MOMA-1,MAdCAM-1,FDC-M1和FDC-M2)或過氧化物酶標記的鏈親和素(CR1)。
*用肉眼觀察染色強度正常染色；+++，染色減弱++，染色弱+，以及無染色-。未處理動物和以人Ig處理動物的切片染色強度作為正常染色參照。分析了每組至少兩只動物的切片。
注射后，每天處死接受了單一腹膜內(nèi)注射LTβ-R-Ig的Balb/c小鼠，進行14天，移取并冷凍它們的脾。用MOMA-1，抗MAdCAM-1(MECA-367，以及FDC特異的試劑FDC-M1,FDC-M2和抗CR1抗體對冷凍脾切片染色。LTβ-R-Ig注射后一天，用抗MAdCAM-1,FDC-M1和FDC-M2試劑進行的染色大幅度減弱(表2)。與表1中描述的結(jié)果相比，這個實驗中FDC-M1染色的快速抑制可能是由于經(jīng)過免疫的動物中FDC-M1染色比較強的原因。第14天時還可檢測到對CR1的染色，表明LTβ-R-Ig處理后3天FDC仍存在而FDC-M1和FDC-M2所檢測的標記則不再表達。由此LTβ-R-Ig處理改變了FDC表型。最后，MOMA-1染色減弱但在第14天仍可檢測到。
多次LTβ-R-Ig處理抑制了淋巴結(jié)中地址素的表達我們檢測了定時受孕的Balb/c小鼠子代淋巴結(jié)中地址素的表達，這些受孕小鼠在懷孕的第14天和第17天靜脈注射了200ug受體-Ig蛋白。出生后，子代小鼠未被處理或每周通過腹膜內(nèi)注射100ug LTβ-R-Ig,TNF-R.55-Ig；或LFA-3-Ig。ELISA檢測表明在整個生命過程中，融合蛋白水平保持在或高于10ug/mL(數(shù)據(jù)未顯示)。用MECA 367和MECA 79進行免疫組織化學染色表明整個生命過程中以LTβ-R-Ig處理的小鼠的腸系膜淋巴結(jié)中完全沒有MAdCAM-1和外周淋巴結(jié)地址素(圖4A,B)。這些小鼠的骶淋巴結(jié)缺乏所有地址素的表達，頸和髂淋巴結(jié)不顯示周圍神經(jīng)節(jié)(PHAD染色)(數(shù)據(jù)未顯示)。地址素表達下調(diào)是可逆的，因為只在子宮內(nèi)經(jīng)處理的動物的表達可恢復到正常水平(圖4G,H)。在整個生命過程中以100ug/周TNF-R-55-Ig或LFA-3-Ig處理的小鼠的淋巴結(jié)中地址素表達與未處理小鼠相近(圖4C,D,E,F)。
LTβ-R-Ig處理小鼠的淋巴結(jié)中B淋巴結(jié)定位和巨噬細胞標記表達被改變與LN被膜下淋巴竇(類似于脾邊緣區(qū))中巨噬細胞群標記結(jié)合的抗體被用于對小鼠的LN進行免疫組織化學分析，這些小鼠經(jīng)上這述圖4描述的方法在懷孕期間和出生后以LTβ-R-Ig,TNF-R55-Ig，或LFA-3-Ig連續(xù)處理。用圖像分析軟件對熒光圖象進行分析。唾酸粘附素的表達在以可溶性LTβ-R-Ig處理的小鼠淋巴結(jié)減弱(圖5B)，而在以下TNF-R55-Ig或LFA-3-Ig處理的小鼠淋巴結(jié)中沒有減弱(圖5E,H)。在以LTβ-R-Ig處理的小鼠淋巴結(jié)中仍可檢測到MOMA-1在被膜下淋巴竇內(nèi)巨噬細胞上的表達(圖5C)。
也評介了連續(xù)的LTβ-R-Ig處理對淋巴結(jié)中淋巴細胞組織的影響。以B細胞標記B220和T細胞標記CD4特異的單克隆抗體對LN切片進行染色。圖像分析用以確定T和B細胞區(qū)的交叉。以LTβ-R-Ig處理可導致B細胞濾泡溶解從而使B細胞以彌散的帶呈現(xiàn)出T細胞區(qū)外圍(圖5A)。盡管B細胞濾泡結(jié)構(gòu)溶解了，B細胞不出現(xiàn)于淋巴結(jié)的T細胞區(qū)內(nèi)，相反，它們出現(xiàn)于正常情況下沒有淋巴細胞的區(qū)域。在小鼠的整個生命過程中在以100ug/周TNF-R55-Ig而非LFA-3-Ig處理的小鼠中可觀察到相似的T和B細胞染色模式(圖5D)。B細胞濾泡再次被破壞并且B細胞出現(xiàn)于淋巴結(jié)中通常情況下不包含淋巴細胞的區(qū)域。未觀察到B細胞與T細胞的重疊。
LTβ-R-Ig處理小鼠抑制了IgM和IgG抗體應答用LTβ-R-Ig多次處理的小鼠經(jīng)SRBC引發(fā)后不能形成生發(fā)中心(如圖3中)，表明這些小鼠的體液免疫應答發(fā)生了改變。為了直接驗檢這一點，成年小鼠接受六次LTβ-R-Ig或LFA-3-Ig注射，每周一次，然后以SRBC引發(fā)。在免疫后的第7天和第14天對小鼠采血，用血細胞凝集實驗分析血清中SRBC特異的IgM和IgG的存在情況。與經(jīng)人Ig或PBS處理的小鼠相比，用LTβ-R-Ig處理的小鼠經(jīng)SRBC免疫后的第7天，IgM的滴度正常而IgG應答降低較多(圖6A)。與經(jīng)人Ig或PBS處理的小鼠相比，LTβ-R-Ig處理的小鼠血清中仍檢測不到SRBC特異的IgG，而且這些小鼠中SRBC特異的IgM的滴度也降低了一半多(圖6A)。
SRBC引發(fā)10天后，可在以LTβ-R-Ig處理一次或兩次的小鼠脾中檢測到GC，然而與對照相比，GC的數(shù)量減少很多(表1)。當小鼠接受兩次LTβ-R-Ig注射，第一次在SRBC引發(fā)前一周，第二次注射在SRBC注射的當天，在第7天和第14天時，檢測到的針對SRBC的IgM和IgG抑制情況(圖6B)與當小鼠接受多次LTβ-R-Ig注射時檢測到的相似(圖6A)。在免疫后第30天，檢測不到SRBC特異的IgG，與對照相比IgM的水平降低了80％(圖6B)。因此，與對照相比，LTβ-R-Ig處理方法導致IgG應答全部受抑制，IgM應答減弱/減小。
若小鼠在SRBC引發(fā)的當天只接受一次LTβ-R-Ig注射，第7天時針對SRBC的IgG和IgM應答水平與對照組的相似(圖6C)。然而，在免疫后的第24天，IgM和IgG的滴度都降低了30％。在SRBC引發(fā)后第34天，與對照組相比SRBC特異的IgM滴度降低了50％而檢測不到SRBC特異的IgG(圖6C)。這些數(shù)據(jù)表明LTβ-R-Ig處理方法可導致已存在的IgM和IgG應答水平的減弱/減小，即LTβ-R-Ig處理可抑制已啟動的體液應答。
抗體介導的疾病許多器官特異的多系統(tǒng)自身免疫狀況涉及了病理性的抗體應答。這樣的狀況包括重癥肌無力，自身免疫性溶血性貧血，南美洲錐蟲病，突眼性甲狀腺腫，自發(fā)性血小板減少紫癜(ITP)，系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)，結(jié)節(jié)性多動脈炎，以及快速進行性新月形腎小球性腎炎。(來自Benjamini等，免疫學，簡易教程，(Wiley-Liss,New York第3版，(1996))。
盡管還未確定SLE的病原學，對于產(chǎn)生這種病理現(xiàn)象的免疫學機制有相當?shù)牧私?。由于未知的原因，SLE患者產(chǎn)生針對身體核組分的抗體(抗核抗體，NAA)，值得注意的是針對天然雙鏈DNA。臨床上，這些抗體的出現(xiàn)與SLE中腎牽連的病理有較大的相關性。這些包含DNA抗體復合物顯然來自正常組織的降解，與任何免疫聚集病疾，這樣的復合物被捕捉于腎小球基底膜上，微動脈壁上和關節(jié)滑液空間內(nèi)形成沉積。這些復合物活化補體級聯(lián)從而吸引粒細胞。隨后的炎癥反應特征是腎小球性腎炎，伴隨的腎破壞可導致蛋白尿和血尿。
已通過鼠模型對狼瘡性腎炎進行了幾十年的研究。最近，在這樣的一個模型中評價了針對鼠CD40配體的具治療效果的試劑(Mohan等，免疫學雜志，154，第1470-1480頁(1995))，使用阻斷CD40/CD40配體相互作用的單克抗體可抑制由于體內(nèi)轉(zhuǎn)移了誘導致病性抗體產(chǎn)生的細胞導致的狼瘡加速。而且，用抗體CD40配體抗體短期治療狼瘡小鼠，在抗體被系統(tǒng)清除后的很長時間內(nèi)，對自發(fā)疾病有持續(xù)且有利的影響。實驗表明甚至在治療后9個月后，病理性B細胞不能產(chǎn)生抗體，暗示存在可導致長期治療效益的自身免疫記憶B細胞擴展的延遲。正如我們所表明的，體內(nèi)阻斷LTα/β/LTβ-R相互作用抑制抗體應答的產(chǎn)生，改變FDC表型及參與優(yōu)化B細胞記憶的生發(fā)中心的形成，本發(fā)明的LTα/B/LTβ-R封閉劑可用于治療或預防SLE。
針對某些致病性感染因子的正常免疫應答也誘發(fā)過分的自身抗體應答從而造成醫(yī)學問題。一個例子是南美洲錐蟲病，在人和實驗動物發(fā)展為伴隨慢性克氏錐蟲感染的炎性心肌病。在參與人Chagas心肌炎的所有可能機制中，心臟特異的自身免疫應答的誘導最近得到了大量實驗的支持。最近的研究(Tibbetts等，免疫學雜志，152，第1493-1499頁(1994))明確在T.Cruzi感染的患心臟疾病的C57B1/6小鼠中產(chǎn)生了心臟抗原特異的抗體。一旦被克氏錐蟲Brazil株感染，C57B1/6小鼠發(fā)展為組織學上與慢性感染的人相似的心肌炎。這些小鼠的抗血清與三種心臟抗原反應，而感染了克氏錐蟲Guayas株的C57B1/6小鼠不發(fā)展為心肌炎也不產(chǎn)生這樣的抗體。這些數(shù)據(jù)表明這些抗體是心肌炎特有的標記。因此可在這樣的嚙齒動物模型中評價LTβ-R封閉劑抑制自身抗體介導的破壞的能力。
由某些感染疾病或其它未知原因產(chǎn)生的自身抗體導致的細胞破壞的另一例子是自發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)。在這種情況下，針對血小板的抗體導致了血小板破壞(由補體或具Fc或C3b受體的吞噬細胞)可導致出血。體內(nèi)抑制這樣的抗體介導的自身免疫反應的治療方法，如本發(fā)明的LT-β-R封閉劑-抑制抗體的產(chǎn)生-也可用于治療或預防這些自身免疫疾病。
針對某些致病性感染因子的正常免疫應答也誘發(fā)過分的超敏反應從而其本身成為醫(yī)學問題。Ⅰ型超敏反應最多的例子是變態(tài)反應。它們是由通過Fc部分與肥大細胞和嗜堿性粒細胞上的受體結(jié)合的IgE抗體介導以引發(fā)釋放介導過敏反應的藥學活性因子。有時認為ITP和古德帕斯徹綜合癥是Ⅱ型反應，Ⅱ型反應是當IgM或IgG抗體與細胞表面抗原結(jié)合然后活化補體級聯(lián)反應時反生的。粒細胞被吸引到活化位點，其顆粒體中釋放的分解酶導致的破壞使細胞破壞。據(jù)認為風濕性關節(jié)炎是Ⅲ型超敏反應的結(jié)果，Ⅲ型超敏反應是由與正常IgG的Fc部分結(jié)合的抗原(在這種情況是風濕因子，IgM自身抗體)免疫復合物介導的。這些免疫復合物參與了關節(jié)的炎癥及此病特有的損壞。因為這些病理部分是由抗體介導的，抑制抗體產(chǎn)生的治療方法，如本發(fā)明的LT-β-R封閉劑-也可用于治療或預防這類疾病。
用LTβ-R封閉劑治療將以有效劑量使用本發(fā)明的組合物治療談到的特定臨床狀況。確定給定應用的優(yōu)選藥物制劑和治療有效劑量屬于本領域的技術，例如，要考慮病人的狀態(tài)和體積，希望的治療程度以及病人對此治療的耐受性。
期望可溶性LTβ-R以1mg/kg劑量適合作為優(yōu)化治療劑量的起點。
可通過體外實驗評價確定治療有效劑量，這種實驗測定包被靶細胞(LTβ-R或LT配體陽性細胞，依封閉劑而定)1-14天所需的LTβ-R封閉劑的濃度。在以往的于1995年7月21日提交的申請人共同未決的美國申請序號08/505,606描述的受體配體結(jié)合實驗可用于監(jiān)控細胞包被反應。用FACS可以活化的淋巴細胞群中分離LTβ-R或LT配體陽性細胞。根據(jù)體外結(jié)合實驗的結(jié)果，可選擇適合的LTβ-R封閉劑濃度范圍在動物中檢驗。
本發(fā)明的可溶性LTβ-R分子、抗LT配體和抗LTβ-R的抗體包括分離純化形式的抗體或復合物及其藥學上可接受的鹽或衍生物，單獨或聯(lián)合使用可通過傳統(tǒng)已接受的施用具有免疫抑制活性的因子的方式來完成。
在這些治療方法中施用的藥物組合物可以各種形式存在，包括例如固體、半固體和液體劑量形式如片劑，丸劑，粉劑，液體溶液或懸液，栓劑；以及可注射和可灌注的溶液。優(yōu)選的方式依賴于預期的施用方式和治療應用。施用方式可包括口腔，腸胃外，皮下，靜脈內(nèi)，病灶內(nèi)或局部施用。
本發(fā)明的可溶性LTβ-R分子，抗LT配體和抗LTβ-R抗體可以，例如，單獨或與促進吸收或穩(wěn)定性的輔因子放入無菌的等滲制劑中。優(yōu)選地，制劑是液體，或是干燥的粉末。例如，本發(fā)明的可溶性LTβ-R分子，抗LT配體和抗LTβ-R抗體可用包含5.0mg/ml檸檬酸-水合物，2.7mg/mL檸檬酸三鈉，41mg/mL甘露醇，1mg/ml甘氨酸和1mg/ml多聚山梨酸酯20的制劑緩沖液稀釋。這種溶液也被干燥；貯存于冷凍條件下，在使用前重新溶于無菌注射用水(USP)。
優(yōu)選地，組合物也可包含本領域眾所周知的傳統(tǒng)的藥學上可接受的載體(見例如Remington藥物科學，第16版，1980,Mac PublishingCompany)。這樣的藥學可接受載體包括其它藥用劑，載體，基因載體，佐劑，賦形劑等，如人血清白蛋白或血漿制品。優(yōu)選地，此組合物以單位劑量形式且通常一天使用一次或多次。
本發(fā)明的藥物組合物可通過微球體，脂質(zhì)體，其它微顆粒運送系統(tǒng)使用或?qū)⒅苿┲糜谑軗p組織或血流內(nèi)、附近或以某種方式使它們相聯(lián)系從而使組合物持續(xù)釋放。合適的持續(xù)釋放載體包括以有形物品如栓劑或微膠囊形式出現(xiàn)的半透性多聚體基質(zhì)。植入性-或微膠囊性持續(xù)釋放基質(zhì)包括polyactides(美國專利號3,773,319；EP58,481)L-谷氨酸和乙基-L-谷氨酸共聚體(Sidman等，生物多聚體，22，第547-56頁(1985))；多聚(2-羥乙基-異丁烯酸)或ethyleme Vinyl acetate(Lanager等，生物醫(yī)學材料研究雜志，15，第167-277頁(1981)；Langer，化學技術，12，第98-105頁(1982))。
可用眾所周知的方法(見如，DE3,218,121；Epstein等，美國國家科學院院報，82，第3688-92頁(1985)；Hwang等，美國國家科學院院報，77，第4030-34頁(1980)；美國專利號4,485,045和4,544,545)，制備包含本發(fā)明的可溶性LTβ-R分子，抗LT配體和抗LTβ-R抗體的脂質(zhì)體。通常，脂質(zhì)體是小的(約200-800A)單層，其中脂含類高于30mol％膽固醇。選擇膽固醇的比例以控制可溶性LTβ-R分子，抗LT配體和抗LTβ-R抗體的最佳釋放速度。
本發(fā)明的可溶性LTβ-R分子，抗LT配體和抗LTβ-R抗體可與包含其它LTβ-R封閉劑，免疫抑制劑或細胞因子的脂質(zhì)體相連以調(diào)節(jié)LTβ-R封閉活性。可用任何已知的交聯(lián)劑如廣泛用于將毒素或化療劑與抗體偶聯(lián)從而定向運送的異雙功能交聯(lián)劑將LTβ-R分子，抗LT配體和抗LTβ-R抗體與脂質(zhì)體相連。運用糖類定向的交聯(lián)劑4-(4-馬來酰苯)丁酸肼(MPBH)可完成與脂質(zhì)體的偶聯(lián)(Duzgunes等，細胞生物學雜志，摘要，增補；16E77(1992))。
包含LTβ-R封閉劑的治療組合物的優(yōu)點本發(fā)明的LTβ-R封閉劑能選擇性地抑制免疫效應物機制?？贵w介導的免疫抑制受多種機制抑制，包括通過影響FDC功能調(diào)節(jié)GC形成。通過調(diào)節(jié)地址素表達從而影響淋巴細胞運輸，抗體和細胞介導的免疫都部分受到抑制。因而，LTβ-R封閉劑可用于治療由于抗體活性或地址素異常表達惡化的狀況。選擇性抑制這樣的免疫介導的反應的能力可用以治療包括各種自身免疫和慢性炎癥狀況在內(nèi)的異常。如上文所討論的，運用對于多種細胞和免疫應答具多重效應的免疫調(diào)節(jié)劑和免疫抑制劑治療這樣的由免疫介導的病理狀況。通常，非特異性的免疫抑制劑需要量很大，常常是導致副作用的細胞毒性劑量。
試劑的抑制抗體應答以減輕病理性免疫應答的能力得到最近的對于小鼠狼瘡性腎炎的研究的支持。在后一個研究中，使用阻斷CD40/CD40L通路的抗體可抑制由于體內(nèi)轉(zhuǎn)移了誘導致病性抗體產(chǎn)生細胞導致的狼瘡性腎炎的加速，在抗體被系統(tǒng)清除后的很長時間內(nèi)，對自發(fā)疾病有持續(xù)且有利的影響。這些數(shù)據(jù)表明本發(fā)明的LTβ-R封閉劑通過抑制導致抗體應答產(chǎn)生的過程可用于抑制組織移和器官移植中的細胞排斥。
根據(jù)受治療的狀況，異?；蚣膊?，本發(fā)明組合物和方法中的LTβ-R封閉劑可被修飾以得到希望的LTβ-R信號傳導水平。可以預想，通過控制LTβ-R封閉劑針對其各自的分子靶所需的濃度和親和力使LTβ-R信號傳導的絕對水平得到精細調(diào)節(jié)。
例如，本發(fā)明中的一個實施方案中，將包含可溶性LTβ-R分子的組合物運用于受試對象?？扇苄缘腖Tβ受體可有效地與細胞表面LTβ受體競爭表面LT配體。與表面LT配體競爭的能力依賴于可溶性和細胞表面LTβ-R分子的相對濃度，以及它們對于配體結(jié)合的相對親和力。
根據(jù)本領域技術人員熟知的標準重組DNA技術，可產(chǎn)生具有突變的可溶性LTβ-R分子，從而提高或降低突變的可溶性LTβ-R與表面LT配體的結(jié)合親和力。用常規(guī)實驗和在此所述的技術，檢測大量的具定點或隨機突變分子作為LTβ-R封閉劑的能力。
相似地，在本發(fā)明的另一實施方案中，針對LTβ受體或LT配體一個或多個亞基的抗體可作為LTβ-R封閉劑。突變，化學修飾或通過其它能改變對受試對象所用抗體有效濃度和活性的方法修飾這些抗體封閉LTβ受體信號傳導的能力。
減弱而不完全抑制LTβ-R信號傳導的能力對于建立或維持降低了的信號傳導的水平，它可支持正常免疫功能而抑制夸大的或不正常的抗體或細胞介導的應答。
小鼠LTα基因的破壞導致外周淋巴器官發(fā)育異常(De Togni等，科學，264，第703-707頁(1994))。這樣的小鼠缺乏淋巴結(jié)和脾濾泡中的T和B細胞豐富區(qū)之間缺乏清析的界限。我們認為這種表型與表面LT誘導的LTβ-R信號傳導的丟失相關，因為調(diào)節(jié)TNF-α活性觀察不到相似的表型。選擇性地或特異阻斷LTβ-R通路的能力可用于治療由與LTβ-R通路中信號的誤表達或過表達相關的慢性炎癥引起的淋巴樣結(jié)構(gòu)的異常發(fā)育。
抗體在針對致病因子的免疫反應中是關鍵介導者。因此，在某些情況下并不希望完全抑制抗體應答。例如，抵抗細胞外細菌如肺炎球菌和嗜血桿菌感染需要由抗體介導。
阻斷LTβ-R信號傳導影響抗體產(chǎn)生水平的能力于對用本發(fā)明的LTβ-R封閉劑治療時有益效果達到最大是重要的。
本發(fā)明的治療方法涉及選擇性地抑制全部或部分依賴于LT-β通路的應答。本權利要求的發(fā)明的特定治療作用依賴于抑制病原機制，還是促進醫(yī)學上希望的過程，這一點對于本領域熟練技術人員顯而易見。因此在各種實施方案中，本發(fā)明的方法涉及使用治療有效量的LT-β-R或LT-β封閉劑。這些方法所用的蛋白可以是全長蛋白，蛋白片段或融合片段。在其它實施方案中，此方法涉及使用可溶性片段，如可溶性β-淋巴毒素受體。在其它優(yōu)選實施方案中，此權利要求的發(fā)明涉及使用針對LT-β-R或LT-β的抗體。本發(fā)明的封閉劑可與治療有效量的產(chǎn)生醫(yī)學上希望效果的第二種復合物同時使用。
例如，在某些治療艾滋病和/或HIV的方法中，人們喜歡同時使用本領域熟悉的另外的抗病毒物質(zhì)。例如，AZT或蛋白酶抑制劑。特別優(yōu)選的本發(fā)明封閉劑，更優(yōu)選地，LTβ-R/IgG融合蛋白可與艾滋病“雞尾酒”治療方案聯(lián)合使用。藥物“雞尾酒”涉及給病人多種藥物以降低病人系統(tǒng)中病毒的數(shù)量。
按照標準操作，本發(fā)明的組合物可制成制劑，如制備于載體中。術語藥學上可接受的載體指一種或多種有機或無機成分，天然的或合成的，它可促進病人使用本發(fā)明封閉劑。本領域技術人員熟知合適的載體。
可用醫(yī)學上可接受的方式使用本發(fā)明的任一組合物。這包括注射，非腸道途徑如靜脈內(nèi)，血管內(nèi)，動脈內(nèi)，皮下，肌肉，腫瘤內(nèi)，腹膜內(nèi)，intraentriculare，硬膜內(nèi)或其它的方式，以及口的，鼻的，眼的，直腸的或局部途徑。本發(fā)明也特別包括通過貯存注射或植入產(chǎn)生的持續(xù)釋放用藥。也可采用局部運送。本領域技術人員很容易確定用藥方式。
用于此申請專利的發(fā)明中的LT通路的抑制劑欲包括在此申請專利的可溶性LT-β-R，抗體的功能衍生物。功能衍生物包括分子片段，變異體，類似物或化學衍生物。分子片段，如本發(fā)明任何抗原起源與分子的任何多肽。這樣分子的變異體指與全長分子或其片段基本相似的天然分子。分子類似物指與全長分子或其片段基本相似的非天然分子。
本發(fā)明封閉劑的變異體與天然因子的區(qū)別在于氨基酸序列，或不涉及序列的方式，或兩者皆具備。當天然分子的一個或多個氨基酸被不同的天然氨基酸，氨基酸衍生物或非天然氨基酸替代時，產(chǎn)生了氨基酸序列變異體。特別優(yōu)選的變異體包括天然蛋白，或天然蛋白的生物活性片段，其序列與野生型序列的區(qū)別在于一個或多個保守氨基酸的替代。這樣的替代為本領域技術人員熟知，典型地對封閉劑的次級結(jié)構(gòu)和疏水性有最小的影響。
在其它實施方案中，具保守性差的氨基酸替代的變異體可產(chǎn)生希望的衍生物，如通過導致電荷，構(gòu)象和其它生物特征的變化。這樣的替代包括，例如，用親水殘基代替疏水殘基，用半胱氨酸或脯氨酸替代另一個殘基，用具小側(cè)鏈的殘基替代具大側(cè)鏈的殘基，或用具凈正電荷的殘基替代具凈負電荷的殘基。當不能確定預測給定替代的結(jié)果時，可用此處公開的方法確定希望特征的存在或缺失以測定此衍生物。
本發(fā)明范圍內(nèi)的變異體包括與本發(fā)明的封閉劑的氨基酸有至8％同源性的蛋白質(zhì)和多肽。更優(yōu)選地，序列同源性至少為90％，或至少95％。為了測定同源性，比較序列的長度一般至少為8個氨基酸序列，通常至少20個氨基酸殘基。本發(fā)明范圍內(nèi)的變異體包括任何封閉劑，它1)具有與封閉劑序列有至少40％同源性的氨基酸序列，也包括2)與本發(fā)明封閉劑序列以最佳排列放在一起時，其80％的半胱氨酸與本發(fā)明封閉劑的半胱氨酸排列。
與本發(fā)明的封閉劑特異結(jié)合的本發(fā)明內(nèi)的因子包括配體和抗體。
下面說明本發(fā)明的LTβ受體，抗LT配體和抗LTβ-R抗體的例子和確定它們的方法。這些例子不應有限制性這些例子是起說明作用而且本發(fā)明只由權利要求書定義。
實施例1制備與免疫球蛋白Fc形成融合蛋白的可溶性人LTβ受體從人12p轉(zhuǎn)錄序列庫中分離的來自體細胞雜種人cDNA克隆的序列(Baens等，基因組，16，第214-18頁(1993)，被輸入基因文庫，后來被確定為編碼人LTβ-R的序列。從1992年，全長人LTβ-R cDNA克隆序列可以得到，其基因庫進入號為LO 4270。
用5’端和3’端分別有NotⅠ和SalⅠ限制性酶位點的引物擴增至穿膜區(qū)LTβ-R的胞外區(qū)(圖1)(Browning等，免疫學雜志，154，第33-46頁(1995))。用NotⅠ和SalⅠ切割擴增片段，純化并將之與用編碼人IgG1 Fc區(qū)的SalⅠ-NotⅠ片段連接到經(jīng)NotⅠ線型化的載體PMDR 901中。最終的載體包含由各自啟動子推動的二氫葉酸還原酶基因和LTβR-Ig融合蛋白。
按照標準方法，將載體電轉(zhuǎn)入CHO dhfr細胞并分離具氨甲蝶呤抗性的克隆。LTβ-R-Ig被分泌到培養(yǎng)基中，用ELISA實驗篩選合成受體融合蛋白水平最高的細胞系。將合成水平的高細胞大量培養(yǎng)并收集條件培養(yǎng)基。用蛋白A瓊脂糖快流速親和層析(pharmaria)分離純的LTβ受體融合蛋白。
實施例2制備與免疫球蛋白Fc形成融合蛋白的可溶性鼠LTβ受體。
將來自兩個部分cDNA分離物的5’NotⅠ/ApalⅠ和3’ApalⅠ/NotⅠ片段連接到PCDNA 3的NotⅠ位點(Invitrogen,San Diego,CA)以制備鼠LTβ-R的全cDNA克隆。此cDNA克隆的序列可通過基因庫進入號U29173得到。與已輸入的基因庫進入號L38423的另一鼠LTβ-R序列比較，未發(fā)現(xiàn)編碼序列的差異。
以全長的m LTβ-R cDNA克隆作為模板，用引物5’AACTGCAGCGGCCGCCATGCGCCTGCCC3’和5’GACTTTGTCGACCATTGCTCCTGGCTCTGGGGG 3’通過PCR擴增合成可溶性鼠LTβ-R/人IgG1融合蛋白。純化并以NotⅠ和SalⅠ切割擴增片段后與人IgG1 Fc的SalⅠ/NotⅠ片段一起連接到NotⅠ線性化并經(jīng)磷酸酶處理的SAB 132以形成JLB122。為了穩(wěn)定表達，將包含鼠LTβ-R-Ig片段的Not盒轉(zhuǎn)到PMDR 901的NotⅠ位點從而形成PSH 001，按照(Browning等，免疫學雜志，154，第33-46頁(1995))所述的方法，將此載體轉(zhuǎn)染到CHO細胞中。用ELISA分析鑒定分泌鼠LTβ-R-Ig的細胞克隆。用蛋白A瓊脂糖快流速層析(pharmacia)從CHO細胞上清中分離純的受體融合蛋白以用于下述的實施例中。
實施例3以LTβ-R-Ig多次注射小鼠后對脾進行免疫組織化學分析4-5周齡的小鼠接受6次LTβ-R-Ig或LFA-3-Ig注射(100ug，腹膜內(nèi))，每周一次，在第6次注射融合蛋白的當天用SRBC免疫這些小鼠。以SRBC攻擊后的第4天；再注射一次LTβ-R-Ig或LFA-3-Ig。在SRBC攻擊后的第10天處死小鼠并收集器官以分析其結(jié)構(gòu)。圖2中的左列代表來自LFA-3-Ig處理動物的脾切片(A,C,E,G,I)；右列代表來自LTβ-R-Ig處理動物的脾切片(B,D,F,H,J)。以生物素化的抗鼠B220標記的和抗小鼠CD40抗體雙染丙酮固定的冷凍脾切片(A和B)，然后分別用相應的堿性磷酸標記的鏈親和素(紫藍，暗染色)和辣根過氧化物酶標記的小鼠抗大鼠Ig(淺棕染色)進行第二次染色。用抗體ER-TR-9(檢測M2M,C和D),MOMA-1(檢測嗜金屬噬細胞，E和F),MECA-367(針對MAdCAM-1,G和H)，以及ER-TR-7(染網(wǎng)狀成纖維細胞，I和J)對另一套冰凍切片染色，然后用辣根過氧化物酶標記的小鼠抗大鼠Ig進行第二次染色(棕色染色)。這些圖片代表了最少6只動物的切片染色。放大倍數(shù)10×。
實施例4LTβ-R-Ig和抗CD40配體對GC形成和FDC染色的影響按實施例3所述的方法，以LTβ-R-Ig或LFA-3-Ig處理動物，以MR1(抗小鼠CD40配體，250ug/注射，腹膜內(nèi))在第-1天，第1天和第三天處理另一組動物，在第0天接受SRBC，第10天處死動物，用生物素標記的商陸凝集素(PNA，上排，A,B和C)或FDC M1(下排，D,E和F)對用LFA-3-Ig(圖3左列；A和D)，或LTβ-R-Ig(中列；B和E)；或MR1(右列，C和F)處理動物的丙酮固定的脾切片進行染色，然后分別用辣根過氧化物酶標記的鏈親和素和辣根過氧化物酶標記的小鼠抗大鼠Ig進行第二次染色(棕色染色)。用箭頭指示A和C中的邊緣區(qū)的PNA染色。用白星指示A中GC的形成；黑箭頭指示D和F中FDC染色。這些圖片代表了至少4只動物的切片染色。放大倍數(shù)10×。
實施例5子宮內(nèi)和出生后連續(xù)用LTβ-R-Ig處理的小鼠淋巴結(jié)中地址素的表達這些實驗使用了定時受孕Balb/c小鼠的子代，在懷孕的第14天和第17天靜脈注射200ug受體-Ig蛋白。出生后，每周腹膜內(nèi)注射一次100ugLTβ-R-Ig,TNF-R 55-Ig或LFA-3-Ig。ELISA測定的表明在整個生命過程中，融合蛋白的水平保持或高于10ug/ml(數(shù)據(jù)未顯示)。圖4系列A,B,G,H是對以LTβ-R-Ig處理小鼠的淋巴結(jié)染色。系列C,D是對以LFA-3-Ig處理的小鼠淋巴結(jié)的染色。系列E,F是對以TNF-R55-Ig處理的小鼠淋巴結(jié)的染色。系列A,C,E,G是用抗體MECA 367對腸系膜淋巴結(jié)染色以檢測粘膜地址素；MAdCAM-1。系列B,D,F,H是用針對外周淋巴結(jié)地址素(PNAdS)的抗體MECA9進行染色。系列G,H是只在子宮內(nèi)經(jīng)LTβ-R-Ig處理的6周齡小鼠淋巴結(jié)，所有圖象的放大倍數(shù)為50×。
實施例6
子宮內(nèi)和出生后經(jīng)LTβ-R-Ig連續(xù)處理小鼠的淋巴結(jié)中淋巴細胞的定位及巨噬細胞標記的表達。按實施例5所述，以LTβ-R-Ig,TNF-R55-Ig，或LFA-3-Ig在子宮內(nèi)和出生后連續(xù)處理小鼠。用針對巨噬細胞表達的標記的抗體或針對B細胞標記B220及T細胞標記CD4的單克隆抗體對LN切片進行染色。用圖象分析鑒定T和B細胞區(qū)的重疊。圖5系列A,D,G分別是用B220/CD4對經(jīng)LTβ-R-Ig,LFA-3-Ig和TNF-R 55-Ig處理小鼠的淋巴結(jié)進行染色。用圖象分析軟件分析熒光圖象。系統(tǒng)B,E,H對唾酸粘附素進行染色，系列C,F,I是對MOMA-1進行染色。
實施例7LTβ-R-Ig處理對針對SRBC的抗體應答的影響，按下面所述以LTβ-R-Ig，人Ig或PBS注射Balb/c小鼠圖6A小鼠接受如圖2，實施例所述的六次注射。在SRBC免疫后第7天(黑棒)和第14天(條形棒)給動物放血。6B動物在第-7天和第0天接受融合蛋白。SRBC在第0天給予；在第7天(黑棒)，第14天(條形棒)和第30天(白棒)給動物放血。6C動物在第0天接受一次融合蛋白，與SRBC免疫的時間相同。在第7天(黑棒)，第14天(條形棒)和第34天(灰棒)收集血。
以血細胞凝集實驗分析血清中SRBC特異的IgM和IgG的滴度。滴度定義為可檢測到血細胞凝集的血清最后稀釋度的倒數(shù)并用底數(shù)為2的對數(shù)代表(1=血清稀釋15倍)。結(jié)果以每組4只不同動物標準方差平均數(shù)代表。
權利要求
1．一種改變動物體液免疫應答的方法，包括以下步驟a)使用包含治療有效量的LT-β-R封閉劑的藥物組合物。
2．根據(jù)權利要求1所述的方法，其中LT-β-R封閉劑選自由可溶性β-淋巴毒素受體、針對LT-β受體產(chǎn)生的抗體和針對表面LT配體產(chǎn)生的抗體組成的群體。
3．根據(jù)權利要求1所述的方法，其中動物是哺乳動物。
4．根據(jù)權利要求3所述的方法，其中哺乳動物是人。
5．根據(jù)權利要求2所述的方法，其中LT-β-R封閉劑包括具有能選擇性地與表面LT配體結(jié)合的配體結(jié)合區(qū)的可溶性β-淋巴毒素受體。
6．根據(jù)權利要求5所述的方法，其中可溶性β-淋巴毒素受體包括人免疫球蛋白Fc結(jié)構(gòu)域。
7．根據(jù)權利要求2所述的方法，其中LT-β-R封閉劑包括針對LT-β受體產(chǎn)生的單克隆抗體。
8．根據(jù)權利要求7所述的方法，其中組合物以足夠覆蓋LT-β-受體陽性細胞的量施用1-14天。
9．根據(jù)權利要求7所述的方法，其中LT-β-R封閉劑包括抗人LT-β-R的單克隆抗體BDA8。
10．根據(jù)權利要求2所述的方法，其中LT-β-R封閉劑包括針對表面LT配體產(chǎn)生的單克隆抗體。
11．根據(jù)權利要求10所述的方法，其中組合物以足夠覆蓋表面LT配體陽性細胞的量施用1-14天。
12．根據(jù)權利要求10所述的方法，其中抗體是針對LT配體的亞基產(chǎn)生的。
13．根據(jù)權利要求12所述的方法，其中LT-β-R封閉劑包括抗人LT-β的單克隆抗體B9。
14．根據(jù)權利要求10所述的方法，其中LT-β-R封閉劑包括針對鼠表面LT配體產(chǎn)生的單克隆抗體。
15．權利要求1的方法，進一步包括藥學上可接受的載體或佐劑。
16．根據(jù)權利要求1所述的方法，其中體液免疫應答受到抑制。
17．一種藥物組合物，包含治療有效量的LT-β-R封閉劑和藥學上可接受的載體。
18．根據(jù)權利要求38所述的組合物；其中LT-β-R封閉劑選自由可溶性β-淋巴毒素受體、針對LT-β受體產(chǎn)生的抗體和針對表面LT配體產(chǎn)生的抗體組成的群體。
19．一種抑制LT-β-R信號傳導但不抑制TNF-R信號傳導的方法，包括對處理對象施用有效量的LT封閉劑的步驟。
20．根據(jù)權利要求19所述的方法，其中LT-β-R封閉劑選自由可溶性β-淋巴毒素受體、針對LT-β受體產(chǎn)生的抗體和針對表面LT配體產(chǎn)生的抗體組成的群體。
21．根據(jù)權利要求19所述的方法，其中處理對象包括哺乳動物的一個或多個細胞。
22．根據(jù)權利要求21所述的方法，其中哺乳動物是人。
23．根據(jù)權利要求19所述的方法，其中LT-β-R封閉劑包括具有能選擇性地與表面LT配體結(jié)合的配體結(jié)合區(qū)的可溶性β-淋巴毒素受體。
24．根據(jù)權利要求23所述的方法，其中可溶性β-淋巴毒素受體進一步包含人免疫球蛋白Fc結(jié)構(gòu)域。
25．根據(jù)權利要求19所述的方法，其中LT-β-R封閉劑包括針對LT-β-受體產(chǎn)生的單克隆抗體。
26．根據(jù)權利要求22所述的方法，其中LT-β-R封閉劑包括抗人LT-β-R的單克隆抗體BDA8。
27．根據(jù)權利要求19所述的方法，其中LT-β-R封閉劑包括針對表面LT配體產(chǎn)生的單克隆抗體。
28．一種改變病人免疫復合物和B細胞濾泡結(jié)合的方法，包括給該病人施用一定量的LT-β-R封閉劑。
29．權利要求28的方法，其中所述的病人感染了人免疫缺損病毒。
30．權利要求28的方法，其中所述的封閉劑選自由可溶性LT-β-R，針對LT-β-R產(chǎn)生的抗體，針對表面LT配體產(chǎn)生的抗體組成的群體。
31．權利要求30的方法，其中所述的可溶性LT-β-R具有可選擇性地與表面LT配體結(jié)合的配體結(jié)合區(qū)。
32．權利要求31的方法，其中所述的可溶性受體包含人免疫球蛋白Fc結(jié)構(gòu)域。
33．權利要求28的方法，其中LT-β-R封閉劑包括針對LT-β-R產(chǎn)生的單克隆抗體。
34．權利要求33的方法，其中所述的抗體是抗人LT-β-R的單克隆抗體BDA8。
35．權利要求28的方法，進一步包括藥學上可接受的載體或佐劑。
36．一種治療、預防或清除哺乳動物中人免疫缺損病毒的方法，包括施用含有治療有效量的LT-β-R封閉劑和藥學上有效的載體的藥物組合物這一步驟。
37．權利要求36的方法，其中LT-β-R封閉劑選自由可溶性β-淋巴毒素受體、針對LT-β-R產(chǎn)生的抗體和針對表面LT配體產(chǎn)生的抗體組成的群體。
38．權利要求37的方法，其中封閉劑包括具有能選擇性地與表面LT配體結(jié)合的配體結(jié)合區(qū)的可溶性β-淋巴毒素受體。
39．權利要求38的方法，其中可溶性受體包含人免疫球蛋白Fc結(jié)構(gòu)域。
40．權利要求36的方法，其中LT-β-R封閉劑包括針對LT-β-R產(chǎn)生的單克隆抗體。
41．權利要求40的方法，其中封閉劑包括抗人LT-β-R的單克隆抗體BDA8。
42．權利要求36的方法，其中封閉劑包括針對表面LT配體產(chǎn)生的單克隆抗體。
43．權利要求36的方法，進一步包括同時施用其它抗病毒劑。
44．權利要求28的方法，其中B細胞是小結(jié)樹突細胞。
45．一種治療移植排斥的藥物組合物，包含治療有效量的LT-β-R封閉劑和治療有效量的CD40L封閉劑。
46．權利要求45的組合物，其中LT-β-R封閉劑是LT-β-R/IgG，而CD40L封閉劑是抗CD40L的化合物。
47．一種治療AIDS或HIV的藥物組合物，包含AZT、蛋白酶抑制劑和LT-β-R封閉劑。
48．權利要求47的組合物，其中封閉劑是LT-β-R/IgG融合蛋白。
49．權利要求46的組合物，其中抗CD40L的化合物是單克隆抗體。
50．權利要求49的組合物，其中抗體是5c8。
全文摘要
包含阻斷β－淋巴毒素受體信號傳導的“β－淋巴毒素受體封閉劑”并用于改變免疫學疾病，尤其是抗體介導的免疫應答的組合物和方法。
文檔編號A61P31/00GK1237910SQ9719990
公開日1999年12月8日 申請日期1997年10月24日 優(yōu)先權日1996年10月25日
發(fā)明者J·布朗寧, P·S·霍克曼, P·D·倫納特, F·麥凱 申請人:拜奧根有限公司