專利名稱：加酶洗滌劑組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般涉及加酶洗滌劑和清潔劑領(lǐng)域。更具體地說，本發(fā)明涉及含有具有脂解活性酶的加酶洗滌劑組合物。
已知各種類型的酶作為洗滌劑組合物的添加劑。例如，在文獻(xiàn)中已經(jīng)描述了含有蛋白酶、纖維素酶、淀粉酶、脂肪酶及其各種混合物的洗滌劑組合物，并且市場上已出現(xiàn)幾種這樣的產(chǎn)品。本發(fā)明涉及含有脂解酶或脂肪酶的洗滌劑組合物。這樣的酶可以有助于通過水解三甘油脂中的一個(gè)或多個(gè)酯鍵從織物上除去脂肪污垢。
EP-A-214761(Novo Nordisk)公開了從Pseudomonas cepacia類有機(jī)體得到的脂肪酶，EP-A-258068(Novo Nordisk)公開了從Thermomyces(以前名稱是Humicola)屬有機(jī)體得到的脂肪酶。這兩篇專利申請(qǐng)也描述了這些脂肪酶作為洗滌劑添加劑的應(yīng)用。
EP-A-205208和EP-A-206390(二篇都是Unilever的)提供了另外的含有脂肪酶的洗滌劑組合物的例子，它們公開了一類按照它們的免疫關(guān)系定義的脂肪酶，并描述了在洗滌劑組合物和紡織品洗滌中它們的應(yīng)用。優(yōu)選的脂肪酶是那些從Pseudomonas fluorescens、Pseudomonas gladioli和Chromobacter物種得到的脂肪酶。
EP-A-331376(Amano)描述了一些脂肪酶、它們的應(yīng)用及它們的使用重組DNA(rDNA)技術(shù)的生產(chǎn)方法，并包括一種從Pseudomonas cepacia得到的脂肪酶的氨基酸序列。在WO-A-89/09263和EP-A-218272(二篇都是Gist-Brocades的)中給出了用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)的脂肪酶的另外的例子。
盡管公開了大量的脂肪酶和它們的改進(jìn)，但是，至今已發(fā)現(xiàn)僅僅從Humicola lanuginosa得到的及在Aspergillus Oryzae作為宿主中生產(chǎn)的脂肪酶廣泛用作織物洗滌產(chǎn)物的添加劑。其可以以商標(biāo)Lipolase(TM)從Novo-Nordisk買到。
在化學(xué)和工業(yè)雜志，1990，第183-186頁Henrik Malmos的文章中，Henrik Malmos指出，人們知道在洗滌過程中脂肪酶的活性一般是低的，Lipolase(TM)并不例外。在干燥過程中，當(dāng)織物的水含量減少時(shí)，該酶恢復(fù)了它的活性，脂肪活斑水解。在其后的洗滌周期中，除去該水解的物質(zhì)。這也解釋為什么在第一洗滌周期之后脂肪酶的作用是低的，但在后面的周期中是明顯的。Aaslyng等人(1991)在“Mechanistic studies of proteases and Lipases for the Detergent Industry”(J.Chem Tech.Biotechnol.50，321-330)中也描述了這些發(fā)現(xiàn)。
本申請(qǐng)的發(fā)明人把其作為含有脂肪酶的現(xiàn)有洗滌劑產(chǎn)品的缺點(diǎn)，即當(dāng)用這些產(chǎn)品洗滌在這之前沒有與該洗滌劑產(chǎn)品接觸的織物時(shí)，可以預(yù)計(jì)用脂解酶沒有明顯的優(yōu)越性。
另外，在歐洲和美國，在自動(dòng)洗衣機(jī)的用戶當(dāng)中，使用滾筒干燥機(jī)來干燥洗滌的織物有增長的趨勢。在這些機(jī)器中，濕的衣服通過與熱空氣接觸迅速地干燥。使用滾筒干燥機(jī)可以把在室溫下通常需要干燥6-48小時(shí)的干燥過程減少到少于1小時(shí)。如上所述，在干燥過程中，當(dāng)織物的水含量減少時(shí)，脂肪酶恢復(fù)它的活性。當(dāng)用滾筒干燥機(jī)時(shí)，對(duì)于脂肪酶來講最佳水含量的周期大大縮短。因此，當(dāng)在滾筒干燥機(jī)中包括干燥步驟的洗滌過程中使用含有通常的脂肪酶的洗滌劑產(chǎn)品時(shí)，消費(fèi)者從這樣的產(chǎn)品得到的好處很少。
因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種加酶洗滌劑組合物，該組合物在自動(dòng)洗衣機(jī)中洗滌過程的主要周期中顯示出明顯地脂解活性，因此，當(dāng)其用于洗滌在此之前沒有與該洗滌劑產(chǎn)品接觸的織物時(shí)其將顯示出脂解活性。提供特別適用于與滾筒干燥機(jī)結(jié)合使用的加酶洗滌劑組合物也是本發(fā)明的一個(gè)目的。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種生產(chǎn)在自動(dòng)洗衣機(jī)中的洗滌過程的主要周期中顯示明顯地脂解活性的這樣酶的方法。
現(xiàn)在我們驚奇的發(fā)現(xiàn)存在可用于配制在洗滌過程的主要周期中顯示明顯的脂解活性的洗滌劑組合物的脂解酶。此外，我們已發(fā)現(xiàn)在洗滌過程的主要周期中顯示這樣的脂解活性的能力和用氟代磷酸二異丙基酯(DFP)時(shí)它們的失活性能之間有一種很好的關(guān)系。于是，合適的脂解酶通常可以根據(jù)DFP時(shí)它們失活性能來選擇。特別是發(fā)現(xiàn)真核來源的角質(zhì)酶是在洗滌過程的主要周期中顯示這樣一種脂解作用的合適的酶。
WO-A-88/09367(Genencoy)提出把表面活性劑與基本上純的微生物的角質(zhì)酶混合來配制有效的清潔劑。公開了含有從(原核生物)Pseudomonas putida ATCC 53552得到的角質(zhì)酶的洗滌劑組合物。但是，在更近期的歐洲專利申請(qǐng)EP-A-476915(Clorox)中，公開了同樣的酶(當(dāng)時(shí)稱為脂肪酶)，當(dāng)用通常的方法使用時(shí)，在從織物上除去油垢方面該酶不比其他的脂肪酶更有效。換句話說，不認(rèn)為這樣酶顯示洗滌效果。
WO-A-90/09446(Plant Genetics Systems)描述了從Fusarium solani pisi在大腸桿菌(E.Coli)中克隆和生產(chǎn)真核角質(zhì)酶，并特別提到這種角質(zhì)酶可以用于生產(chǎn)清潔劑，如洗衣用洗滌劑和其他特殊的脂肪溶解的制劑，如化妝組合物和洗發(fā)劑。沒有公開或提出特殊的加酶洗滌劑組合物，因此技術(shù)熟練的人不會(huì)受到啟發(fā)來選擇這種特殊酶以配制用于織物洗滌的洗滌劑組合物。
根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)方面，提供一加酶洗滌劑組合物，包括(a)0.1-50%(重量)活性體系，該體系含有(a1)0-95%(重量)一種或多種陰離子表面活性劑和(a2)5-100%(重量)一種或多種非離子表面活性劑;和(b)每克洗滌劑組合物10-20000LU酶，在洗滌過程的主要周期中該酶能夠顯示出明顯的脂解活性。
根據(jù)本發(fā)明的第二個(gè)方面，提供一種根據(jù)用氟代磷酸二異丙基酯(DFP)酶失活的性能鑒別和選擇在自動(dòng)洗衣機(jī)中在洗滌過程的主要周期中顯示明顯的脂解活性的酶的方法。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供一種生產(chǎn)這樣酶的方法。
(a)表面活性劑體系本發(fā)明的一個(gè)方面是提供一種加酶洗滌劑組合物，含有0.1-50%(重量)活性體系，其依次含有0-95%(重量)一種或多種陰離子表面活性劑和5-100%(重量)的一種或多種非離子表面活性劑。該表面活性劑體系另外可以含有兩性或兩性離子洗滌化合物，但是，由于它們的費(fèi)用比較高，所以通常這是不需要的。
一般，該表面活性劑體系的非離子和陰離子表面活性劑可以選自下列文獻(xiàn)中描述的表面活性劑Schwartz和Perry，“Surface Active Agent”Vol.1，Schwartz，Perry和Berch，Interscience，vol.2;Interscience，1958;由Manufacturing Confectioners Company出版的最近版本的“McCutcheon′s Emulsifiers and Detergents”，或H.Stache，Carl Hauser Verlag，1981，第二版的“Tenside Tanschenbuch”。
可以使用的合適的非離子化合物特別是包括帶有疏水基的化合物與活性氫原子的反應(yīng)產(chǎn)物，例如脂肪醇、酸、酰胺或烷基酚與烯化氧，特別是單獨(dú)的環(huán)氧乙烷或與環(huán)氧丙烷一起的反應(yīng)產(chǎn)物。特定的非離子洗滌劑化合物是C6-C22烷基酚-環(huán)氧乙烷縮合物，一般是5-25EO，即每個(gè)分子5-25個(gè)環(huán)氧乙烷單元，及脂族C8-C18伯或仲直鏈或支鏈醇與環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物，一般5-40EO。
可以使用的合適的陰離子洗滌化合物通常是帶有含約8-22個(gè)碳原子的烷基的有機(jī)硫酸和磺酸的水可溶的堿金屬鹽，所用的術(shù)語烷基包括高級(jí)?；耐榛糠?。合適的合成陰離子洗滌化合物的例子是烷基硫酸鈉和烷基硫酸鉀，特別是通過硫酸化由動(dòng)物脂或椰子油生產(chǎn)的高級(jí)C8-C18醇得到的那些，C9-C20烷基苯磺酸鈉和鉀，特別是直鏈仲C10-C15烷基苯磺酸鈉，和烷基甘油醚硫酸鈉，特別是從動(dòng)物脂或椰子油得到的高級(jí)醇和由石油得到的合成醇的那些醚的硫酸鈉。優(yōu)選的陰離子洗滌化合物是C1-C15烷基苯磺酸鈉和C12-C18烷基硫酸鈉。
也可以用的是表面活性劑，如在EP-A-328177(Unilever)中描述的那些表面活性劑，它們能耐鹽析，在EP-A-070074中描述的烷基聚苷表面活性劑和烷基單苷。
優(yōu)選的表面活性劑體系是陰離子與非離子洗滌活性物質(zhì)的混合物，特別是在EP-A-346995(Unilever)中指出的陰離子和非離子表面活性劑的種類和例子。特別優(yōu)選的表面活性劑體系是C16-C18伯醇硫酸堿金屬鹽與C12-C15伯醇3-7EO乙氧基化物的混合物。
非離子洗滌劑的存在量優(yōu)選的是大于表面活性劑體系10%，例如25-90%(重量)。陰離子表面活性劑的存在量例如可以約為表面活性劑體系的5%-40%(重量)。
(b).酶本發(fā)明的加酶洗滌劑組合物還含有每克洗滌劑組合物10-20000LU，優(yōu)選50-2000LU酶，該酶在洗滌過程的主要周期中可顯示顯著的脂解活性。在本說明書中，LU或脂肪酶單位是按EP-A-258068(Novo Nordisk)的單位定義的。
由于在洗滌過程中的主要周期中顯著的脂解活性或洗滌的效果，就意味著含有酶的洗滌劑組合物能夠在歐洲型的自動(dòng)洗衣機(jī)中，在單一洗滌過程中，就濃度、水硬度、溫度而言使用通常的洗滌條件，能從污染的織物中除去大量的油垢。應(yīng)該記住，在同樣的條件下，通常的市場上可以從Novo Nordisk買到的脂解酶Lipolase(TM)似乎沒有任何對(duì)油垢的有效的洗滌效果。
酶對(duì)油垢的洗滌效果可以用下面的分析方法評(píng)定。用無酶的洗滌劑產(chǎn)品(如下面給出的)預(yù)洗滌含棉33%的新的聚酯/棉試驗(yàn)織物，接著徹底地漂洗。然后將這樣的未污染的織物用橄欖油或其他合適的可水解的油垢弄污。把每一試驗(yàn)織物(重約1g)在100ml聚苯乙烯瓶中的30ml洗液中保溫。洗液含有下面給出的每升1克劑量的洗滌劑產(chǎn)品。將這些瓶子放在裝水的Miele TMT洗衣機(jī)中并用正常的30℃主洗滌程序攪拌30分鐘。把有脂解活性的酶以3LU/ml預(yù)先加到洗液中。對(duì)照組不含任何酶。該洗粉有下列組成(重量%)乙氧基化的醇非離子表面活性劑 9.5硫酸鈉 38.6碳酸鈉 40.4硅酸鈉(Na2O∶Si2O＝2.4) 7.3水 4.2作為非離子表面活性劑，我們用10.5-13EO乙氧基化的C12-C15醇，但是發(fā)現(xiàn)乙氧基化的醇非離子表面活性劑的性質(zhì)可以在很寬范圍內(nèi)變化。
洗滌之后，用冷水徹底漂洗這些織物，并在滾筒干燥機(jī)中用冷空氣干燥，并評(píng)估殘余的脂肪的量。這可以用幾種方法進(jìn)行，通常的方法是在Soxhlet萃取設(shè)備中用石油醚萃取試驗(yàn)織物，蒸出溶劑，并測定殘余的脂肪物質(zhì)作為織物上初始脂肪量的百分?jǐn)?shù)(重量)。
根據(jù)第二個(gè)更敏感的方法，用溴化橄欖油弄臟試驗(yàn)織物(Richards，S.，Morris，M.A.和Arklay，T.H.1968)，Textile Research Journal 38，105-107)。然后，把每一試驗(yàn)織物放在100ml聚苯乙烯瓶中的30ml洗液中保溫。然后把這些瓶子放在裝水的洗衣機(jī)中并用正常的30℃主洗滌程序攪動(dòng)。主洗之后，仔細(xì)把試驗(yàn)織物用冷水漂洗5秒鐘。漂洗之后，立即在干燥機(jī)中用冷空氣干燥試驗(yàn)織物。干燥之后，可以用X-射線熒光光譜法測定織物的溴含量來確定殘留的脂肪的量?？梢源_定脂肪的除去量，其作為開始存在于試驗(yàn)織物上的量的百分?jǐn)?shù)，計(jì)算如下
除去的污物%＝ (溴bw-溴aw)/(溴bw) ×100%其中，溴bw表示洗滌前織物上的溴的百分?jǐn)?shù)，溴aw表示洗滌之后溴的百分?jǐn)?shù)。
評(píng)估酶的活性的另一種方法是按照標(biāo)準(zhǔn)的方法在460nm測定反射率。
按照本發(fā)明，該洗滌劑組合物包括一種酶，該組合物與沒有酶的同樣的洗滌劑組合物相比，可以除去至少多于5%，優(yōu)選至少多于10%的油污(按初始油污計(jì)量)，其用本說明書中介紹的試驗(yàn)方法測定。
確定酶活性的另一種方法是把其與市場上可買到的Lipolase(TM)，即可以從Novo/Nordisk得到的脂肪酶的活性進(jìn)行比較。按照本發(fā)明，用此處所介紹的試驗(yàn)方法，由酶除去的酶油垢與由Lipolase(TM)除去的酶油垢的比值至少3，優(yōu)選至少5。除去的酶油垢的意思是可以歸因于酶的存在除去的污垢，即減去作為本底的在不存在酶時(shí)觀察到的除去的污垢。
既然本申請(qǐng)已經(jīng)公開了可以配制具有明顯洗滌效果的洗滌劑組合物，技術(shù)熟練的人會(huì)很清楚怎樣選擇用于本發(fā)明的合適的酶。但是，我們已發(fā)現(xiàn)一種非常方便的方法來選擇本發(fā)明組合物的合適的脂解酶，該方法是根據(jù)我們發(fā)現(xiàn)的脂解酶的洗滌效果緊密地與用氟代磷酸二異丙基酯(DFP)時(shí)它們的失活性能相關(guān)。一般都知道，這種化合物與脂解酶中的活性部位絲氨酸殘基迅速反應(yīng)，因此其就失去它們的酶活性。我們發(fā)現(xiàn)，被DFP迅速失活的即具有可以使用的活性部位絲氨酸殘基的脂解酶一般有很好的洗滌效果。另一方面，較慢地被DFP失活即具有不可以使用的活性部位的絲氨酸殘基的脂解酶一般沒有或有很少的洗滌效果。我們發(fā)現(xiàn)在室溫下pH為10時(shí)用DFP保溫10分鐘后，顯示出殘留活性小于50%，優(yōu)選小于40%的脂解酶具有很好的洗滌效果。發(fā)現(xiàn)用具有殘留活性小于25%的脂解酶的洗滌效果甚至更好，用具有殘留活性小于15%的脂解酶的洗滌效果最好。DFP失活試驗(yàn)的詳細(xì)情況可以在實(shí)施例中找到。
本發(fā)明的組合物合適的酶可以在酯酶和脂肪酶類中找到，(EC3.1.1.＊，其中＊表示任意數(shù))。
根據(jù)本發(fā)明，顯示洗滌效果的更優(yōu)選型的酶是真核角質(zhì)酶。角質(zhì)酶是酶的小類(EC3.1.1.50)，蠟酯水解酶。這些酶能夠減少角質(zhì)，即酯化的長鏈脂肪酸和在植物中純在的作為葉子和莖的保護(hù)涂層的脂肪醇的網(wǎng)狀物。另外，它們具有一些脂解活性，即它們能水解三甘油脂。因此，可以把它們看作特殊種類的脂肪酶。
脂肪酶的特征是它們呈現(xiàn)界面活化作用。這就意味著在已形成界面或膠束的底物上的酶活性比在完全溶解的底物上的酶活性要高得多。當(dāng)?shù)孜餄舛仍黾拥礁哂诘孜锏呐R界膠束濃度(CMC)并且形成時(shí)，界面活化作用就使得脂解活性突然增加。通過實(shí)驗(yàn)，可以觀察到這種現(xiàn)象，其是酶活性與底物濃度的不連續(xù)的關(guān)系曲線圖。但是，與脂肪酶相反，角質(zhì)酶不顯示任何明顯的界面活化作用。
因?yàn)檫@一特征，即不存在界面活化作用，對(duì)本專利申請(qǐng)來說，我們規(guī)定角質(zhì)酶作為脂解酶，其基本上不顯示界面活化作用。因此，角質(zhì)酶不同于古典的脂肪酶，它們不具有復(fù)蓋催化結(jié)合部位的螺旋形的蓋。
由于它們的脂肪降解性能，一般提出角質(zhì)酶作用加酶洗滌劑組合物的組分。例如，WO-A-88/09367(Genencor)提出把表面活性劑與基本上純的微生物角質(zhì)酶混合配制成有效的清潔劑。所公開的是含有一種從Gram陰性細(xì)菌Pseudomonas Putida ATCC 53552得到的(原核生的)角質(zhì)酶的洗滌劑組合物。但是，如上所述，在較近期的歐洲專利申請(qǐng)EP-A-476915(Clorox)中，公開了同樣的酶(后來稱為脂肪酶)，當(dāng)用常規(guī)方法使用時(shí)，在從織物上除去油垢方面，與其他脂肪酶比較，其沒有更好的作用。
已經(jīng)從Fusarium solani pisi克隆出角質(zhì)酶基因并已測定順序(Ettinger等，(1987)，Biochemistry 26，7883-7892)。WO-A-90/09446(Plant Genetics Systems)描述了在大腸桿菌(E.Coli.)中克隆和生產(chǎn)這種基因。在含水和非水介質(zhì)中該角質(zhì)酶可以有效地催化酯的水解和合成，但是，在角質(zhì)酶和底物之間不存在和存在界面。根據(jù)它的一般的穩(wěn)定性，提出這種角質(zhì)酶可以用于生產(chǎn)清潔劑，如洗衣用洗滌劑和其他特殊的脂肪溶解的制劑，如潤膚組合物和洗發(fā)劑。以經(jīng)濟(jì)可行的方式生產(chǎn)這種酶的方法沒有公開，二者都不是含該角質(zhì)酶的特殊的加酶洗滌劑組合物。
可以從許多來源如植物(例如花粉)、細(xì)菌和真菌得到角質(zhì)酶。用于本發(fā)明的角質(zhì)酶選自真核角質(zhì)酶類。這樣的真核角質(zhì)酶可以從各種來源如植物(例如花粉)或真菌得到。
(真核)真菌角質(zhì)酶類好像包括具有不同特性即葉特性和莖特性的兩個(gè)家族。具有葉特性的角質(zhì)酶往往有酸性或中性pH最佳值，而具有莖特性的角質(zhì)酶往往有堿性pH最佳值。具有堿性pH最佳值的角質(zhì)酶更適用于堿性助劑的洗滌劑組合物，如重役織物洗粉和洗液。有酸性到中性pH最佳值的角質(zhì)酶更適合于輕役產(chǎn)品或漂洗調(diào)理劑，但是也適合于工業(yè)清潔產(chǎn)品。
在下面的表Ⅰ中，列出了四種不同的莖特性角質(zhì)酶，同時(shí)列出了它們的pH最佳值。
表Ⅰ具有莖特性的角質(zhì)酶的例子 pH最佳值Fusarium solani pisi 9Fusarium roseum culmorum 10Rhizoctonia solani 8.5Alternaria brassicicola(PNBase Ⅰ) 9在本發(fā)明中特別優(yōu)選的是可以從野生的Fusarium Solani Pisi(Ettinger等，1987)得到的角質(zhì)酶。當(dāng)用于合適的洗滌劑組合物中時(shí)，這種角質(zhì)酶顯示明顯的洗滌效果。
本發(fā)明另外優(yōu)選的是比從Fusarium solani pisi得到的對(duì)其具有高度同系現(xiàn)象的氨基酸序列的角質(zhì)酶。例子是從Colletotrichum capsici，Colletotrichum gloeosporiodes和Magnaporthe grisea得到的角質(zhì)酶。
不適于本發(fā)明的是Humicola lanuginosa脂肪酶，其在EP-A-305216(Novo Nordisk)中作了描述，其是以Lipolase(TM)可從市場賣到的。但是，可以想像到，這種酶可以用rDNA技術(shù)改性，這樣，在洗滌過程的主要周期中其也顯示出明顯的脂解活性。這樣的改性會(huì)影響脂肪酶的結(jié)構(gòu)。因此，需要進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以找到該酶的結(jié)構(gòu)的不可避免的損壞和活性方面的優(yōu)點(diǎn)之間的平衡。一般優(yōu)選的改性是其不影響活性部位周圍電荷太多。
本發(fā)明的脂解酶可以以任何合適的形式，即以顆粒組合物的形式、酶的漿液的形式或與載體物質(zhì)結(jié)合的形式(例如在EP-A-258068中和Novo Nordisk的Savinase(TM)和lipolase(TM)產(chǎn)品)有效地加入到洗滌劑組合物中。把酶加到液體洗滌劑產(chǎn)品中的一種好的方式是以在乙氧基化的醇非離子表面活性劑中含有0.5-50%(重量)的酶的漿液的形式，例如在EP-A-450702(Vnilever)所描述的。
用于本發(fā)明的洗滌劑組合物中的酶可以通過克隆酶的基因成為一種合適的生成有機(jī)物，如Bacilli或Pseudomonaceae，酵母如Saccharomyces、Kluyveromyces、Hansenula或Pichia或真菌如Aspergillus來生產(chǎn)。
產(chǎn)生微生物的天然產(chǎn)生的角質(zhì)酶通常是植物病原體，這些微生物不是非常適合作為角質(zhì)酶基因的宿主細(xì)胞，因此，(原)角質(zhì)酶編碼基因就整合到rDNA載體上，可轉(zhuǎn)移到rDNA技術(shù)的優(yōu)選的宿主微生物中。為此，可以用基本類似于WO-A-90/09446中所描述的rDNA載體那樣的rDNA載體。
為了改善發(fā)酵過程的產(chǎn)率，編碼角質(zhì)酶的基因應(yīng)該轉(zhuǎn)移到在便宜的培養(yǎng)基中快速生長的微生物中，并且能夠合成及分泌大量的酶。按照本發(fā)明，這樣的合適的改善的rDNA(宿主微生物)是細(xì)菌，其中包括Bacilli，Corynebacteria，Staphylococci，和Streptomyces，或低級(jí)真核生物如Saccharomyces cerevisiae和有關(guān)的物種，Kluyveromyces marxianus和有關(guān)的物種，Hansenula polymorphagn和有關(guān)的物種，和Aspergillus屬的物種。優(yōu)選的宿主微生物是低級(jí)的真核生物，因?yàn)樵诎l(fā)酵過程中這些微生物能很好的產(chǎn)生并分泌酶，并能夠糖酵解(glycolysate)角質(zhì)酶分子。糖基化作用可能歸于洗滌劑體系中的再質(zhì)酶的穩(wěn)定性。
本發(fā)明也提供遺傳物質(zhì)，遺傳物質(zhì)是從引入真核角質(zhì)酶基因例如由Fusarium solani pisi得到的基因到克隆的rDNA載體中而得到的，使用它們轉(zhuǎn)變新宿主細(xì)胞并表達(dá)新宿主細(xì)胞中的角質(zhì)酶的基因。
本發(fā)明也提供由rDNA技術(shù)制得或改善的多核苷酸，其編碼這樣的角質(zhì)酶，含這樣的多核苷酸的rDNA載體和含這樣的多核苷酸和/或這樣的rDNA載體的rDNA改善的微生物。本發(fā)明也提供相應(yīng)的編碼真核角質(zhì)酶的多核苷酸，例如具有編碼成熟的角質(zhì)酶的堿基序列的多核苷酸，多核苷酸中最后的轉(zhuǎn)移的密碼子接著一個(gè)停頓密碼子并任意地具有恰恰在編碼成熟角質(zhì)酶的核苷酸序列的上游編碼該角質(zhì)酶的前原序列或原序列的核苷酸序列。
在這樣的多核苷酸中，從初始的生物體中得到的角質(zhì)酶編碼核苷酸序列可以以這樣一種方式加以改良，即制得至少一個(gè)密碼子最好是盡可能多的密碼子，使得靜靜地變化形成編碼等量氨基酸殘基并且是被新宿主優(yōu)選的密碼子，因此，在這種宿主細(xì)胞中使用時(shí)提供改善穩(wěn)定性的誘導(dǎo)基因的信使RNA。
編碼原角質(zhì)酶或成熟角質(zhì)酶的核苷酸序列的上游可以確定編碼適合于選擇的宿主的信號(hào)或分泌順序的核苷酸序列。因此，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及一種rDNA載體，在該rDNA載體中已插入一個(gè)編碼角質(zhì)酶或其前體核苷酸序列。
該核苷酸序列例如可以從以下幾種序列得到(a)天然存在的核苷酸序列(例如，編碼由Fusarium solani pisp產(chǎn)生的原前角質(zhì)酶或原角質(zhì)酶的初始的氨基酸序列);
(b)化學(xué)合成的由密碼子組成的核苷酸序列，這些密碼子被新宿主優(yōu)先選擇，并且在新宿主中在穩(wěn)定的信使RNA中形成核苷酸序列，仍然編碼該初始的氨基酸序列;
(c)由在上面的a或b段提到的編碼具有不同氨基酸序列的而且在洗滌劑體系中有優(yōu)異穩(wěn)定性和/或活性的Fusarium solani pisp角質(zhì)酶的一種核苷酸序列得到的遺傳工程核苷酸序列。
概括地說，rDNA載體能夠直接的表達(dá)如上所述的在一種優(yōu)選的最好包含如下組分的宿主中的編碼角質(zhì)酶基因的核苷酸序列(a)編碼成熟的角質(zhì)酶或前角質(zhì)酶或相應(yīng)的前角質(zhì)酶的雙鏈(ds)DNA，其中至少部分前序列恰恰在分泌信號(hào)(選擇的宿主細(xì)胞所優(yōu)選的)的下游已被除去。在部分應(yīng)該被轉(zhuǎn)移的基因不是從密碼子ATG開始的情況下，ATG密碼子應(yīng)該放在前方。該轉(zhuǎn)移的部分基因總應(yīng)該以合適的停止密碼子完結(jié);
(b)位于編碼該角質(zhì)酶(組分(a))的ds DNA正鏈的上游的表達(dá)調(diào)節(jié)子(適于選擇的宿主有機(jī)物);
(c)位于編碼角質(zhì)酶(組分(a)的ds DNA正鏈下游的終止密碼子序列(適于選擇的宿主有機(jī)物);
(d1)促使ds DNA整合或選擇的宿主的基因組的核苷酸序列，或(d2)適于選擇的宿主的原始復(fù)制品;
(e1)任意地一種(營養(yǎng)缺陷型)選擇標(biāo)記物。該營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記物可以用營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記物的編碼區(qū)域和缺陷的啟動(dòng)子組成;
(e2)任意地一種包括在選擇的宿主中的成熟和/或分泌的一種母體形式的角質(zhì)酶中的編碼蛋白質(zhì)的ds DNA序列。
這樣一種rDNA載體也可以移至如以前所定義的多核苷酸的上游和/或下游，另外的序列便于角質(zhì)酶的功能表達(dá)。該營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記物可以由營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記物的編碼區(qū)域與缺陷啟動(dòng)子區(qū)域組成。
本發(fā)明也提供一種生產(chǎn)能夠顯示洗滌作用的脂解酶的方法，其包括發(fā)酵培養(yǎng)人工改性的含有由編碼具有洗滌活性的脂解酶的rDNA技術(shù)制得的基因的微生物的一些步驟，通過分離由發(fā)酵培養(yǎng)液得到的微生物生產(chǎn)的酶或通過從發(fā)酵培養(yǎng)液中分離微生物細(xì)胞生產(chǎn)的酶，分裂分離的細(xì)胞，用物理或化學(xué)的濃縮或提純方法部分提純，由所述培養(yǎng)液或所述細(xì)胞得到的酶。這樣的發(fā)酵可以是通常的間歇式發(fā)酵、進(jìn)料-間歇式發(fā)酵或連續(xù)發(fā)酵。使用的方法的選擇取決于宿主種系，優(yōu)選下流加工方法(已知方法)。
選擇的優(yōu)選條件是這樣的，即通過微生物分泌該酶成發(fā)酵培養(yǎng)液，通過過濾或離心分離除去細(xì)胞之后從培養(yǎng)液中回收該酶。然后，任意地可以濃縮和提純該酶到所需要的程度。
除了特定性能的微生物外，發(fā)酵過程可以按照公知的發(fā)酵方法及通常用的發(fā)酵和下流加工設(shè)備。
另一方面，本發(fā)明提供人工改性的含有具有此處所定義的脂解活性的酶基因并能夠生產(chǎn)由所述基因編碼的酶的微生物。
本發(fā)明還提供帶有編碼此處所介紹的具有洗滌活性的脂解酶的核苷酸序列的重組DNA載體。
(c)其他組分本發(fā)明的加酶洗滌劑組合物另外可以含有5-60%優(yōu)選20-50%(重量)的洗滌助洗劑。這種洗滌助劑可以是任何能夠降低洗滌液中游離鈣離子含量并優(yōu)選提供該組合物具有其他有益性能如產(chǎn)生堿性pH、從織物上除去污垢的懸浮物及軟化織物的白土物質(zhì)的懸浮物的物質(zhì)。
洗滌助洗劑的例子包括沉淀助洗劑，如堿金屬碳酸鹽、碳酸氫鹽、正磷酸鹽;螯合助洗劑，如堿金屬三聚磷酸鹽或次氮基三乙酸鹽;或離子交換助洗劑，如無定形堿金屬硅鋁酸鹽或沸石。
如果本發(fā)明的洗滌劑組合物含有助洗劑物質(zhì)使游離鈣的濃度降低到小于1mM，發(fā)現(xiàn)對(duì)本發(fā)明的洗滌劑組合物的脂解活性是特別有利的。
在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明的加酶洗滌劑組合物也可以包括酶和其他通常用于洗滌劑體系中其他組分的混合物，這些組分包括洗滌劑組合物的添加劑。這些其他組分可以是例如下述文獻(xiàn)中所介紹的很多公知的物質(zhì)的任一種，這些文獻(xiàn)是GB-A-1372034(Unilever)、US-A-3950277、US-A-4011169、EP-A-179533(Procter和Gamble)、EP-A-205208和EP-A-206390(Unilever)、JP-A-63-078000(1988)和1988年6月的Research Disclosure 29056，以及這里所述幾個(gè)說明書的每一個(gè)。本發(fā)明的洗滌劑組合物的制劑也可以通過參考EP-A-407225(Unilever)的例D1-D14加以說明。
在其中也存在蛋白水解酶或蛋白酶的這樣的洗滌劑組合物可以得到特殊的優(yōu)點(diǎn)。EP-A-271154(Unilever)描述了許多適合的具有PI低于10的蛋白酶。在某些情況下與脂肪酶一起用的蛋白酶可以包括文獻(xiàn)中公開的例如BPN型或很多其他型的枯草桿菌蛋白酶，已提出其中某些可用于洗滌劑，例如在下述文獻(xiàn)中公開的突變型蛋白酶，這些文獻(xiàn)是EP-A-130756或EP-A-251446(Genentech)、US-A-4760025(Genencor)、EP-A-214435(Henkel)、WO-A-87/04661(Amgen)、WO-A-87/05050(Genex)、Thomas等，(1986)，Nature 5，316和5，375-376和J.Mol.Biol.(1987)193，803-813.Russel等(1987)，Nature 328，496-500及其他。
本發(fā)明現(xiàn)在將進(jìn)一步用下面的實(shí)施例加以說明。附圖有

圖1A合成的Fusarium Solani pisi角質(zhì)酶基因及指定的寡核苷酸的盒1的核苷酸序列。在該盒序列中表明寡核苷酸轉(zhuǎn)換。下部的盒信息指的是開放的譯讀碼(reading frame)外部的核苷酸部位。
圖1B合成的Fusarium.solani pisi角質(zhì)酶基因及指定的寡核苷酸的盒2的核苷酸序列。在該盒序列中表明寡核苷酸轉(zhuǎn)換。
圖1C合成的Fusarium solani pisi角質(zhì)酶基因及指定的寡核苷酸的盒3的核苷酸序列，在該盒序列中表明寡核苷酸轉(zhuǎn)換。下部的盒信息指的是開放譯讀碼外部的核苷酸部位。
圖1D編碼Fusarium solani pisi前原角質(zhì)酶的合成的角質(zhì)酶基因的核苷酸序列。表明了該角質(zhì)酶前序列、原序列和成熟序列。也表示了用于克隆的部位和寡核苷酸轉(zhuǎn)移。下部的盒信息指的是開放的譯讀碼外部的核苷酸部位。
圖2連接Fusarium solani pisi原角質(zhì)酶編碼序列與編碼大腸桿菌(E.Coli)PhoA前序列的衍生物的序列的DNA片段的合成的核苷酸序列。表明用于克隆的核糖體的結(jié)合部位(RBS)和限制酶部位。也用一個(gè)信息密碼表明編碼的PhoA信號(hào)序列和部分角質(zhì)酶基因的氨基酸序列。
圖3盒8的核苷酸序列，SacI-BclI片段，其編碼轉(zhuǎn)化酶前序列和成熟Fusarium solani pisi角質(zhì)酶的編碼序列的接合點(diǎn)。
圖4通過從PUR2740缺失0.2kb SalⅠ-NruⅠ得到的質(zhì)粒PUR 2741是一種E.Coli-S.cerevisiae穿梭載體，其包含部分PBR322、由2μm質(zhì)粒得到的在酵母細(xì)胞中的原始復(fù)制品、酵母leu2D基因和在控制酵母ga17啟動(dòng)子下，具有植物d-半乳糖苷酶基因編碼部位的接合的酵母轉(zhuǎn)化酶信號(hào)序列。
圖5質(zhì)粒PUR7219是E.Coli-S.Cerevisiae穿梭載體，其包含部分PBR322、由2μm質(zhì)粒得到的在酵母細(xì)胞中的原始復(fù)制品、酵母Leu2D基因和在控制酵母ga17啟動(dòng)子下具有編碼成熟的Fusarium Solani Pisi編碼部位的接合的酵母轉(zhuǎn)化酶信號(hào)序列。
圖6質(zhì)粒PUR2740是E.Coli-S.cerevisiae穿梭載體，其包含部分PBR322、從2μm質(zhì)粒得到的在酵母細(xì)胞中的原始復(fù)制品、酵母Leu2D基因和在控制酵母ga17啟動(dòng)子下具有植物-d-半乳糖苷酶基因編碼部位的接合的酵母轉(zhuǎn)化酶信號(hào)序列。
圖7盒5、6和7核苷酸序列，包括不同類型的exla前序列的編碼序列和成熟Fusarium solani pisi角質(zhì)酶的連接。
圖8通過在PUC19的SalⅠ部位插入Aspergillus niger Var.awamori基因組的DNA的5.3kb SalⅠ片段得到的質(zhì)粒PAW14B。
圖9通過用含有Fusarium solani pisi前原角質(zhì)酶編碼序列的BSP HI-Af1 Ⅱ片段代表在PAW14B中含有的exlA開放譯讀碼的BSPHI-Af1 Ⅱ片段得到的質(zhì)粒PUR 7280。于是，在控制A.niger Var.awamori啟動(dòng)子和終止劑下質(zhì)粒PUR7280含有Fusarium solani pisi前原角質(zhì)酶基因。
圖10通過在PUR7280中誘發(fā)A.nidulans amds和A.niger var.awamori pyrG選擇標(biāo)記物得到的質(zhì)粒PUR7281。
圖11DFP-失活后殘留活性和各種脂解酶除去污垢的百分?jǐn)?shù)的關(guān)系。用下面的縮寫Lipolase(TM，ex Novo Nordisk) lipFusarium Solani Pisi Cutinase (例2) CTCandida cylindracea脂肪酶(sigma) candidaChromobacterium viscosum 脂肪酶(sigma) Chrom豬胰臟脂肪酶(sigma) pancrGenencor脂肪酶(Pseudomonas putida的變種ATCC 53552 GenAKG脂肪酶30B(Amano) AKGSDL 195脂肪酶(Showa Denko) SDL
PS.pseudoalcaligines CBS 473.85脂肪酶 PS.ALK圖12由Fusarium solani pisi得到的角質(zhì)酶和脂解酶(TM)的脂解活性的比較。
圖13Fusarium Solani Pisi角質(zhì)酶和脂解酶(TM)對(duì)不同類型的污垢的單洗效果。
圖14A在幾個(gè)洗滌周期之后測定的在酶量為1LU/ml下，由Fusarium Solani Pisi得到的角質(zhì)酶和脂解酶(TM)的效果。
圖14B同上，在酶含量3LU/ml。
圖14C同上，在酶含量5LU/ml下。
圖14D同上，在酶量10LU/ml下。
圖15在PAS/非離子型制劑中，用Lipolase(TM)、Pseudomonas gladioli脂肪酶和Fusarium solani pisi角質(zhì)酶的多周期洗滌試驗(yàn)。
圖16在另外的PAS/非離型制劑中，用Lipolase(TM)、Pseudemonas gladioli脂肪酶和Fusarium solani pisi角質(zhì)酶的多周期洗滌試驗(yàn)。
圖17同圖16，但是每一周期后重弄臟。
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實(shí)施例1編碼Fusarium solani pisi前原角質(zhì)酶的合成基因的建造。
基本上按照EP-A-407225(Unilever)所述的方法建造編碼Fusarium solani pisi前原角質(zhì)酶的合成基因。根據(jù)公開的Fusarium solani pisi基因的核苷酸序列(Soliday等，(1984)和WD-A-90/09446，Plant Genetic Systems)，設(shè)計(jì)完整的合成DNA片段，其包括一個(gè)編碼Fusarium solani pisi前原角質(zhì)酶多肽的區(qū)域。比較原始的Fusarium solani pisi基因的核苷酸序列，該合成角質(zhì)酶基因包含幾個(gè)核苷酸變種，通過它在不影響編碼的氨基酸序列的基因內(nèi)在方便的部位引入限制酶識(shí)別部位。完整的合成核苷酸基因的核苷酸序列表示于圖1D。
通過結(jié)合三個(gè)起始于合成DNA寡核苷酸的分離的盒完成合成角質(zhì)酶基因的建造。每一個(gè)合成的DNA盒在起點(diǎn)帶有一個(gè)Eco RⅠ部位，在終點(diǎn)帶有一個(gè)Hin dⅢ位點(diǎn)。用一種應(yīng)用的生物體系380A DNA合成器合成寡核苷酸，并用聚丙烯酰胺凝膠電泳提純。為了建造每一個(gè)盒，下面給出其大概的方法。將等摩爾量(50pmol)構(gòu)成給定盒的寡核苷酸混合，在它們的5′一端磷酸化，按照標(biāo)準(zhǔn)方法退火和連接。用Eco RⅠ和Hin dⅢ切割產(chǎn)生的雙鏈DNA分子的混合物，用瓊脂糖凝膠電泳分級(jí)分餾，通過電析從凝膠中回收。用PUC9的2.7kb Eco RⅠ-Hin dⅢ片段連接生成的合成DNA盒，并轉(zhuǎn)換成Escherichia coli。在兩個(gè)方向用合適的寡核苷酸引物鑒別合成盒的序列來完全排列一些克隆的Eco RⅠ-Hin Ⅲ插入物序列。用這種方法建造PUR7207(包括盒1，圖1A)、PUR7208(包括盒2，圖1B)和PUR7209(包括盒3，圖1C)。最后，通過混合PUR7207的2.9kb Eco RⅠ-APa Ⅰ片段與PUR7208的0.2kb APa Ⅰ-NheⅠ片段的和PUR7209的0.3kb Nhe Ⅰ-Hin dⅢ片段，產(chǎn)生PUR7210，結(jié)合該合成角質(zhì)酶基因。這種質(zhì)粒包含一種編碼Fusarium solani pisi(圖10)的完整的前原角質(zhì)酶的開放譯讀碼。
實(shí)施例2Fusarium solani pisi(原)角質(zhì)酶在Escherichia coli中的表達(dá)。
關(guān)于該合成角質(zhì)酶基因，建造一種大腸桿菌的表達(dá)載體，其作用類似于WO-A-90/09446(Plant Genetic Systems)所介紹的情況。設(shè)計(jì)一種結(jié)構(gòu)，其中編碼Fusarium solani pisi原角質(zhì)酶的部分合成基因在合知的大腸桿菌表達(dá)信號(hào)之前，大腸桿菌表達(dá)信號(hào)即(ⅰ)一種可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，(ⅱ)核糖體結(jié)合位點(diǎn)和(ⅲ)信號(hào)序列，該序列提供轉(zhuǎn)移起始密碼，并提供跨越細(xì)胞質(zhì)膜輸出原角質(zhì)酶所需要的信息。
設(shè)計(jì)一種合成連接子(見圖2)，以接合E.Coli phoA信號(hào)序列的衍生物(Michaelis等，1983)成為合成角質(zhì)酶基因的原序列。為了優(yōu)化信號(hào)肽的裂解和原角質(zhì)酶的分泌，該連接子的核苷酸序列是這樣的，即PhoA信號(hào)序列(Thr-Lys-Ala)的三C終端氨基酸殘基變成Ala-Asn-Ala，該角質(zhì)酶原序列(Leu 1，見圖1D)的N-末端氨基酸殘基變成Ala。這種結(jié)構(gòu)保證角質(zhì)酶分泌成為圍膜空隙(見WO-A-90/09446，Plaxt Genetic Systems)。
為了得到這樣一種結(jié)構(gòu)，將含有角質(zhì)酶前序列和部分原序列的69bp Eco RⅠ-Spe Ⅰ片段從PUR7210除去，并用提供E.Coli PhoA前序列的衍生物和改變的角質(zhì)酶原序列的N-末端氨基酸殘基(圖2)的合成DNA連接子序列(Eco RⅠ-SPe Ⅰ片段)代替。生成的質(zhì)粒命名為PUR 7250并用于含有核糖體結(jié)合位點(diǎn)和接合到PhoA信號(hào)序列編碼區(qū)域的原角質(zhì)酶編碼區(qū)域的0.7kb Bam HⅠ-Hin dⅢ片段的離析。這種片段與PMMB67EH的8.9kb Bam HⅠ-Hin dⅢ片段連接(Furste等，1986)，得到PUR7220。在這種質(zhì)粒中，編碼原角質(zhì)酶的合成基因接合到PhoA信號(hào)序列的改變形式中，并置于可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子控制下。
在裝有0.5升IXTB培養(yǎng)基(Tartor和Hobbs 1988)的2升搖瓶中培養(yǎng)包含PUR 7220的大腸桿菌菌株WK6，該培養(yǎng)基的組成為0.017M KH2PO40.017M K2HPO412g/l Bacto-胰化胨24g/l Bacto-酵母提取物0.4% 甘油(v/v)在25℃-30℃，在100μg/ml氨必西林存在下，在劇烈搖動(dòng)(150rpm)下培養(yǎng)培養(yǎng)物一夜，至610nm下光密度(OD)10-12。然后加入IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷)至最終濃度過度10μM，并再繼續(xù)保溫12-16小時(shí)。當(dāng)根據(jù)從培養(yǎng)液取出的樣品分析判斷，可以觀察到所產(chǎn)生的脂解活性的量不再明顯增加時(shí)，通過離心法收集細(xì)胞，并在0℃再懸浮到含有20%蔗糖的緩沖液的原始體積培養(yǎng)液中。通過離心法收集細(xì)胞并再懸浮在原始培養(yǎng)液體積的冰冷水中，使通過滲透震動(dòng)溶解該細(xì)胞。通過離心除去細(xì)胞碎片，無細(xì)胞提取物用乙酸酸化到pH4.8，在4℃放置過夜，并除去生成的沉淀。在這一步，用超濾和冷凍干燥無細(xì)胞提取物，得到純度大于75%基本上無內(nèi)生的脂肪酶的角質(zhì)酶制劑。另外，可以通過將酸化的無細(xì)胞提取物載到SP-交聯(lián)葡聚糖上，在pH8.0用緩沖液洗脫該酶，濃縮的堿性溶液通過合適體積的DEAE纖維素(Whatman DE-52)，并直接用DEAE通過Q-瓊脂糖HP(Pharmacia)柱，來提純角質(zhì)酶到均一性的(即純度大于95%)。用鹽梯度洗脫，得到一般總產(chǎn)率大于75%的均相角質(zhì)酶制劑。
實(shí)施例3Fusarium solani pisi解質(zhì)酶在Saccharomyces cerevisiae中的表達(dá)。
為了表達(dá)在Saccharomyces cerevisiae中的合成Fusarium solani pisi角質(zhì)基因，建造一種表達(dá)載體，其中，編碼成熟角質(zhì)酶的合成基因在S.cerevisiae轉(zhuǎn)化酶(Taussig和Carlsson，1983)的前序列和強(qiáng)的可誘導(dǎo)的ga17啟動(dòng)子(Nogi和Fukasawa，1983)之后，為了制備這樣一種接合物的合成的角質(zhì)酶基因，合成一種接合體片段，其中轉(zhuǎn)化酶前序列的編碼序列接合到編碼成熟角質(zhì)酶的N-末端的序列上?；旧先鐚?shí)施例1所述(盒8，見圖3)，接合該片斷作為在PUC9中的Eco RⅠ-Hin dⅢ盒，產(chǎn)生PUR7217，質(zhì)粒PUR7210和PUR7217轉(zhuǎn)化成E.Coli JM110(一種缺乏dam甲基化酶活性的菌珠)，并將PUR721的2.8kb Bcl Ⅰ-Hin dⅢ片段與PUR7210的0.6kb Bcl Ⅰ-Hin dⅢ片段連接，生成PUR7218，其中編碼成熟角質(zhì)酶多肽的核苷酸序列與部分S.cerevisiae轉(zhuǎn)化酶前序列編碼區(qū)域接合。
通過分離PUR2740的8.9kb Nru Ⅰ-SalⅠ片段用Klenow聚合酶充填在SalⅠ多孔，并重復(fù)循環(huán)該片段，就從PUR 2740(Verbakel，1991，見圖6)得到表達(dá)載體PUR2741(見圖4)。PUR2741的7.3kb SacⅠ-Hin dⅢ片段與PUR7218的0.7kb SacⅠ Hin dⅢ片段接合，產(chǎn)生PUR7219(見圖5)。任意地將S.cerevisiae polⅡ終止劑放在角質(zhì)酶基因的后面，在Hin dⅢ位點(diǎn)，其原來基本不是角質(zhì)酶基因的有效的表達(dá)。E.Coli-S.cerevisiae穿梭質(zhì)粒PUR7219在含有2μ質(zhì)粒(Cir+菌株)的S.cerevisiae菌珠中含有一種原始復(fù)制品，S.cerevisiae Leu2基因的缺乏啟動(dòng)子形式允許在S.cerevisiae Leu2-菌株中選擇大量復(fù)制轉(zhuǎn)化體，編碼成熟部分的Fusarium solani pisi角質(zhì)酶的合成基因可以在嚴(yán)格控制下連到S.cerevisiae轉(zhuǎn)化酶前序列上，可誘導(dǎo)S.cerevisiae ga17啟動(dòng)子。
把與菌株YT6-2-1L(Erhart和Hollenberg，1987)相同的S.cerevisiae菌株SUSO(a，Ciro，Leu2，his4，Canl)與2μ S.cerevisiae質(zhì)粒和PUR7219的等摩爾混合物用對(duì)酵母細(xì)胞電沉積(electroporation)的標(biāo)準(zhǔn)的方案共同轉(zhuǎn)化。對(duì)亮氨酸質(zhì)子移變選擇轉(zhuǎn)化體，并從許多轉(zhuǎn)化體中分離全部DNA。所有的轉(zhuǎn)化體的似乎含有2μ質(zhì)粒和PUR7219，舉例來說，當(dāng)以高復(fù)制數(shù)存在時(shí)由于同時(shí)存在2μ酵母質(zhì)粒，含在PUR7219上的Leu2基因的啟動(dòng)子缺陷形式僅僅可以功能性補(bǔ)充Leu2缺陷菌株。通過在完全培養(yǎng)基中培育40多代，接著在選擇培養(yǎng)基和完全固體培養(yǎng)基中平板復(fù)制培養(yǎng)來處理PUR7219質(zhì)粒的一種轉(zhuǎn)化體，產(chǎn)生S.cerevisiae菌株SU51(a，Cir+，Leu2，His4，Can1)。
在1升含有0.2升MM培養(yǎng)基的搖瓶中培養(yǎng)含有PUR7219的S.cerevisiae菌株SU51，該培養(yǎng)基的組成為無氨基酸的酵母氮堿(yNB) 6.7g/l組氨酸 20mg/l葡萄糖 20g/l在劇烈震動(dòng)(150rpm)和在30℃培養(yǎng)培養(yǎng)物一夜，到在601nm下光密度(OD)2-4。通過離心法收集細(xì)胞并再懸浮于2升搖瓶中的1升yPGAL培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基組成為酵母提取物 10g/lbacto-蛋白胨 20g/l半乳糖 50g/l再繼續(xù)培育12-16小時(shí)。接規(guī)定的間隔從培養(yǎng)物中取樣，并離心除去生物量。用橄欖油作為底物，用滴定分析法分析上清液的角質(zhì)酶活性。將100和200μl之間的濾液的每一樣品加入到5.0ml脂肪酶底物(sigma，含有橄欖油作為脂肪酶的底物)和25.0ml緩沖液(5mM Tris-HCl pH9.0，40mD NaCl，20mM CaCl2)的攪拌的混合物中。在30℃進(jìn)行試驗(yàn)，用Mettler DL25滴定計(jì)用0.05M NaOH自動(dòng)滴定到pH9.0來測定釋放的脂肪酸。得到滴定劑的量對(duì)時(shí)間的曲線。從該曲線的最大斜率計(jì)算樣品中所含的脂肪酶活性的量。一個(gè)單位酶活性定義為在上面規(guī)定的條件下1分鐘內(nèi)從橄欖油釋放1μmol脂肪酸的酶的量。這樣的測定方法本領(lǐng)域熟練的技術(shù)人員是知道的。
當(dāng)產(chǎn)生的角質(zhì)酶活性不再增加時(shí)，用離心法除去細(xì)胞，用乙酸酸化無細(xì)胞提取物到pH4.8，按實(shí)施例1所述方法回收角質(zhì)酶。
實(shí)施例4Fusarium solani pisi角質(zhì)酶在Aspergilli中的表達(dá)。
為了表達(dá)在Aspergillus niger var.awamori中的合成的Fusarium角質(zhì)酶基因，建造一種表達(dá)載體，其中在控制A.niger var.awamori強(qiáng)有力的可誘導(dǎo)的exlA啟動(dòng)子的情況下放置編碼Fusarium solani pisi前原角質(zhì)酶的合成基因(Maat等，1992，de Graaff等，1992)。
由質(zhì)粒PAW14B構(gòu)建前角質(zhì)酶表達(dá)質(zhì)粒(PUR7280)，其沉淀于JM190在Gentra-albureau voor schimmel培養(yǎng)液中的E.coli菌株中(Barrn，The Netherlands，在N°CBS 237.90下，1990年5月31日)，并含有約5.3kb SalⅠ片段，在該片段上定位0.7kb endoxylanaseⅡ(exlA)基因與2.5kb的5′一側(cè)面序列和2.0kb的3′一側(cè)面序列(圖8)。在PAW14B中，exlA編碼區(qū)域被前原角質(zhì)酶編碼區(qū)代替。含有exlA基因的第一密碼子(ATG)的BSPHI位點(diǎn)(5′-TCATGA-3′)和含有exlA基因的終止密碼子(TAA)的AflⅡ位點(diǎn)(5′-CTTAAG-3′)促進(jìn)PUR7280的建造。
如下所述進(jìn)行建造用BSPHI局部切割PAW14B(7.9kb)，從瓊脂糖凝膠中分離線性質(zhì)粒(7.9kb)。其后，用BSMⅠ切割分離的7.9kb片段，其切割有價(jià)值的BSPHⅠ位點(diǎn)的下游的少量核苷酸，除去在其他BSPHⅠ位點(diǎn)的線性質(zhì)粒。在瓊脂糖凝膠上分離該片段，并分離7.9kb BSPHⅠ-BSMⅠ片段。這是用AflⅡ局部切割，并分離形成的7.2kb BSPHⅠ-AflⅡ片段。
將含有編碼Fuserium Solani Pisi前原角質(zhì)酶的完整的開放譯讀碼的PUR7210的0.7kb BSPHⅠ-AflⅡ片段與PAW14B的7.2kb BSPHⅠ-AflⅡ片段接合，生成PUR7280。然后用常規(guī)的共同轉(zhuǎn)化方法可以把建造的載體(PUR7280)轉(zhuǎn)化成霉菌(moulds)(例如Aspergillus niger，Aspergillus niger var.awamori等)，然后通過引入endoxylanaseⅡ啟動(dòng)子表達(dá)前原角質(zhì)酶基因。也可以用常規(guī)選擇標(biāo)記物(例如amds或pyrG，潮霉素等)得到該建造的rDNA載體，可以用生成的rDNA載體轉(zhuǎn)化霉菌產(chǎn)生所需要的蛋白質(zhì)。作為一個(gè)例子，在該表達(dá)載體中引入amds和pyrG選擇標(biāo)記物，生成PUR 7281(圖10)。為此，通過用合成寡核苷酸(5′-AATTGCGGCCGC-3′)轉(zhuǎn)化Eco RⅠ位點(diǎn)(前原角質(zhì)酶基因的AFG密碼子的上游存在1.2kb)成為NotⅠ位點(diǎn)，產(chǎn)生PUR 7282。含有完整的A.nidulans ands基因和A.niger var.awamori pyrG基因的合適的DNA片段與它們自己的啟動(dòng)子和終止劑一起配有側(cè)面NotⅠ位點(diǎn)，并引入PUR 7282的NotⅠ位點(diǎn)，產(chǎn)生PUR7281(圖10)。
作為另一種在Aspergillus niger var.awsamori中表達(dá)該合成的Fusarium solani pisi角質(zhì)酶基因的方法，建造表達(dá)載體，其中編碼該成熟角質(zhì)酶的合成基因不在它自己的前原序列之后，而在A.niger var.awamori exlA的前序列之后。
為了制備用于這種接合的合成角質(zhì)酶基因，合成幾種接受劑片段，其中exlA前序列的編碼序列以不同方式連到編碼成熟角質(zhì)酶的N-端的序列上。在盒5中，通過將exlA前序列接合角質(zhì)酶的原序列上進(jìn)行這種連接。在盒6中，exla前序列與成熟角質(zhì)酶的N-端殘基相接合。盒7與盒6相同，但是這里編碼的成熟角質(zhì)酶多肽的N-端堿基從初始的甘氨酸變成絲氨酸殘基，以便更好的滿足信號(hào)肽裂解的需要。基本上按實(shí)施例1所述，從合成的寡核苷酸組合成盒5.6和7(見圖7)。用盒5代替PUR7210 0.1kb Eco RⅠ-speⅠ片段，生成PUR7287。用盒6和7代替PUR的0.1kb Eco RⅠ-BelⅠ片段，分別生成PUR7288和PUR 7289。對(duì)于每一種質(zhì)粒PUR 7287、PUR 7288和PUR 7289，0.7kb BSP HⅠ-AflⅡ片段與PAW14B的7.2kb BSPHⅠ-AfⅡ片段接合，分別生成PUR 7290、PUR 7291和PUR 7292。
然后用常規(guī)的共轉(zhuǎn)換方法，把建造的rDNA載體轉(zhuǎn)換成霉菌(moulds)(Aspergillus niger，Aspergillus niger var.awamori)并通過引入endoxylanaseⅡ啟動(dòng)子表達(dá)前(原)角質(zhì)酶基因。用常規(guī)的自動(dòng)控制標(biāo)記物(例如amds或pyrG，潮霉素)也可以得到建造的rDNA載體，按該實(shí)施例中對(duì)PUR 7280所述(見上述)用生成的rDNA載體可以轉(zhuǎn)化該霉菌，生產(chǎn)所需要的蛋白質(zhì)。
在下列條件下培養(yǎng)用表達(dá)載體PUR7280、PUR7281、PUR7290、PUR7291、PUR7292轉(zhuǎn)化的Asperigllus菌株(在控制A.niger var.awamori exlA啟動(dòng)子或終止劑的情況下，含有有或沒有相應(yīng)的原序列和角質(zhì)酶信號(hào)序列或exlA信號(hào)序列的Fusarium solani pisi成熟角質(zhì)酶編碼區(qū)域);用孢子接種有400ml合成培養(yǎng)基(pH6.5)的多個(gè)1升搖瓶(最后濃度10E6/ml)。該培養(yǎng)基有下列組成(AW培養(yǎng)基)蔗糖 10g/lNaNO36.0g/lKCl 0.52g/lKH2PO41.52g/lMgSO4·7H2O 0.49g/l酶母提取物 1.0g/lZnSO4·7H2O 22mg/lH3BO311mg/lMnCl2·4H2O 5mg/lFeSO4·7H2O 5mg/lCaCl2·6H2O 1.7mg/lCuSO4·5H2O 1.6mg/lNaH2MoO4·2H2O 1.5mg/lNa2EDTA 50mg/l在30℃，200rpm條件下，在MKx保溫震動(dòng)器中保溫24小時(shí)。用過濾(0.45μm過濾器)收集生長的細(xì)胞，用沒有蔗糖和酵母提取物(鹽溶液)的AW培養(yǎng)基洗滌兩次，再懸浮在50ml鹽溶液中并轉(zhuǎn)移到含有50ml鹽溶液的300ml搖瓶中，向該瓶中加入木糖到最終濃度10g/l(誘發(fā)培養(yǎng)基)。在上述同樣的條件下繼續(xù)保溫過夜。用米來布過濾生成的角質(zhì)酶，除去生物質(zhì)，基本按照實(shí)施例2所述的方法回收角質(zhì)酶。
實(shí)施例5鑒別和分離關(guān)于Fusarium solani pisi角質(zhì)酶基因的基因。
從不同的真菌中分離具有不同的同系度的關(guān)于Fusarium solani pisi角質(zhì)酶的編碼角質(zhì)酶基因。在500ml含有200ml由Hankin和Kolattukudy(1968)所介紹的培養(yǎng)基并附加有0.25%蔗糖的搖瓶中培養(yǎng)真菌培養(yǎng)物，并在28℃于MKx保溫振動(dòng)器(100rpm)中保溫4天。在這時(shí)已消耗了蔗糖，基本上按照Ettinger等人所述加入角質(zhì)水解物誘導(dǎo)角質(zhì)酶產(chǎn)生。在規(guī)定的時(shí)間間隔從培養(yǎng)液中取樣品，并按照標(biāo)準(zhǔn)方法分析存在的脂解活性(見實(shí)施例4)。通常誘發(fā)后大約兩天可以說明脂解活性，在此時(shí)用標(biāo)準(zhǔn)方法過濾收集細(xì)胞。用標(biāo)準(zhǔn)方法洗滌菌絲、在液氮中冷凍并冷凍干燥?；旧习凑誗ambrook等人所述方法(1989)用硫氰酸鈑鹽法分離全部細(xì)胞的RNA制劑，并用氯化銫密度梯度離心法提純。用polyATtract mRNA分離kit(promga)分離polyA(+)mRNA級(jí)分。按照標(biāo)準(zhǔn)方法，用從Fusarium solani pisi角質(zhì)酶基因得到的cDNA片段作為探查物將polyA(t)mRNA級(jí)分用于Northern雜化分析，以檢驗(yàn)關(guān)于角質(zhì)酶基因的表達(dá)。按照提供者的說明，用ZAP cDNA合成的kit(Stratagene，La Jolla)將含有能夠同探查物雜化的物質(zhì)的mRNA的制劑用于合成cDNA，生成但于poly-A區(qū)域側(cè)面的粘性末端的XhoⅠ和在另一端的EcoRⅠ接合的cDNA片段。得到的cDNA片段通過在Lambda 2APⅡ載體(Stratagene La Jolla)中有意義定向的克隆用于建造表達(dá)庫，表達(dá)β-半乳糖苷酶接合的蛋白質(zhì)(Huse等，1988)。這些庫用抗Fusarium solani pisi角質(zhì)酶產(chǎn)生的抗血清篩分。
另外，用角質(zhì)酶特殊引物將該合成的cDNA級(jí)分進(jìn)行pcR-篩分(見表2)。這些引物由幾種真菌角質(zhì)酶基因的氨基酸序列比較得到(Ettinger等，1987)。用由Fusarium solani pisi角質(zhì)酶得到的cDNA作對(duì)照，對(duì)每一組引物都優(yōu)化PCR反應(yīng)條件。用這些cDNA的制劑可能產(chǎn)生特殊的PCR片段，該片段的長度類似于(或大于)在相同條件下用從Fusarium solani pisi角質(zhì)酶得到的cDNA產(chǎn)生的PCR片段的長度，用凝膠電泳提純該P(yáng)CR片段并從凝膠中分離。
作為另一種方法，用角質(zhì)酶特殊引物的PCR篩分技術(shù)也直接用于某些真菌菌株的基因組DNA，用Fusarium solani pisi的基因組DNA作為正的對(duì)照。用這真菌基因組DNA的制劑，可以產(chǎn)生特殊的PCR片段，其長度類似于(或大于)在相同條件下用從Fusarium solani pisi角質(zhì)酶得到的cDNA產(chǎn)生的PCR片段的長度，用凝膠電泳提純該P(yáng)CR片段，并從凝膠中分離。
對(duì)于在表達(dá)庫的方法中或PCR篩分方法(或用cDNA或用基因組DNA)中為正的菌株及許多其他菌株，分離高分子量的基因組DNA?；旧习碋ttinger等(1987)所述方法培養(yǎng)菌株，按cle Graaff等(1988)所述方法分離基因組DNA。用不同的限制酶消化基因組DNA，并且類似的cDNA引入物(表達(dá)庫方法)或PCR片段(PCR篩分方法)或Fusarium solani pisi角質(zhì)酶基因(其他菌株)作為探查物通過Southern雜化進(jìn)行分析，并建造角質(zhì)酶基因的實(shí)體圖。適當(dāng)?shù)奈盏幕蚪MDNA用凝膠電泳分級(jí)分餾，從凝膠中分離適當(dāng)大小的片段并在pUC19中再克隆。用相應(yīng)的cDNA引入物(表達(dá)庫方法)或PCR片段(PCR篩分方法)篩分這些基因組庫，生成含有角質(zhì)酶基因復(fù)制品的克隆。這些基因在兩個(gè)方向定序。通過定序相應(yīng)的cDNA或通過與其他角質(zhì)酶序列比較(Ettinger等，1987)來鑒別Introns。由這樣一種比較也導(dǎo)出成熟角質(zhì)酶多肽的N-末端。用標(biāo)準(zhǔn)的PCR方法，除去introns，立即在開放譯讀碼的下游建造HindⅢ位點(diǎn)，Saccharomyces cerevisiae轉(zhuǎn)化酶基因的前序列的編碼序列(SacⅠ位點(diǎn)在先，比較盒8，圖3)接合到編碼成熟角質(zhì)酶的N-末端的序列上。所得到的含有可以連接到編碼S.cerevisiae轉(zhuǎn)化酶前序列的序列上的角質(zhì)酶基因的SacⅠ-Hin dⅢ片段與PUR7241的7.3kb SacⅠ-Hin dⅢ片段(見圖4)合并轉(zhuǎn)化成S.cereviiae菌株SU51。表達(dá)該真菌角質(zhì)酶并基本上按實(shí)施例4所述方法從培養(yǎng)液中將其回收。
實(shí)施例6用氟代磷酸二異丙基(DFP)的失活試驗(yàn)。
在該試驗(yàn)中，將不同來源的脂解酶用各種濃度的DFP進(jìn)行失活試驗(yàn)達(dá)一固定的時(shí)間周期。失活周期之后，用pH-Stat試驗(yàn)測定剩余活性的百分?jǐn)?shù)。試驗(yàn)條件是使用的試驗(yàn)脂解酶的濃度是在10mM含有20mM CaCl2·2H2O(Merck)的pH10.0的三羥甲基氨基甲烷緩沖液中每ml蛋白質(zhì)0.5mg。將20μlDFP-抑制劑溶液加入0.5ml這種酶溶液(樣品)中，209μl乙醚加到另外的0.5ml酶溶液(空白)中。該DFP-抑制劑溶液是0.5MDFP(氟代磷酸二異丙基酯，F(xiàn)luka)在乙醚(Baker)中。把兩個(gè)樣品在室溫保溫10分鐘，保溫后，用Eppendorf離心機(jī)全速(14000rpm)離心該溶液2分鐘。使用上清液。在樣品和空白試驗(yàn)中，在pH-stat試驗(yàn)中在pH10.0，用脂肪酶底物(Sigma，編號(hào)800-1)測定脂肪酶活性。然后按下述方法計(jì)算殘余活性(RA)RA＝脂肪酶活性(樣品)/脂肪酶活性(空白)＊100%該殘余活性百分?jǐn)?shù)如下所示
脂解酶 殘余活性(%)Lipolase(TM，Novo Nordisk) 86Fusarium solani pisi角質(zhì)酶(實(shí)施例2) 5Candida cylindracea脂肪酶(sigma) 83Chromobacterium viscosum脂肪酶(sigma) 65豬胰脂肪酶(sigma) 60Genencor脂肪酶(pseudomonas putida的變種ATCC 53552，“Lumafast”) 65AKG 脂肪酶30B(Amano) 52SDL 195 脂肪酶(showa Demko) 20PS.pseudoalcaligines CBS 473.85脂肪酶 60實(shí)施例7用上述的Br-橄欖油法測定前面的實(shí)施例中所試驗(yàn)的酶的脂解活性。洗滌溫度是30℃，水硬度是27°FH。在洗滌試驗(yàn)中除去的Br-橄欖油的百分?jǐn)?shù)如下脂解酶 除去的油垢(%)Lipolase (TM，Novo Nordisk) 0Fusarium solani pisi角質(zhì)酶(實(shí)施例2) 19Candida cylindracea脂肪酶(sigma) 0Chromobacterium viscosum脂肪酶(sigma) 1.6豬胰脂肪酶(sigma) 10Genencor 脂肪酶(pseudomonas putida的變種ATCC 53552，“Lumafast”) 11AKG 脂肪酶30B(Amano) 10
SDL 195 脂肪酶(showa Demko) 20PS.pseudoalcaligines CBS 473.85脂肪酶 15借助于線性回歸分析使實(shí)施例6得到的數(shù)據(jù)(用DFP失活后的殘余活性)和在該實(shí)施例中得到的數(shù)據(jù)彼此互相關(guān)聯(lián)。在圖11中用圖形表示這種相互關(guān)系。由該圖可以看出在殘留活性的百分?jǐn)?shù)與給定的脂解酶的洗滌性能之間存在一種很好的相互關(guān)系。因此，我們的結(jié)論是按照實(shí)施例6用DFP培育后殘留活性的百分?jǐn)?shù)可以作為任意來源的脂解酶在洗滌中性能的簡單的預(yù)測試驗(yàn)。
實(shí)施例8Fusarium solani pisi角質(zhì)酶和lLipolase(TM)的脂解活性的比較。
按照實(shí)施例2，通過分離，將從Fusarium solani pisi得到的角質(zhì)酶的脂解活性與市場上由Novo Nordisk A/S得到的Lipolase(TM)，一種Humicola Lanuginosa脂肪酶的脂解活性進(jìn)行比較。
將棉織的和棉編的試驗(yàn)織物被純橄欖油污染。然后將每一試驗(yàn)織物在100ml聚苯乙烯瓶中的30ml洗滌水溶液中培育。在裝水的Miele TMT洗衣機(jī)中，使用通常的30℃主洗滌程序下攪動(dòng)這些瓶子。該洗滌溶液由2g/升(6°FH)的洗粉組成，該洗粉具有以下組成(按%(重量)計(jì))非離子表面活性劑C12C15醇10.5-13EO 9.5硫酸鈉 38.6碳酸鈉 40.4硅酸鈉(Na2O∶Si2O＝2.47 7.3水 4.2在第一次洗滌之后，在室溫下在滾筒干燥機(jī)干燥該試驗(yàn)織物之后立即測定殘留的脂肪。在Soxhlet裝置中用石油醚萃取試驗(yàn)織物。然后通過稱重測定脂肪物質(zhì)的量并表示為在織物上脂肪的百分?jǐn)?shù)，結(jié)果在圖12中給出。
從該圖可以看出，在除去橄欖油方面，與對(duì)照試驗(yàn)比較，Lipolase(TM)沒有什么改進(jìn)，在所示試驗(yàn)中，該作用略顯負(fù)的，但是并不認(rèn)為是明顯的。另一方面，角質(zhì)酶表現(xiàn)出明顯的在洗滌中的效果。
實(shí)施例9Fusarium solani pisi角質(zhì)酶和Lipolase(TM)對(duì)不同類型的污染的單洗效果。
將棉制的試驗(yàn)織物用花生油、油酸鹽油和這二種脂肪50/50的混合物污染。洗滌粉和洗滌條件同實(shí)施例8。單洗之后通過在460nm處測定反射率分析洗滌效果。結(jié)果在圖13中給出。
從該圖可以看出，含有角質(zhì)酶的洗滌劑組合物對(duì)幾種類型的油垢的洗滌效果始終比含Lipolase(TM)的組合物的洗滌效果好。該效果對(duì)純花生油是最明顯的。
實(shí)施例10每次洗滌周期之后，測定Fusarium solani pisi角質(zhì)酶和Lipolase(TM)在不同含量時(shí)的效果。
基本上重復(fù)實(shí)施例9，其試驗(yàn)織物用LS-3油垢污染。這是一種75g花生油、40g乳化劑、125g AS-8和125g奶粉的乳液。第一次洗滌之后，將試驗(yàn)織物再污染并再洗滌，總共重復(fù)4次。在酶含量為1、3、5和10LU/毫升洗液的情況下，在每一洗滌周期之后，測定角質(zhì)酶和Lipolase(TM)的效果，結(jié)果在圖14A-D中給出。
由這些試驗(yàn)，可以得出幾個(gè)結(jié)論。很顯然，在角質(zhì)酶所有的含量下，均顯示明顯的單洗效果。而Lipolase(TM)在最高含量10LU/ml下僅顯示略微單洗效果。對(duì)所有四個(gè)洗滌周期，在第一次洗滌之后角質(zhì)酶都比Lipolase(TM)好。
實(shí)施例11Fusarium solani pisi角質(zhì)酶、脂肪酶ex pseudomonas gladioli和Lipolase(TM)的效果。
將67%聚酯和33%棉的試驗(yàn)織物用下面5g/l洗滌劑產(chǎn)品脫漿，并徹底漂洗。將其剪7.5cm×7.5cm的片并打撮。將10片這樣的未污染的織物(總質(zhì)量約6.5g)放在75ml含有下面給出的洗滌劑產(chǎn)品，劑量為5g/l的洗滌液中在6°FH下洗滌。將脂肪酶ex Pseudomonas gladioli、Lipolase或Fusarium solani pisi角質(zhì)酶預(yù)先加入1LU/ml的洗滌水溶液中。按EP-A-205208和EP-A-206390(都是Unilever)所描述的得到脂肪酶ex pseudomonas gladioli。將洗滌水溶液和織物放在小瓶中，該小瓶放在Lavamat AEGX洗衣機(jī)中，在30℃被攪拌30分鐘。洗滌粉有下面的組成(%重)椰子伯烷基硫酸鹽 5.2非離子表面活性劑C13-C15醇7EO 5.2非離子表面活性劑C13-C15醇3EO 6.6沸石4A 32.00碳酸鈉 11.52硅酸鈉 0.45硬化牛脂皂 2.00在所有情況下初始pH約為10。洗滌結(jié)束后將該織物擠干并在300ml自來水中漂洗約半分鐘。該過程重復(fù)三次。然后再將該織物擠干并在室溫條件下涼干。
將干燥的織物的一半用橄欖油污染并放置三天。通過稱重測定初始大約是織物5%(重)的油污的重量。結(jié)果在圖15中給出。
很顯然，單次洗滌后Lipolase(TM)對(duì)油污的除去不起作用。Lipolase(TM)的效果僅僅是通過重復(fù)洗滌之后才能達(dá)到。第一次洗滌之后，P.gladioli脂肪酶得到少的但是明顯的洗滌效果，在其后的洗滌周期之后有明顯效果。第一次洗滌周期之后，角質(zhì)酶已把污垢去掉，整個(gè)其后的周期都保持這一優(yōu)點(diǎn)。
實(shí)施例12Fusarium solani pisi角質(zhì)酶、脂肪酶ex pseudomonas gladioli和Llipolase(TM)的效果。
用下面的洗滌劑產(chǎn)品，以5g/l的濃度重復(fù)實(shí)施例11。
椰子伯烷基硫酸鹽 1.7非離子表面活性劑C12-C15醇7EO 6.8非離子表面活性劑C12-C15醇3EO 8.5沸石MAP1) 32.00碳酸鈉 11.52硅酸鈉 0.45硬化牛脂皂 2.001)沸石MAP代表“最大鋁沸石P”;其是在EP-A-384070(Unilever)中描述的一類沸石。
結(jié)果在圖16中給出?？梢钥闯?，兩種脂肪酶無論在第一洗滌后，還是在其后的洗滌周期后都沒有除去油污。但是，角質(zhì)酶在第一洗滌周期后已有很大的洗滌效果。
實(shí)施例13Fusarium solani pisi角質(zhì)酶、脂肪酶ex pseudomonas gladioli和Lipolase(TM)的效果。
重復(fù)實(shí)施例12，但是在洗滌周期之間重新污染。結(jié)果在圖17中給出。觀察到在第二洗滌周期之后，Lipolase(TM)和P.gladioli脂肪酶具有一點(diǎn)效果。在單次洗滌中，質(zhì)角酶已把油污的量降低到最少。其后的洗滌周期甚至重新污染之后，油垢都進(jìn)一步減少。
權(quán)利要求
1.一種加酶洗滌劑組合物，包括(a)0.1-50%(重)的表面活性劑體系，該體系含有(a1)0-95%(重)的一種或多種陰離子表面活性劑和(a2)5-100%(重)的一種或多種非離子表面活性劑；和(b)10-20000LU酶/每克洗滌劑組合物，在洗滌過程的主要周期中該酶能夠呈現(xiàn)明顯的脂解活性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的洗滌劑組合物，其中，按本文所述方法分析，以初始油垢量為基準(zhǔn)，與其他不含酶的同樣洗滌劑組合物相比較，該酶至少能夠除去多于5%，優(yōu)選至少多于10%的油垢。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的洗滌劑組合物，其中，按本文所述方法分析，由該酶除去的酶催化的油垢與由Lipolase(TM)除去的酶催化的油垢的比至少為3，優(yōu)選至少為5。
4.根據(jù)任一上述權(quán)利要求的洗滌劑組合物，其中呈現(xiàn)脂解活性的酶是按本文所述用pH10的氟代磷酸二異丙基酯(DFP)在室溫下培育10分鐘后具有殘余活性小于50%，優(yōu)選小于40%，更優(yōu)選小于25%的脂解酶。
5.根據(jù)任一上述權(quán)利要求的洗滌劑組合物，其中該酶是酯酶或脂肪酶。
6.根據(jù)任一上述權(quán)利要求的洗滌劑組合物，其中該酶是真核角質(zhì)酶。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的洗滌劑組合物，其中該酶是真菌角質(zhì)酶。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的洗滌劑組合物，其中該酶是有莖特性的真菌角質(zhì)酶。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的洗滌劑組合物，其中該酶是選自Fusarium solani pisi、Fusarium roseum culmorum、Rhizoctonia solani和Alternaria brassicicola(PNBI)的角質(zhì)酶。
10.根據(jù)權(quán)利要求7的洗滌劑組合物，其中該酶是可以從Fusarium有機(jī)物得到的角質(zhì)酶。
11.根據(jù)權(quán)利要求7的洗滌劑組合物，其中該酶是從Fusarium solani pisi得到的角質(zhì)酶。
12.根據(jù)權(quán)利要求7的洗滌劑組合物，其中該酶與抑制從Fusarium solani pisi衍生的角質(zhì)酶而產(chǎn)生的抗體發(fā)生免疫交叉反應(yīng)。
13.根據(jù)上述任權(quán)利要求的洗滌劑組合物，其中不含有陰離子表面活性劑。
14.根據(jù)權(quán)利要求1-12的洗滌劑組合物，其中陰離子表面活性劑是伯醇硫酸鹽。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的洗滌劑組合物，其中陰離子表面活性劑是C12-C15伯醇硫酸鹽。
16.洗滌污染織物的方法，包括的步驟(a)用根據(jù)上述任一權(quán)利要求的洗滌劑組合物的水溶液洗滌污染的織物，和(b)用熱空氣干燥織物。
全文摘要
本發(fā)明提供一種加酶洗滌劑組合物，其包括(a)0.1—50％(重)的表面活性劑體系，該體系包括(a1)0—95％(重)的一種或多種陰離子表面活性劑和(a2)5—100％(重)的一種或多種非離子表面活性劑；和(b)10—20000LU酶/克洗滌劑組合物，該酶在洗滌過程的主要周期中能夠顯示明顯的脂解活性。
文檔編號(hào)C12N9/18GK1088256SQ9311743
公開日1994年6月22日 申請(qǐng)日期1993年7月30日 優(yōu)先權(quán)日1992年7月31日
發(fā)明者H·T·W·M·范德希, J·F·瓦爾, W·穆斯特斯, J·D·馬盧格, J·克盧基斯特, D·H·A·抗德曼 申請(qǐng)人:尤尼利弗公司