專利名稱：一種蛋白溶菌酶的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種制備蛋白溶菌酶的方法及其在食品制造工業(yè)和醫(yī)藥工業(yè)中的應(yīng)用。
根據(jù)離子交換色譜原理制備溶菌酶的方法已經(jīng)公知，其中均勻化后的蛋白穿過帶有陰離子弱酸羧基樹脂的離子交換柱而后由鹽溶液提取，以吸取于樹脂上的酶，并得出的提洗物經(jīng)過過濾并進(jìn)行多次重結(jié)晶以純化不純物(5)。
已知方法的缺點(diǎn)如下-在吸取期間蛋白和陽離子樹脂之間以及樹脂上吸取的酶跟提洗過程中鹽溶液之間，不能達(dá)到緊密接觸;
-溶菌酶產(chǎn)量低-在原材料中蛋白含量為4.0和5.0克時(shí)，1升蛋白產(chǎn)約2.5克。
-原材料和其它材料的損耗相對地較大-生產(chǎn)1公斤溶菌酶損耗的蛋白為60公斤，陰離子樹脂為0.6公斤。
-生產(chǎn)過程時(shí)間長，每星期僅能實(shí)現(xiàn)四個(gè)生產(chǎn)周期。
另一制備溶菌的方法也已公知，其法為將均勻化后的蛋白(預(yù)先將pH值較正到6.5-7.0范圍之內(nèi))連同羧基粗孔陽離子樹脂混合后連續(xù)攪拌。之后吸附在樹脂上的酶以3.0%的氯化鈉水溶液進(jìn)行提洗，該氯化鈉溶液不斷地加入氫氧化鈉以使最佳pH值保持在所述范圍之內(nèi)。為了分離出酶，將所得提洗物進(jìn)行過濾(2)。
此一公知方法的缺點(diǎn)如下
-吸取期間在蛋白中必需有pH校正劑(鹽酸)且在解吸期間，在提洗劑中必需有氫氧化鈉;
-此方法的時(shí)間過長-酶的吸取要50分鐘;提洗需要25分鐘。
本發(fā)明的任務(wù)是創(chuàng)造一種方法以高產(chǎn)量獲得高純度溶菌酶，此方法實(shí)現(xiàn)時(shí)，蛋白和離子交換樹脂之間的緊密接觸最佳吸取時(shí)間過程縮短，毋需引用另外的pH校正劑，蛋白和樹脂的損耗最小。
本發(fā)明制備蛋白溶菌酶的方法是使其吸附在弱酸粗孔樹脂上，而后用氯化鈉溶液提洗酶，經(jīng)過過濾、干燥得出精酶，其中弱酸粗孔羧基陽離子樹脂上吸取均勻化蛋白是在天然pH值9.0到11.0范圍，以40-50轉(zhuǎn)/分的速率連續(xù)攪拌60分鐘進(jìn)行的。提洗后所制得的酶溶液進(jìn)行熱處理。
所用弱酸粗孔羧基樹脂可以是Wofafit Ca-20。
在氯化鈉溶液提洗后，制得的酶溶液熱處理之前，將pH值降低到3.5，該溶液經(jīng)不斷攪拌加熱到60℃計(jì)30分鐘。
根據(jù)本發(fā)明的方法，天然pH值在9.0至11.0范圍的均勻化蛋白被加入到改性樹脂中并在60分鐘期間以40-50轉(zhuǎn)/分的速率進(jìn)行攪拌。蛋白經(jīng)過烘干且樹脂以去離子水清洗三遍。樹脂上吸取酶的提洗液用的是3.5%氯化鈉溶液并不斷攪拌20分鐘。所得酶溶液酸化到pH值3.5，并在不斷攪拌下，于60℃加熱30分鐘。不純的酶溶液則加以冷卻、通過微過濾澄清、通過超濾濃縮并透析(diaphilated)以除去鹽份。所得濃縮物經(jīng)噴霧干燥或冷凍進(jìn)進(jìn)行干燥。
本發(fā)明的方法，其優(yōu)點(diǎn)如下在蛋白和離子交換樹脂之間實(shí)現(xiàn)了緊密的最佳接觸，縮短了加工時(shí)間，在不加入PH校正劑的情況下避免了酶蛋白結(jié)晶和純化的各耗時(shí)階段;
由于對酶溶液的熱處理，蛋白和樹脂的損耗最小，以高產(chǎn)量制得了高純度3.5克/立升蛋白溶菌酶;
萃取出溶菌酶后所得的蛋白具有持久的物理化學(xué)性質(zhì)、有機(jī)體敏感性質(zhì)和工藝加工性能，適合于繼續(xù)制造蛋白粉。
本發(fā)明的方法可以用下列實(shí)施例予以說明。
以11∶3的比例將水加入3立升弱酸粗孔羧基陽離子樹脂Wafatif CA-20，通過在不斷攪拌下，加入5%氯化鈉溶液使該樹脂-水懸浮液pH達(dá)到8.0-8.5。接著以水清洗直到產(chǎn)生負(fù)堿性反應(yīng)。
天然pH值9.0-11.0的均勻化蛋白10升被加入到改性樹脂中，用時(shí)60分鐘，并以40-50轉(zhuǎn)/分速率攪拌。而后該系統(tǒng)靜置5分鐘以使多余樹脂沉淀。這樣得出9.9升蛋白上清液經(jīng)過烘干。離子交換樹脂用水清洗三次。吸取在樹脂上的酶的洗脫是加入比例為1∶2的3.5%氯化鈉溶液并不斷攪拌20分鐘進(jìn)行的。烘干后的提洗物使用標(biāo)準(zhǔn)鹽酸酸化到pH3.5并加熱到60℃30分鐘且不斷攪拌。所得粗的呈乳白色的提洗物進(jìn)行冷卻，經(jīng)過微過濾加以澄清，接著再超濾及透析過濾，而后使用冷凍干燥方法或噴霧方法使之干燥。
用10立升經(jīng)過處理的蛋白，從1立升原材料中制得平均產(chǎn)量為3.6克的溶菌酶。
按照方法(2)，從1升蛋白中制得2.9克溶菌酶。按照方法(1)，1升蛋白所得溶菌酶平均產(chǎn)量為2.5克。
所制溶菌酶的特征有如下表
1.酶活性 -以糖計(jì)為25，000E2.水含量 -最多6%(105℃ 2小時(shí))3.總含氮量 -16-17%4.氯化物 -最多3.5%5.重金屬 -最多10ppm6.細(xì)菌污染 -最多100/克
權(quán)利要求
1.一種制造蛋白溶菌酶的方法，該方法是通過弱酸粗孔羧基陽離子樹脂吸取蛋白溶菌酶，使用氯化鈉洗提該酶溶液，然后過濾和干燥濃縮物，其特征在于用弱酸粗孔羧酸陰離子樹脂上吸取天然PH值9.0～11.0。均勻化蛋白，條件是不斷以40-50轉(zhuǎn)/分鐘的速率攪拌60分鐘，提洗后所得酶溶液進(jìn)行熱處理。
2.根據(jù)權(quán)利要求1制造溶菌酶的方法，其中弱酸粗孔羧基陽離子樹脂是Wofatif CA-20。
3.根據(jù)權(quán)利要求1和2制造溶菌酶的方法，其特征在于酶溶液的pH值降低到3.5，而后在不斷攪拌下于60℃熱處理30分鐘，冷卻后進(jìn)行微過濾。
全文摘要
按照本發(fā)明的方法，將天然pH值為9.0至11.0均勻化的蛋白用弱酸粗孔陽離子樹脂WofatifCA-20吸取。在不斷攪拌下，用3.5％的氯化鈉溶液洗提吸附的酶。所得酶溶液經(jīng)過酸化、加熱、而后冷卻并經(jīng)微過濾澄清、經(jīng)超濾和透析濃縮。濃縮物通過噴灑或冷凍加以干燥。
文檔編號C12N9/50GK1059559SQ9010751
公開日1992年3月18日 申請日期1990年9月6日 優(yōu)先權(quán)日1990年9月6日
發(fā)明者哈里斯·馬里諾·阿那多夫, 皮卡·尼克洛娃·庫克娃, 米考·希米諾夫·金吉夫, 克里斯多·達(dá)雅克夫·哈里斯夫, 斯托亞·斯拉夫·斯托亞夫 申請人:阿萬吉德公司