專利名稱：蘄蛇酶注射液及其制備工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種醫(yī)療藥品及其制備工藝，特別適用于血栓患者的治療。
蘄蛇酶系福建醫(yī)學(xué)院蛇毒研究室自蘄蛇毒中分離而得的一種具有抗血栓作用的酶類，由于其抗凝血性質(zhì)類似凝血酶，故通稱為凝血酶樣酶。目前在該領(lǐng)域，國外主要產(chǎn)品有Arain(ancrocl)(紅口蝮蛇毒抗栓酶)和Batronolin(Difibrase)(茅頭蝮蛇毒抗栓酶)，作用和用途基本上和蘄蛇酶類似，但蛇毒資源有限，藥品價(jià)格較貴，專利文獻(xiàn)CN1063041A中公開了“一種蛇毒溶栓素的配方和制備工藝”，該蛇毒溶栓素是由纖溶組分，舒緩組分，抑聚組分，類凝血酶組分組成，該制備工藝是分別將兩種蛇毒的有效組分，經(jīng)分離、純化、再配方制得，由于該配方中含有纖溶組分，混有出血毒或神經(jīng)毒素等，毒性較大，易造成治療性出血或神經(jīng)毒征狀，另外該制備工藝需用兩種蛇毒溶液分別進(jìn)行分離純化，工藝較為復(fù)雜。
本發(fā)明的目的在于提供一種純度高、組分清楚、藥源廣、能克服治療性出血和再血栓等副作用的蘄蛇酶注射液及其制備工藝。
本發(fā)明提出的蘄蛇酶注射液是由三種分子量分別為14、31及66KD的同功酶溶液用0.9%的Nacl稀釋組成，其中三種同功酶含量比例為4∶5∶1，等電點(diǎn)(PI)在4.0-5.0，本發(fā)明蘄蛇酶注射液在體內(nèi)作用機(jī)理為
蘄蛇酶屬凝血酶樣酶(Thrombin-likeenzgmes，TLES)，作用于人體的Aα鍵的16精-17甘鍵，并裂解出A肽，形成(Aα、Bβ、γ)n型纖維蛋白，此種纖維蛋白易受纖溶酶(Plasmin)作用，迅速分解，產(chǎn)生纖維蛋白肽，由腎臟清除出體外，導(dǎo)致血漿纖維蛋白原含量明顯降低，血漿凝血酶作用時(shí)間延長，纖維蛋白降解產(chǎn)物增多，凝血酶樣酶還能阻止凝血酶誘導(dǎo)血小板聚集，對(duì)ADP-Na，膠元及腎上腺素等血小板誘導(dǎo)劑亦同樣有抑制效應(yīng)。本發(fā)明制備工藝如下步驟(a)、將蛇毒溶液低溫離心去沉渣后上柱;
(b)、用葡聚糖凝膠G-75(sephadexG-75)，0.01mol/LTris-Hcl緩沖液(PH8.6)洗脫出A、B、C三個(gè)蛋白峰、棄去無活性的C峰及沉淀部分，得A、B峰，再上DEAE-scphadexA-50層柱分離，0.01mol/lTris-Hcl為洗脫液，加0.0～0.3mol/LNacl直線梯度洗脫;
(c)、分別收集層柱第Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ層;
(d)、將上述三種蛋白峰分別用sephadexG-75純化，并用0.01mol/LTris-HCL緩沖液洗脫兩次，棄去無活性的峰，得到三種同功酶溶液;
(e)、將三種同功酶溶液按比例混合即得到蘄蛇酶溶液;
(f)、用0.9%Nacl稀釋，濾過除菌，待無菌無熱源后罐封安瓶。
本發(fā)明制備的蘄蛇酶注射液，按衛(wèi)生部規(guī)定的方法測(cè)定，8分鐘內(nèi)不出現(xiàn)纖維蛋白凝塊，注射液中精氨酸酯酶活力達(dá)1000μmolTAME/mg·min以上，含蘄蛇酶蛋白質(zhì)為標(biāo)示量的100±15%，在藥理方面，本發(fā)明所制備注射液具有抗凝、降低血漿纖維蛋白原含量，并經(jīng)對(duì)抗血小板聚時(shí)，對(duì)抗動(dòng)、靜脈血栓形成毒理學(xué)方面進(jìn)行急性毒性及長期毒性和特殊毒性測(cè)定，均符合新藥審批的各項(xiàng)要求，本發(fā)明提出制備工藝，步驟明確，順序穩(wěn)定，所用緩沖液恒定，且其離子強(qiáng)度及PH均恒定，使得分離產(chǎn)物恒定提取物品質(zhì)純，適用于大規(guī)模生產(chǎn)。
附

圖1為本發(fā)明制備工藝流程圖現(xiàn)結(jié)合實(shí)例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步地說明取尖吻蝮蛇毒10.0g，用0.01mol/LTris-Hcl緩沖液(PH8.6)50ml溶解，5000轉(zhuǎn)/分低溫離心15分鐘，去沉淀上清液留待上柱;分離載體為DEAE-Sephadex-50)經(jīng)堿-酸-堿處理后，裝柱(5×100cm)，用0.01mol/LTris-Hcl緩沖液(PH8.6)平衡24小時(shí)后，取上述蛇毒溶液上柱，并用同一緩沖液洗脫，用自動(dòng)部分收集器收集洗脫液，洗脫液用紫外分光光度計(jì)，檢測(cè)吸收度;待洗脫出A、B、C三個(gè)蛋白峰，棄去無活性的C峰及沉淀，得A、B峰，再上(DEAE-Sephadex-50)層柱分離，0.01mol/LTris-Hcl緩沖液(PH8.6)為洗脫液，加0.3mol/LNacl直線梯度洗脫，分別收集層柱第Ⅴ、第Ⅵ、第Ⅵ蛋白峰，低溫濃縮，分別用sephadexG-75純化，并用0.01mol/LTris-HCL緩沖液洗脫兩次，棄去無活性的峰，得到三種分子量為14、31及66KD同功酶的純?nèi)芤?，取三種同功酶含量比4∶5∶1或4∶2∶2、3∶5∶2，等電點(diǎn)(PI)在4.0-5.0，混合各組分，得到蘄蛇酶母液，將蘄蛇酶母液經(jīng)6號(hào)垂熔漏斗過濾后，作蛋白質(zhì)含量測(cè)定(用藥典規(guī)定Lowry氏法)，再作凝血酶活力及精氨酸酯酶活力測(cè)定，熱原及過敏反應(yīng)試驗(yàn)，全部合格后，用無菌、無熱源的0.9%Nacl稀釋成150ug/ml溶液，再經(jīng)6號(hào)垂熔漏斗過濾后，灌封安瓶，每支1ml∶1u(150ug)即得。用上述工藝制備的蘄蛇酶母液，也可用無菌、無熱原的0.9%Nacl稀釋成75ug/ml溶液。該注射液使用方法為每日一支，用0.9生理鹽水稀釋成100ml，靜脈滴注，5-7天為一療程，重癥者一療程后，停藥5天，再用第2療程。注意事項(xiàng)用藥前須做過敏試驗(yàn)，用藥期間如發(fā)生過敏，可與蘄蛇酶注射液同時(shí)靜脈內(nèi)注入地塞米松。該注射液生產(chǎn)及貯藏溫度在4-15℃。
權(quán)利要求
1.一種蘄蛇酶注射液，其特征是它由三種分子量分別為14、31及66KD的同功酶組成，蘄蛇酶射液，其含量比例為4∶5∶1，等電點(diǎn)在4.0-5.0，并由0.9%Nacl稀釋成不同規(guī)格的注射液。
2.一種蘄蛇酶注射液制備工藝，其特征是按下述步驟實(shí)現(xiàn)的(a)、將蛇毒溶液低溫離心去沉渣后上柱;(b)、用葡聚糖凝膠G-75(sephadexG-75)，0.01mol/LTris-Hcl緩沖液(PH8.6)洗脫出A、B、C三個(gè)蛋白峰、棄去無活性的C峰及沉淀部分，得A、B峰，再上DEAE-scphadexA-50層柱分離，0.01mol/lTris-Hcl為洗脫液，加0.3mol/LNacl直線梯度洗脫;(c)、分別收集層柱第Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ層;(d)、將上述三種蛋白峰分別用sephadexG-75純化，并用0.01mol/LTris-HCL緩沖液洗脫兩次，棄去無活性的峰，得到三種同功酶溶液;(e)、將三種同功酶溶液按比例混合即得到蘄蛇酶溶液;(f)、用0.9%Nacl稀釋，濾過除菌，待無菌無熱源后罐封安瓶。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蘄蛇酶注射液，其特征是將蘄蛇酶溶液用0.9%Nacl稀釋成150ug/ml。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述蘄蛇酶注射液，其特征是將蘄蛇酶溶液用0.9%Nacl稀釋成75ug/ml注射液。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種蘄蛇酶注射液及其制備工藝，該注射液是由分子量分別為14、31、66KD，等電點(diǎn)在4.0—5.0的三種的三種同功酶，用0.9％NaCl溶液稀釋而成；其制備工藝主要步驟是對(duì)蛇毒溶液進(jìn)行層柱分離，分離出A、B、C蛋白峰后，棄去無活性部分，繼續(xù)純化分離，取其層柱第V、VI、VII層蛋白峰，制得蘄蛇酶溶液，最后用0.9％NaCl稀釋成不同規(guī)格的注射液，本發(fā)明制備的蘄蛇酶注射液純度高，組分清楚。
文檔編號(hào)A61K38/46GK1106699SQ9410100
公開日1995年8月16日 申請(qǐng)日期1994年2月8日 優(yōu)先權(quán)日1994年2月8日
發(fā)明者王晴川, 劉廣芬 申請(qǐng)人:福建省三明制藥廠, 福建醫(yī)學(xué)院