專利名稱：：一種用于分離溶菌酶的親和層析介質(zhì)及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于蛋白純化試劑領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及一種以甲殼素為原料的親和層析介質(zhì)及其制備方法。
背景技術(shù)：
：親和層析是應(yīng)用生物高分子與配基可逆結(jié)合的原理，將配基通過共價(jià)鍵牢固結(jié)合于載體上而制得的層析系統(tǒng)。這種可逆結(jié)合的作用主要是靠生物高分子對(duì)它的配基的空間結(jié)構(gòu)的識(shí)別。常用的生物親和關(guān)系有酶-底物、底物類似物、抑制劑、激活劑、輔因子，抗體-抗原，激素-受體蛋白、載體蛋白，外源凝集素-多糖、糖蛋白、細(xì)胞表面受體，核酸-互補(bǔ)核苷酸序列、組蛋白、核酸結(jié)合蛋白等親和層析中配基與欲分離物吸附作用的大小主要與配基的空間結(jié)構(gòu)有關(guān)，因此可以用分子間相互作用的平衡常數(shù)KD來衡量親和作用強(qiáng)度。但它們的結(jié)合力仍不外乎對(duì)應(yīng)的功能基團(tuán)之間的氫鍵、靜電作用、疏水作用等。所以，除了可改變配基以改變親和層析的作用強(qiáng)度以外，還可以通過改變pH和離子強(qiáng)度的方法來改變配基與生物大分子之間的親和力，從而達(dá)到洗脫的目的。但由于親和層析的多樣性，洗脫的條件常常需要通過實(shí)驗(yàn)來獲得。除此以外，還可運(yùn)用其它配基、抑制劑等物質(zhì)與出層析劑上的配基或生物大分子產(chǎn)生競爭性結(jié)合，達(dá)到洗脫的目的，這種方法被稱為專一性洗脫。專一性洗脫可以獲得很高的分辨能力，但洗脫劑的價(jià)格較高，所以常與普通洗脫配合使用。值得注意的是，在洗脫時(shí)，會(huì)有少許配基與蛋白質(zhì)一同被洗脫下來，因此常在其后加一凝膠層析以除去小分子的配基。溶菌酶的用途相當(dāng)廣泛。在國外，溶菌酶普遍的應(yīng)用在食品的殺菌、保鮮、防腐以及微生物發(fā)酵和生物工程技術(shù)中菌體內(nèi)容物如核酸、蛋白質(zhì)、抗生素、酶等的提取。在醫(yī)藥和臨床上，溶菌酶制成的各種藥物具有抗菌抗病毒、消炎、消腫、增強(qiáng)抗菌素療效等作用。在國內(nèi)，溶菌酶尚未得到充分應(yīng)用，主要是由于國內(nèi)生產(chǎn)溶菌酶的產(chǎn)量低、質(zhì)量差，醫(yī)藥、食品及科研用溶菌酶仍依賴進(jìn)口。隨著食品工業(yè)、微生物工業(yè)和生物工程技術(shù)的迅速發(fā)展，以及溶菌酶在醫(yī)藥領(lǐng)域上的推廣應(yīng)用，人們對(duì)溶菌酶的需求量與日俱增，同時(shí)，對(duì)溶菌酶質(zhì)量的要求也越來越高，因此，許多研究者都在尋找新的溶菌酶分離純化技術(shù)，以提高溶菌酶產(chǎn)品的純度及活性。到目前為止，尚未有報(bào)道將甲殼素作為親和層析介質(zhì)，即配體，用于分離溶菌酶。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種操作簡易、成本低廉并且高效的用于溶菌酶分離的親和層析介質(zhì)。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述介質(zhì)的制備方法。本發(fā)明提供了一種親和層析介質(zhì)，該層析介質(zhì)是堿化后的甲殼素。甲殼素即2-^乙酰氨基-2_脫氧-日-1，4-葡萄糖，是由2-N-乙酰氨基-D-葡萄糖通過P-1，4糖苷鍵聚合而成的直鏈含氮多糖，是與纖維素結(jié)構(gòu)極為相似的天然高分子。本發(fā)明所用的甲殼素可以以目前各類市售產(chǎn)品為原料，例如，sigma公司的(C7170)，以及濟(jì)南海得貝海洋生物工程有限公司，青島海普生物技術(shù)有限公司，濰坊科海甲殼素有限公司等公司的商品。本發(fā)明中，將甲殼素在10-3(TC條件下堿化6-36小時(shí)后，靜置并洗至中性，從而制成層析介質(zhì)。所用堿為氫氧化鈉、氫氧化鉀中的一種或者幾種，甲殼素與堿中0H—的質(zhì)量摩爾比為25-200:1，單位為克/摩爾。較好的，可以將甲殼素堿化靜置后，經(jīng)過過濾再洗滌至中性備用。過濾的方法可以是脫脂紗布過濾，等等。這里洗滌至中性是指洗去吸附在甲殼素表面的堿，從而使其置于水中呈中性，即PH為7左右。更好的，可以在甲殼素堿化后，用酸處理再靜置洗滌至中性備用。所用酸為可以是醋酸、檸檬酸、乙酸等弱酸。濃度為1-5M。經(jīng)處理后，介質(zhì)顆粒能夠迅速沉淀，無絮狀漂浮物，再已低濃度的醋酸洗脫空柱時(shí)，洗脫液280nm吸光值應(yīng)較小。本發(fā)明中，介質(zhì)溶脹(即介質(zhì)得率)計(jì)算方法為將一定質(zhì)量介質(zhì)經(jīng)堿化，過濾、洗凈處理或經(jīng)堿化，過濾、洗凈，冰凍處理后，浸于蒸餾水，置量筒中自然沉降12h，讀取介質(zhì)濕體積V，介質(zhì)溶脹比率=V/介質(zhì)質(zhì)量。本發(fā)明中，介質(zhì)收縮比率計(jì)算方法為將一定體積經(jīng)充分溶脹的介質(zhì)裝柱，用pH6.40的0.02MPBS平衡柱床后，計(jì)算柱體積Va，換用0.1M醋酸溶液平衡柱床，計(jì)算柱體積Vb，介質(zhì)收縮比率=1-Vb/Va。本發(fā)明中，介質(zhì)相對(duì)流速比率測(cè)定方法為在0.05MPa壓力下，測(cè)定單位時(shí)間空床中O.lM醋酸溶液流速v"將相同體積各組介質(zhì)裝柱，使用O.1M醋酸溶液平衡柱床，在0.05MPa壓力下，測(cè)定單位時(shí)間各介質(zhì)流速ve。介質(zhì)相對(duì)流速比率=Vp/vuo本發(fā)明中，介質(zhì)吸附容量比較方法為采用靜態(tài)吸附法量取lml充分溶脹各組介質(zhì)，加入3ml蒸餾水及l(fā)ml的濃度為10mg/ml的雞溶菌酶(c-LYZ)，混勻，待稍沉降，取0.5ml上清液，5000rpm離心10min，取0.4ml上清液，用蒸餾水稀釋至2ml，測(cè)280，吸光度，記為A1;另將原液室溫，靜置6h后，5000rpm離心10min，計(jì)算上清液體積V,取0.5ml上清液，5000rpm離心10min，取0.4ml上清液，用蒸餾水稀釋至2ml，靜置6h，湖lj280nm吸光度，記為A2，AfA,-A"介質(zhì)的吸附容量Qh力「AAXVX介質(zhì)溶脹比率。本發(fā)明中，甲殼素親和介質(zhì)吸水量計(jì)算方法為取真空低溫凍干的甲殼素親和介質(zhì)O.05g，加入O.5ml雙蒸水，室溫溶脹6h后，3000rpm離心30min，計(jì)算上清液體積，并計(jì)算單位質(zhì)量甲殼素親和介質(zhì)吸水量。本發(fā)明中，介質(zhì)得率計(jì)算方法將一定質(zhì)量介質(zhì)經(jīng)堿化，過濾、洗凈處理后，浸于蒸餾水，置量筒中自然沉降12h，讀取介質(zhì)濕體積V,，介質(zhì)溶脹比率-V,/介質(zhì)質(zhì)量；將上述介質(zhì)經(jīng)O.1M醋酸處理后，過濾、洗凈，浸于蒸餾水，置量筒中自然沉降12h，讀取介質(zhì)濕體積V2，介質(zhì)得率=V2/介質(zhì)質(zhì)量。本發(fā)明中，介質(zhì)的損耗比率=1_介質(zhì)得率/介質(zhì)溶脹比率。本發(fā)明中，介質(zhì)的吸附容量Q—yJAAXVX介質(zhì)溶脹比率。另一方面，本發(fā)明提供了上述介質(zhì)的制備方法，即將甲殼素在10-3(TC條件下堿化3分鐘-24小時(shí)后，靜置并洗至中性。本發(fā)明的制備方法中，所用堿為氫氧化鈉、氫氧化鉀中的一種或者幾種。所用堿的濃度可以是1-IOM，用量可以是浴比1:5-20。本發(fā)明的制備方法中，堿化時(shí)間可以是6-18小時(shí)。例如，6小時(shí)，IO小時(shí)，12小時(shí)，15小時(shí)，18小時(shí)，等等。本發(fā)明的制備方法中，甲殼素與堿中0H—的質(zhì)量摩爾比可以是25-200:1，單位為克/摩爾。本發(fā)明的制備方法中，甲殼素堿化靜置后，經(jīng)過過濾再洗滌至中性備用。本發(fā)明的制備方法中，反應(yīng)溫度為15-25'C。例如，15°C，18°C，20°C，25°C等等。也可以是10。C，13°C，28°C,，3(TC等。本發(fā)明的制備方法中，甲殼素堿化后，用弱酸處理再靜置洗滌。所用酸可以是醋酸、檸檬酸、乙酸等弱酸。本發(fā)明的制備方法中，在酸處理時(shí)，加入甲殼素與酸中H+的質(zhì)量摩爾比為25-200:1，單位為克/摩爾。本發(fā)明中，未提及的反應(yīng)條件可根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)情況采用常規(guī)條件進(jìn)行。本發(fā)明采用甲殼素為原料，制備分離純化溶菌酶的親和色譜介質(zhì)。本發(fā)明采用的制備方法簡便易行，成本低廉；甲殼素親和介質(zhì)吸附性專一，流速較快；采用甲殼素親和介質(zhì)純化人溶菌酶，步驟簡單高效，經(jīng)過一次純化，即可從發(fā)酵液中分離到近100%的純度的溶菌酶，純化效率明顯高于離子交換層析。因此，本研究的甲殼素親和介質(zhì)制備工藝可適用于大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說明。實(shí)施例中涉及的主要試劑有30%丙烯酰胺凝膠貯存液取丙烯酰胺29g，亞甲雙丙烯酰胺lg，溶于60ml雙蒸水，定容至100ml，pH小于7.0，置棕色瓶4'C保存。10%過硫酸銨取lg過硫酸銨溶于10ml雙蒸水，4'C保存。1.5MTris-HC1緩沖液(pH8.8):取Tris堿18.16g，充分溶于50ml雙蒸水，用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH至8.0，定容至100ml。lMTris-HC1緩沖液(pH6.8):取Tris堿12.llg，充分溶于80ml雙蒸水，用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH至6.8，定容至100ml。蛋白電泳上樣緩沖液取0.5mol/LTrisCI(pH6.8)5ml，SDSlg，0-巰基乙醇0.6ml,5(F。甘油8ml，0.05M溴酚藍(lán)lml，雙蒸水4.4ml混合。電泳緩沖液取Tris3.03g，甘氨酸14.41g，雙蒸水定容至lml,加SDSlg，攪拌溶解。實(shí)施例中涉及的主要儀器有:蛋白凝膠電泳系統(tǒng)凝膠成像分析系統(tǒng)752紫外可見光分光光度計(jì)美國Bio-Rad公司美國UVP公司上海精密科學(xué)儀器有限公司Agilentseries1100型HPLC分析儀美國Hewlett-Packard公司PHSJ-4A型pH計(jì)上海精密科學(xué)儀器有限公司恒溫?fù)u床上海市離心機(jī)械研究所磁力攪拌器上海精密科學(xué)儀器有限公司凈化工作臺(tái)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司透析袋華美生物工程公司實(shí)施例1堿化對(duì)介質(zhì)性能的影響Al，取5g甲殼素，溶于100ml的蒸餾水中，室溫磁力攪拌6h，靜置6h，備用；A2，取5g甲殼素，溶于100ml的蒸餾水中，室溫磁力攪拌6h，用二層脫脂紗布過濾、洗凈，重新用100ml蒸餾水浸潤，靜置，備用；A3,取5g甲殼素，溶于100ml的10MNaOH溶液中，室溫磁力攪拌，堿化6h后，過濾、洗至中性，浸于蒸餾水中，靜置，備用。結(jié)果具體見表l。表l堿化對(duì)介質(zhì)性能的影響組別形態(tài)顏色介質(zhì)得率(ml/g)收縮比率相對(duì)流比QrhyzAl粒狀米黃10.518.7%7.7%15.6A2粒狀米黃6.734.7%7.8%5.9A3粒狀乳黃6.825.6%10.8%8.6實(shí)施例2稀酸處理對(duì)介質(zhì)性能的影響取5g甲殼素4份，溶于100ml的10顯aOH溶液中，室溫磁力攪拌，堿化6h后，過濾、洗至中性，Cl，處理方法同步驟A3;C2，經(jīng)步驟A3處理后，向介質(zhì)溶液中加入等量pH6.40的0.04MPBS,攪拌5min后，過濾、洗至中性，浸于蒸餾水中，靜置，備用；C3，經(jīng)步驟A3處理后，向介質(zhì)溶液中加入等量0.2M醋酸，攪拌5min后，過濾、洗至中性，浸于蒸餾水中，靜置，備用。結(jié)果具體見表2。表2醋酸處理對(duì)介質(zhì)性能的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>實(shí)施例3NaOH濃度對(duì)介質(zhì)性能的影響取5g甲殼素3份，El，處理方法同D12(見實(shí)施例5);E2，采用5MNaOH溶液堿化，其他處理方法同D12;E3，采用2.5MNaOH溶液堿化，其他處理方法同D12。檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)同上。結(jié)果具體見表3。表3NaOH濃度對(duì)介質(zhì)性能的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>取5g甲殼素三份，F(xiàn)l，溶于50ml的2.5MNaOH溶液中，其他處理方法同E3;F2，溶于100ml的2.5顧aOH溶液中，其他處理方法同E3;F3，溶于200ml的2.5顧aOH溶液中，其他處理方法同E3。檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)同上。結(jié)果具體見表4。表4浴比對(duì)介質(zhì)性能的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>實(shí)施例5堿化時(shí)間對(duì)介質(zhì)性能的影響取5g甲殼素4份，溶于100ml的10MNaOH溶液中，Dll，處理方法同步驟C2，D12，室溫磁力攪拌，堿化12h，其他處理方法同C2;D13，室溫磁力攪拌，堿化18h，其他處理方法同C2;D14，室溫磁力攪拌，堿化24h，其他處理方法同C2。檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)同上。具體結(jié)果見表5。表5堿化時(shí)間對(duì)介質(zhì)性能的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>實(shí)施例6甲殼素親和介質(zhì)吸附容量取甲殼素介質(zhì)16ml，加入發(fā)酵液上清250ml，室溫磁力攪拌吸附0.5h，沉淀10min，傾去上清液，加入500ml雙蒸水，攪拌洗滌后沉淀10min，重復(fù)洗漆一次，傾去上清液。將甲殼素親和介質(zhì)裝10mmX20cm色譜柱，用pH6.24的0.02MPBS洗柱，待流出液OD，m值降至O.OlO以下后，換用pH3.27的0.05M醋酸溶液解離，收集洗脫液，洗脫液0D28。^降至0.010以下后停止收集。用1M碳酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)洗脫液pH至8.0，進(jìn)行DEAE-S印hadexA-25陰離子交換色譜，收集洗脫液，用1M醋酸調(diào)節(jié)洗脫液pH至6.24。將酶液裝入適當(dāng)長度的截流范圍40006000的透析帶，4'C下用IO倍體積雙蒸水透析12h，中間換水34次。將酶液分裝，進(jìn)行真空冷凍干燥，計(jì)算產(chǎn)品質(zhì)量及甲殼素親和介質(zhì)吸附容量。結(jié)果表明，使用16ml甲殼素親和介質(zhì)，可從250ml發(fā)酵液上清中純化到6.5mg的rh-LYZ，因此，在此吸附條件下，每ml甲殼素親和介質(zhì)的吸附容量約為0.4mg。實(shí)施例7甲殼素親和層析介質(zhì)的制備方法將一定目數(shù)甲殼素(通常為60目)用2MNaOH溶液，以1:IO浴比，在攪拌下室溫堿化12h—二層脫脂棉紗布過濾，用50倍體積蒸餾水洗滌3次，復(fù)浸于一定體積蒸餾水中一加入等體積0.2M乙酸溶液，室溫磁力攪拌5min—二層脫脂棉紗布過濾，用蒸餾水洗至中性，復(fù)浸于一定體積蒸餾水中，加入無水乙醇至20%濃度，4'C保存，備用。實(shí)施例8雞溶菌酶(c-LYZ)的純化取甲殼素介質(zhì)15ml，加入發(fā)酵液上清，室溫磁力攪拌吸附0.5h，沉淀10min后，傾去上清液，將介質(zhì)裝lcmX20cm色譜柱，用pH6.4的0.02MPBS洗柱床，洗脫液OD^值降至0.010以下后，換用pH3.27的0.05M醋酸溶液解離，收集洗脫液，洗脫液0028。降至0.010以下后停止收集。換用pH5.42的0.2M醋酸鈉緩沖液解離，收集洗脫液，待洗脫液0D28^降至0.010以下后停止收集；再用pH3.27的0.05M醋酸溶液解離，以1.5ml為單位收集洗脫液，洗脫液OD，^降至0.010以下后停止收集。一步洗脫法純化的c-LYZ粗產(chǎn)品SDS-PAGE，使用BandScanV4.30軟件分析。結(jié)晶中蛋白含量(按分子量大小)分別為24.5%，28.1%,47.4%，上清中c-LYZ純度為100%。權(quán)利要求1.一種用于分離溶菌酶的親和層析介質(zhì)，其特征在于，該層析介質(zhì)是堿化后的甲殼素。2.如權(quán)利要求l所述介質(zhì)的制備方法，其特征在于，將甲殼素在7-30'C條件下堿化6-36小時(shí)后，靜置并洗至中性，即可。3.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所用堿為氫氧化鈉、氫氧化鉀中的一種或者幾種。4.如權(quán)利要求2所述的制備方法，5.如權(quán)利要求2所述的制備方法，爾比為8-200:1，單位為克/摩爾。6.如權(quán)利要求2所述的制備方法，爾比為25-150:l，單位為克/摩爾。7.如權(quán)利要求2所述的制備方法，過濾再洗滌至中性備用。8.如權(quán)利要求2所述的制備方法，9.如權(quán)利要求2所述的制備方法，者檸檬酸處理至中性再靜置洗滌。10.如權(quán)利要求9所述的制備方法,其特征在于，堿化時(shí)間為8-24小時(shí)。其特征在于，甲殼素與堿中OH—的質(zhì)量摩其特征在于，甲殼素與堿中0H—的質(zhì)量摩其特征在于，甲殼素堿化靜置后，經(jīng)過其特征在于，反應(yīng)溫度為15-25'C。其特征在于，甲殼素堿化后，用醋酸或其特征在于，酸處理時(shí)，加入甲殼素與酸中H+的質(zhì)量摩爾比為25-200:1，單位為克/摩爾<全文摘要本發(fā)明屬于蛋白純化試劑領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及一種以甲殼素為原料的親和層析介質(zhì)及其制備方法。本發(fā)明采用甲殼素為原料，制備分離純化溶菌酶的親和色譜介質(zhì)。本發(fā)明采用的制備方法簡便易行，成本低廉；甲殼素親和介質(zhì)吸附性專一，流速較快；采用甲殼素親和介質(zhì)純化人溶菌酶，步驟簡單高效，經(jīng)過一次純化，即可從發(fā)酵液中分離到近100％的純度的溶菌酶，純化效率明顯高于離子交換層析。因此，本研究的甲殼素親和介質(zhì)制備工藝可適用于大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)。文檔編號(hào)B01J20/281GK101352673SQ20071004425公開日2009年1月28日申請(qǐng)日期2007年7月26日優(yōu)先權(quán)日2007年7月26日發(fā)明者龍余,唐麗莎,李宗林,鵬黃申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)