專(zhuān)利名稱(chēng)：一種溶菌酶的發(fā)酵方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于遺傳工程和蛋白質(zhì)工程領(lǐng)域，具體涉及一種溶菌酶的發(fā)酵方法。
背景技術(shù)：
溶菌酶是一種堿性球蛋白，全稱(chēng)為:.l,4_e-N-溶菌酶或者粘肽N-乙 ?；邗Ｋ饷?。它能水解細(xì)菌細(xì)胞壁的肽聚糖中N-乙酰胞壁酸和N-乙 酰葡萄糖胺之間的e-l，4糖苷鍵，破壞肽聚糖支架，在細(xì)菌內(nèi)部滲透壓作
用下導(dǎo)致細(xì)胞壁破裂，達(dá)到殺菌效果。
在臨床上，溶菌酶對(duì)眼、耳、鼻、喉、口腔等的急、慢性炎癥均有一-定
療效，特別是對(duì)急性炎癥如急性咽炎、急性喉炎、急性中耳炎等效果明顯。 與抗生素聯(lián)合使用，對(duì)于嚴(yán)重的急性炎癥亦有一定療效。在治療皮膚病方面， 溶菌酶亦有廣泛用途，可用于治療扁平疣、傳染性軟疣、尋常性疣、尖銳濕 疣、帶狀皰疹等多種皮膚病。對(duì)于帶狀皰疹，內(nèi)服溶菌酶即可。此外，溶菌 酶可用于小兒或乳兒哮喘性支氣管炎、呼吸道內(nèi)膜腫脹等，能夠使黏膜腫脹 很快消除，使痰液變稀、呼吸通暢。溶菌酶亦可預(yù)防和治療病毒性肝炎，尤 其對(duì)輸血后肝炎及急性肝炎的效果較為顯著。在機(jī)體內(nèi)溶菌酶還具有抗流感 病毒的活性，其與膽酸鹽酸鹽的復(fù)合物能強(qiáng)烈抑制流感病毒和腺病毒的生 長(zhǎng)，并能防止皰疹性病毒感染。
目前，在臨床上應(yīng)用的溶菌酶主要是蛋清溶菌酶，由于其是一種異源蛋 白，在人體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生免疫原性和毒副作用。而從人奶、胎盤(pán)或尿液中少量提 取溶菌酶，來(lái)源極其困難，無(wú)法進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)。并且從生物材料提取溶菌 酶有其固有缺陷， 一是受生物材料來(lái)源限制，二是生物材料由于取自不同生 物體，保鮮程度不一，易受病毒和其他有害物質(zhì)污染，這會(huì)造成產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定。且天然溶菌酶價(jià)格昂貴，因此無(wú)法用于臨床。
迄今，國(guó)內(nèi)尚無(wú)溶菌酶的規(guī)模生產(chǎn)。各實(shí)驗(yàn)室使用的溶菌酶大多為進(jìn)口 產(chǎn)品，隨著對(duì)溶菌酶的臨床應(yīng)用研究的深入，國(guó)內(nèi)迫切需要質(zhì)優(yōu)價(jià)廉的溶菌 酶供應(yīng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是對(duì)溶菌酶的發(fā)酵方法進(jìn)行優(yōu)化，使溶菌酶的產(chǎn)量穩(wěn)定于較 高水平，從而達(dá)到規(guī)模生產(chǎn)要求。
本發(fā)明提供了一種溶菌酶的發(fā)酵方法，該方法包括以下步驟-
(1) 將活化的表達(dá)溶菌酶蛋白的畢赤酵母菌種置于培養(yǎng)基中發(fā)酵1-3
天；
(2) 在(1)的培養(yǎng)基中加入甲醇，繼續(xù)培養(yǎng)l-5天；
(3) 收集發(fā)酵產(chǎn)物，去菌體，即可。
本發(fā)明中，表達(dá)溶菌酶蛋白的畢赤酵母菌種可以采用基因工程將溶菌酶 基因序列插入畢赤酵母的基因組而得。溶菌酶基因序列可以采用從適當(dāng)?shù)纳?物體組織細(xì)胞中提取或者人工合成而得。通常，使用的溶菌酶基因序列是經(jīng) 過(guò)偏愛(ài)密碼子改造的，即將溶菌酶基因序列中的密碼子序列改為畢赤酵母的 偏愛(ài)密碼子。
由于品質(zhì)優(yōu)良的菌種通常被冷凍保存，以備后用，所以發(fā)酵前要將菌種 活化。菌種活化可以采用常規(guī)的方法進(jìn)行，例如，室溫復(fù)蘇，稀釋涂布于固 體培養(yǎng)基上培養(yǎng)過(guò)夜，然后挑取菌落接種液體培養(yǎng)基培養(yǎng)備用。
本發(fā)明中，發(fā)酵培養(yǎng)基可以使甩常規(guī)培養(yǎng)基。其中，該培養(yǎng)基中甘油含 量為5-4pml/L，蛋白胨含量為10-50g/L。培養(yǎng)基中還可以加入酵母粉，酵 母粉的含量為0-50g/L。培養(yǎng)基中還可以加入葡萄糖，葡萄糖的含量為 0-40g/L。培養(yǎng)基中還可以加入磷酸鹽，磷酸鹽含量為0-0. 1M/L。磷酸鹽可 以是磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液，磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖液，磷酸 氫二鉀-磷酸二氫鉀緩沖液。該培養(yǎng)基在pH值為7-8. 5時(shí)效果較好。
本發(fā)明中，發(fā)酵溫度可以采用常溫。
本發(fā)明中，步驟(2)中發(fā)酵時(shí)間為36-60小時(shí)。
本發(fā)明中，步驟(2)中加入甲醇的量為每6-15小時(shí)添加甲醇0. 25-15ml/L 培養(yǎng)基。例如，每6、 8、 10、 12或者15小時(shí)添加一次；添加甲醇的量可 以是每次O. 2ml/L， lml/L, 2ml/L， 4ml/L， 5ml/L, 7ml/L， 8ml/L等，但要 保證甲醇的濃度在培養(yǎng)基中不超過(guò)3%的體積比。
本發(fā)明中，步驟(2)培養(yǎng)過(guò)程中加入含蛋白胨0. 01-0. 05g/ml和酵母 提取物，即酵母粉，0.01-0.05g/ml的培養(yǎng)基。
本發(fā)明中，歩驟(3)中去菌體方法可以為離心或者過(guò)濾、超濾。
本發(fā)明中，以離心方法為去菌方法時(shí)，離心條件可以為1500-10000rpm， 3-15分鐘，0-IO'C。
由于溶菌酶為分泌蛋白，所以溶解在發(fā)酵產(chǎn)物上清中。
本發(fā)明釆用工業(yè)上常用的蛋白胨、酵母粉等原料進(jìn)行生產(chǎn)，生產(chǎn)成本低 廉，適于大規(guī)模生產(chǎn)。與Invitrogen公司提供的培養(yǎng)基相比，生產(chǎn)1克溶 菌酶成本從6000余元人民幣，降至2000余元人民幣，從而提高了產(chǎn)品的競(jìng) 爭(zhēng)力；此外，與工業(yè)上常用的培養(yǎng)基相比，本發(fā)明采用的培養(yǎng)基大大簡(jiǎn)化， 生產(chǎn)效率明顯提高，成本降低，且營(yíng)養(yǎng)平衡，產(chǎn)量增加，為基因工程菌的擴(kuò) 大生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1 發(fā)酵流程及產(chǎn)量計(jì)算
1.1菌種活化從-80匸取出菌種，室溫復(fù)蘇。將凍存管打開(kāi)，用移液 槍反復(fù)抽吸數(shù)次。稀釋10-'M音，涂布YPD平板固體培養(yǎng)基，置于30'C培養(yǎng)。
1.2種子培養(yǎng)YPD平板固體培養(yǎng)基中48h后，挑取直徑2mra菌落接種 100ml優(yōu)選培養(yǎng)基于1L三角瓶，以4層無(wú)菌紗布封口，進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，溫度 28 30'C，震蕩速度300rpm, 36h后結(jié)束培養(yǎng)。
1.3發(fā)酵培養(yǎng):將基礎(chǔ)培養(yǎng)基6L裝入15L發(fā)酵罐，115"髙壓滅菌25min。 接種1.5L二級(jí)種子培養(yǎng)液，培養(yǎng)16~24h耗盡培養(yǎng)液中甘油，。培甲醇誘
導(dǎo)階段共持續(xù)72h。重復(fù)培養(yǎng)兩次。
1.4發(fā)酵液處理發(fā)酵結(jié)束，用低溫高速離心機(jī)(5000g， 4'C， 10min) 離心發(fā)酵液，收集上清液，加入疊氮鈉至0.02%濃度，4C保存。
在進(jìn)行一次純化后，可從250ml發(fā)酵液上清中純化到7. 0mg的rh-LYZ， 而發(fā)酵液上清的rh-LYZ總活性減少50%,.因此推斷，250ml發(fā)酵液上清中約 含14mg的rh-LYZ,每升發(fā)酵液中含56mg左右的rh-LYZ。
實(shí)施例2 甲醇濃度對(duì)表達(dá)量的影響
將優(yōu)化培養(yǎng)基分裝500ml三角瓶。培養(yǎng)48h后進(jìn)行誘導(dǎo)。培養(yǎng)基A:,a，每 12h添加甲醇0.25ml;培養(yǎng)基BM，每12h添加甲醇0.5ml;培養(yǎng)基CM,每 12h添加甲醇lml;培養(yǎng)基D33,每12h添加甲醇1.5ml;培養(yǎng)基E33,每12h 添加甲醇2ml。誘導(dǎo)開(kāi)始后，每隔12h取樣，共8次，-20'C保存，發(fā)酵結(jié) 束檢測(cè)人溶菌酶相對(duì)活性，繪制活性增長(zhǎng)曲線(xiàn)。
結(jié)果表明，每24h添加1%，即10ml/L甲醇，培養(yǎng)液中蛋白的活性最高； 每24h添加0.59&、 1.5%、 2%、 2.5%甲醇的培養(yǎng)基中，蛋白活性相差不大；每 24h添加3%甲醇的培養(yǎng)基中蛋白活性最低。
權(quán)利要求
1.一種溶菌酶的發(fā)酵方法，其特征在于，該方法包括以下步驟(1)將活化的表達(dá)溶菌酶蛋白的畢赤酵母菌種置于培養(yǎng)基中發(fā)酵1-3天；(2)在(1)的培養(yǎng)基中加入甲醇，繼續(xù)培養(yǎng)1-5天；(3)收集發(fā)酵產(chǎn)物，去菌體，即可。
2. 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，(2)中發(fā)酵時(shí)間為36-60 小時(shí)。
3. 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，(2)中加入甲醇的量為每 6-15小時(shí)添加甲醇2. 5-30ml/L培養(yǎng)基。
4. 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，(2)培養(yǎng)過(guò)程中加入含蛋 白胨和酵母粉，加入的量分別為0. 01-0. 05g/ml和0. 01-0. 05g/ml培養(yǎng)基。
5. 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，(3)中去菌體方法為離心、 過(guò)濾或者超濾。
6. 如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，離心條件為1500-10000rpm， 3-15分鐘，0-l(TC。
全文摘要
本發(fā)明屬于遺傳工程和蛋白質(zhì)工程領(lǐng)域，具體涉及一種溶菌酶的發(fā)酵方法。溶菌酶的用途相當(dāng)廣泛。許多研究者都在不斷優(yōu)化溶菌酶生產(chǎn)技術(shù)，以期在提高溶菌酶產(chǎn)量的同時(shí)降低生產(chǎn)成本。本發(fā)明采用工業(yè)上常用的蛋白胨、酵母粉等原料進(jìn)行生產(chǎn)，生產(chǎn)成本低廉，適于大規(guī)模生產(chǎn)。與Invitrogen公司提供的培養(yǎng)基相比，生產(chǎn)1克溶菌酶成本從6000余元人民幣，降至2000余元人民幣，從而提高了產(chǎn)品的競(jìng)爭(zhēng)力，為基因工程菌的擴(kuò)大生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12N9/36GK101353651SQ20071004426
公開(kāi)日2009年1月28日 申請(qǐng)日期2007年7月26日 優(yōu)先權(quán)日2007年7月26日
發(fā)明者龍 余, 唐麗莎, 李宗林, 鵬 黃 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)