微流體細(xì)胞處理芯片及其應(yīng)用方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種微流體細(xì)胞處理芯片及應(yīng)用方法，由底層和頂層構(gòu)成，頂層中設(shè)有蛇形管道和細(xì)胞操作腔，蛇形管道的溶液流入口上設(shè)有兩個(gè)流入通道，兩個(gè)流入通道的入口管道上分別設(shè)有保護(hù)劑入口和緩沖溶液入口，蛇形管道的溶液流出通道連接細(xì)胞操作腔，細(xì)胞操作腔設(shè)有溶液出口和細(xì)胞進(jìn)出口通道，細(xì)胞進(jìn)出口通道上裝有轉(zhuǎn)矩控制微閥，細(xì)胞操作腔的兩側(cè)各設(shè)有一個(gè)半隔斷，能夠?qū)⒓?xì)胞限制于細(xì)胞操作腔中，而不被沖走。通過(guò)轉(zhuǎn)矩控制微閥的開閉來(lái)控制細(xì)胞進(jìn)出細(xì)胞操作腔。本發(fā)明的微流體細(xì)胞處理芯片及應(yīng)用方法可以在對(duì)體積較大的動(dòng)物細(xì)胞冷凍保護(hù)劑加載或去除時(shí)，使保護(hù)劑濃度連續(xù)變化，具有操作直接簡(jiǎn)便、對(duì)細(xì)胞損傷較小等優(yōu)點(diǎn)。
【專利說(shuō)明】微流體細(xì)胞處理芯片及其應(yīng)用方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種微流體細(xì)胞處理芯片，具體說(shuō)，是涉及一種以對(duì)細(xì)胞損傷小，操作簡(jiǎn)便顯著，在低溫保護(hù)劑的加載和去除過(guò)程中，能使低溫保護(hù)劑濃度連續(xù)改變的微流體芯片及其應(yīng)用方法。
【背景技術(shù)】
[0002]細(xì)胞凍存是細(xì)胞保存的主要方法之一。利用凍存技術(shù)將細(xì)胞置于_196°C液氮中低溫保存，可以使細(xì)胞暫時(shí)脫離生長(zhǎng)狀態(tài)而將其細(xì)胞特性保存起來(lái)，這樣在需要的時(shí)候再?gòu)?fù)蘇細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。而且適度地保存一定量的細(xì)胞，可以防止因正在培養(yǎng)的細(xì)胞被污染或其他意外事件而使細(xì)胞丟種，起到了細(xì)胞保種的作用。細(xì)胞凍存時(shí)向培養(yǎng)基中加入保護(hù)劑一終濃度5%-15%的甘油或二甲基亞砜(DMSO)，可使溶液冰點(diǎn)降低，加之在緩慢凍結(jié)條件下，細(xì)胞內(nèi)水分透出，減少了冰晶形成，從而避免細(xì)胞損傷。
[0003]卵母細(xì)胞作為一種體積 較大的動(dòng)物生殖細(xì)胞，它的低溫保存技術(shù)是人類輔助生殖領(lǐng)域的重要工具。通過(guò)對(duì)健康的卵母細(xì)胞進(jìn)行低溫保存，將能夠?yàn)樾枰娜颂峁└嗟纳龣C(jī)會(huì)。在低溫保存過(guò)程中不可避免的要使用低溫保護(hù)劑，低溫保護(hù)劑的使用也會(huì)帶來(lái)許多副作用:一方面低溫保護(hù)劑添加和去除過(guò)程中，由于滲透壓的急劇變化，大量水或低溫保護(hù)劑快速流出或流入細(xì)胞，從而引起細(xì)胞體積的膨脹或收縮，造成細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和細(xì)胞骨架系統(tǒng)的損傷；另一方面低溫保護(hù)劑對(duì)細(xì)胞有化學(xué)毒性損傷，并且其毒性大小隨作用時(shí)間和作用濃度的增加而增大。目前通常采用分步添加和分步去除保護(hù)劑的方法。這種方法操作步驟繁瑣，要求在很短的時(shí)間內(nèi)在顯微鏡下準(zhǔn)確找到細(xì)胞，并完成細(xì)胞在溶液間的轉(zhuǎn)移，非常容易造成細(xì)胞的丟失，對(duì)操作人員的熟練程度要求很高；而且分步添加和分步去除的次數(shù)也不可能增加太多，這就使卵母細(xì)胞仍然會(huì)受到幾次由于保護(hù)劑濃度突然變化造成的體積突然變化，且在高濃度低溫保護(hù)劑中的暴露時(shí)間長(zhǎng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問(wèn)題，本發(fā)明的目的之一是提供一種使低溫保護(hù)劑濃度連續(xù)變化的微流體細(xì)胞處理芯片。
[0005]本發(fā)明的目的之二是提供一種將微流體細(xì)胞處理芯片在卵母細(xì)胞低溫保護(hù)劑加載和去除中的應(yīng)用方法。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案:一種微流體細(xì)胞處理芯片，由底層和頂層構(gòu)成，其特點(diǎn)是:頂層中設(shè)有蛇形管道和細(xì)胞操作腔、蛇形管道的溶液流入口上設(shè)有兩個(gè)流入通道，兩個(gè)流入通道的入口管道上分別設(shè)有保護(hù)劑入口和緩沖溶液入口，蛇形管道的溶液流出通道連接細(xì)胞操作腔，細(xì)胞操作腔設(shè)有溶液出口和細(xì)胞進(jìn)出口通道，細(xì)胞進(jìn)出口通道上裝有轉(zhuǎn)矩控制微閥，細(xì)胞操作腔的兩側(cè)各設(shè)有一個(gè)半隔斷。
[0007]保護(hù)劑入口和緩沖溶液入口對(duì)稱于蛇形管道的溶液流入口，保護(hù)劑入口和緩沖溶液入口的開口直徑相同；并且分別通過(guò)第一微流體芯片毛細(xì)管與一個(gè)雙通道注射泵的兩個(gè)注射器連接；入口管道的徑高比為1:4-1:5。。
[0008]細(xì)胞操作腔為上凹的長(zhǎng)方體，其容積為0.1-0.2mm3。
[0009]溶液出口連接第三微流體芯片毛細(xì)管，微流體芯片毛細(xì)管上設(shè)有溶液出口開關(guān)。
[0010]蛇形管道的橫截面為正方形，其邊長(zhǎng)d=0.05、.2mm,相鄰管道間距=0.2-0.3mm,蛇形管道的總長(zhǎng)度為1.5-2.5cm。
[0011]半隔斷為凸形扁平長(zhǎng)方體，其與底層的間隙高度為30-40μm。
[0012]底層材質(zhì)為玻璃基片，頂層材質(zhì)為聚二甲基硅氧烷；細(xì)胞進(jìn)出口通道上面設(shè)有半徑4mm，深2mm的聚氨酯層，該聚氨酯層面積為所述頂層面積的0.3%~θ.5%，聚氨酯層中間連接轉(zhuǎn)矩控制微閥。
[0013]由底層和頂層構(gòu)成的所述芯片的長(zhǎng):寬:高=60~80:45-55:1~3。
[0014]一種微流體細(xì)胞處理芯片的應(yīng)用方法，包括低溫保護(hù)劑加載方法和低溫保護(hù)劑去除的方法:
低溫保護(hù)劑加載方法的步驟為:
a)打開轉(zhuǎn)矩控制微閥和溶液出口開關(guān)，用移液器將細(xì)胞及緩沖溶液注入與細(xì)胞進(jìn)出通道入口連接的第二微流體芯片毛細(xì)管，將一注射器連接第二微流體芯片毛細(xì)管，推動(dòng)注射器使得細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞操作腔；
b)關(guān)閉轉(zhuǎn)矩控制微閥，打開雙通道注射泵中的低溫保護(hù)劑注射器和緩沖溶液注射器，緩慢增加低溫保護(hù)劑的流速，緩慢減小緩沖溶液的流速，使得混合后的溶液中低溫保護(hù)劑的濃度連續(xù)增加；
c)在對(duì)細(xì)胞低溫保護(hù)劑加載的同時(shí)，用顯微鏡觀察細(xì)胞體積的變化；
d)當(dāng)細(xì)胞達(dá)到處理要求后，關(guān)閉兩個(gè)注射器，打開轉(zhuǎn)矩控制微閥，關(guān)閉溶液出口開關(guān)；
e)打開低溫保護(hù)劑注射器，使得細(xì)胞從細(xì)胞操作腔經(jīng)細(xì)胞進(jìn)出通道沖出芯片，加載過(guò)程完畢。
[0015]低溫保護(hù)劑去除的方法步驟為:
a)打開轉(zhuǎn)矩控制微閥和溶液出口開關(guān)，用移液器將細(xì)胞及保護(hù)劑注入與細(xì)胞進(jìn)出通道入口連接的第二微流體芯片毛細(xì)管，將一注射器連接第二微流體芯片毛細(xì)管，推動(dòng)注射器使得細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞操作腔；
b)關(guān)閉轉(zhuǎn)矩控制微閥，打開雙通道注射泵中的低溫保護(hù)劑注射器和緩沖溶液注射器，緩慢減小低溫保護(hù)劑的流速，緩慢增加緩沖溶液的流速，使得混合后的溶液中低溫保護(hù)劑的濃度連續(xù)減??；
c)在對(duì)細(xì)胞低溫保護(hù)劑去除的同時(shí)，用顯微鏡觀察細(xì)胞體積的變化；
d)當(dāng)細(xì)胞達(dá)到處理要求后，關(guān)閉兩個(gè)注射器，打開轉(zhuǎn)矩控制微閥，關(guān)閉溶液出口開關(guān)；
e)打開緩沖溶液注射器，使得細(xì)胞從細(xì)胞操作腔經(jīng)細(xì)胞進(jìn)出通道沖出芯片，去除過(guò)程完畢。
[0016]本發(fā)明的有益效果是:
本發(fā)明的微流體細(xì)胞處理芯片將微流體結(jié)構(gòu)與細(xì)胞處理集成一種微型細(xì)胞處理、分析系統(tǒng)，該芯片可以在對(duì)體積較大的動(dòng)物細(xì)胞冷凍保護(hù)劑加載或去除時(shí)，使保護(hù)劑濃度連續(xù)變化，具有操作直接簡(jiǎn)便、對(duì)細(xì)胞的損傷較小等優(yōu)點(diǎn)。
[0017]本發(fā)明提供的一種將微流體細(xì)胞處理芯片在卵母細(xì)胞低溫保護(hù)劑加載和去除中的應(yīng)用，此應(yīng)用方法克服了現(xiàn)有的體積較大的動(dòng)物細(xì)胞，尤其是體積較大的動(dòng)物生殖細(xì)胞低溫保存過(guò)程中低溫保護(hù)劑加載和去除方法的諸多缺點(diǎn)。
[0018]本發(fā)明的體積較大的動(dòng)物細(xì)胞低溫保護(hù)劑加載和去除的微流體方法是基于在微觀尺寸下控制、操作和檢測(cè)復(fù)雜流體的微流體技術(shù)，保護(hù)劑溶液和緩沖溶液在微流體通道內(nèi)以層流方式流動(dòng)，兩流體通過(guò)擴(kuò)散方式混合，實(shí)現(xiàn)沿著通道方向保護(hù)劑濃度的連續(xù)改變，從而減小保護(hù)劑濃度的突然改變對(duì)細(xì)胞造成的滲透沖擊以及細(xì)胞在高濃度保護(hù)劑中的毒性損傷。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0019]圖1是本發(fā)明的微流體細(xì)胞處理芯片的頂層結(jié)構(gòu)立體示意圖；
圖2是本發(fā)明微流體細(xì)胞處理芯片橫截面示意圖；
圖3是本發(fā)明各管道通路連接示意圖；
圖4 Ca)是轉(zhuǎn)矩控制微閥打開狀態(tài)結(jié)構(gòu)示意圖；
圖4 (b)是轉(zhuǎn)矩控制微閥關(guān)閉狀態(tài)結(jié)構(gòu)示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0020]下面結(jié)合附圖與實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)、完整地說(shuō)明。
[0021]如圖1至圖3所示，本發(fā)明的微流體細(xì)胞處理芯片，由底層14和頂層15構(gòu)成。該芯片本體與一個(gè)雙通道注射泵通過(guò)微流體芯片毛細(xì)管連接，并加裝在顯微鏡自動(dòng)載物臺(tái)上。
[0022]如圖1，2所示，頂層15中設(shè)有蛇形管道6和細(xì)胞操作腔9，蛇形管道6的溶液流入口上設(shè)有兩個(gè)連接有入口管道的流入通道2，兩個(gè)流入通道2的入口管道上分別設(shè)有保護(hù)劑入口 4和緩沖溶液入口 5，蛇形管道6的溶液流出通道連接細(xì)胞操作腔9，細(xì)胞操作腔9設(shè)有溶液出口 11和細(xì)胞進(jìn)出口通道7，細(xì)胞進(jìn)出口通道7上裝有轉(zhuǎn)矩控制微閥8，細(xì)胞操作腔9的兩側(cè)各設(shè)有一個(gè)半隔斷。
[0023]如圖2所示，微流體芯片本體與注射泵通過(guò)第一微流體芯片毛細(xì)管13連接，該注射泵的型號(hào)為MFCS-3C (法國(guó)FLIGENT)；
芯片本體上表面設(shè)置的限定開口的保護(hù)劑入口 4和緩沖溶液入口 5，分別用于通入緩沖溶液和低溫保護(hù)劑溶液；兩個(gè)入口對(duì)稱于蛇形管道6的溶液流入口，兩個(gè)入口的開口直徑相同；并且分別通過(guò)第一微流體芯片毛細(xì)管13與一個(gè)雙通道注射泵I的兩個(gè)注射器連接；入口管道的徑高比為1:4"!:5。
[0024]溶液出口 11處設(shè)置溶液出口開關(guān)12，該開關(guān)12位于與溶液出口 11相連接的第三微流體芯片毛細(xì)管18上，位于芯片之外；
兩個(gè)溶液入口通過(guò)流入通道與蛇形管道6相連通，該蛇形管道6用于混合緩沖溶液與低溫保護(hù)劑溶液，使混合溶液濃度連續(xù)變化；` 蛇形管道6在芯片內(nèi)同一平面，蜿蜒蛇形，橫截面為正方形，其邊長(zhǎng)d=0.05、.2mm,相鄰管道間距=0.2-0.3mm，蛇形管道的總長(zhǎng)度為1.5-2.5cm。
[0025]蛇形管道6的另一端連接有至少一個(gè)細(xì)胞操作腔9,細(xì)胞操作腔9為上凹的長(zhǎng)方體，容積大小約為0.0.2mm3，腔的三面分別與蛇形通道6、細(xì)胞進(jìn)出通道7和溶液出口 11相通。[0026]細(xì)胞操作腔9的兩側(cè)各設(shè)有一個(gè)半隔斷10，該半隔斷10為扁平的長(zhǎng)方形，從上表面看去是下凸的，其與底層的間隙高度為30-40μπι，具有精確控制細(xì)胞的作用，由于其尺寸僅為卵母細(xì)胞直徑的1/3，可保證細(xì)胞不被沖走，防止細(xì)胞在保護(hù)劑加載和去除過(guò)程中丟失;
芯片本體上還設(shè)置有一個(gè)細(xì)胞進(jìn)出通道7，通過(guò)轉(zhuǎn)矩控制微閥8的開閉來(lái)控制細(xì)胞進(jìn)出細(xì)胞操作腔9。形成濃度連續(xù)變化的蛇形管道6、細(xì)胞操作腔9、細(xì)胞進(jìn)出通道7、溶液出口 11直接相連通；
芯片本身的長(zhǎng):寬:高==6(T80:45~55:1-3，大小應(yīng)該與帶有自動(dòng)載物臺(tái)的顯微鏡載物臺(tái)相匹配；
如圖4 (a)所示，芯片本體主要分為兩層:底層14材質(zhì)為玻璃基片，頂層15材質(zhì)為聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane，PDMS)層；在PDMS層上表面設(shè)置有聚氨酯層16，該聚氨酯層16面積為所述PDMS層面積的0.3%~Ο.5% ；
在聚氨酯層中央位置裝有轉(zhuǎn)矩控制微閥8，該微閥8包含直徑約為1_的螺絲釘，通過(guò)螺絲刀順時(shí)針擰動(dòng)螺釘，微閥8被關(guān)閉，逆時(shí)針旋轉(zhuǎn)就能將微閥8打開；
為保證光線通過(guò)，微流體裝置以SU-8 2000光刻膠制備模具，用透光率較好的聚二甲基硅氧烷(PDMS)注塑成型；為增強(qiáng)微流體管道的親水性，PDMS芯片需經(jīng)過(guò)氧等離子體處理，處理后的芯片與玻璃基片鍵合制作完成微流體濃度連續(xù)變化細(xì)胞操作芯片。
[0027]微流體細(xì)胞處理芯片在卵母細(xì)胞低溫保護(hù)劑加載和去除中的應(yīng)用方法，包括低溫保護(hù)劑加載方法和低溫保護(hù)劑去除的方法。
[0028]本發(fā)明在進(jìn)行卵母細(xì)胞低溫保護(hù)劑的加載應(yīng)用方法的步驟如下:
1)將微流體細(xì)胞處理芯片安放固定在顯微鏡的自動(dòng)載物臺(tái)上；
2)打開轉(zhuǎn)矩控制微閥8和溶液出口開關(guān)12，用移液器將卵母細(xì)胞及緩沖溶液注入與細(xì)胞進(jìn)出通道7入口連接的第二微流體芯片毛細(xì)管17 ；
3)將一裝有緩沖溶液的注射器連接微流體芯片毛細(xì)管17，推動(dòng)注射器使得卵母細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞操作腔9，溶液從細(xì)胞進(jìn)出口通道7進(jìn)入，經(jīng)細(xì)胞操作腔9，從溶液出口 11流出；
4)調(diào)整顯微鏡聚光鏡和物鏡鏡頭，獲得細(xì)胞操作腔9內(nèi)卵母細(xì)胞的清晰圖像；
5)擰緊轉(zhuǎn)矩控制微閥8螺絲，關(guān)閉細(xì)胞進(jìn)出通道7；
6)打開雙通道注射泵I中的低溫保護(hù)劑注射器和緩沖溶液注射器，兩種溶液分別從相應(yīng)入口進(jìn)入芯片本體內(nèi)的流入通道，然后在蛇形管道6中進(jìn)行混合；低溫保護(hù)劑的流量從O緩慢增加至50 μ 1/min,緩沖溶液的流量從50 μ 1/min緩慢減小至0，使得混合后的溶液中低溫保護(hù)劑的濃度連續(xù)增加，控制兩種流體的流速以實(shí)現(xiàn)保護(hù)劑濃度的連續(xù)變化，混合好的溶液經(jīng)細(xì)胞操作腔9，從溶液出口 11流出；
7)當(dāng)保護(hù)劑流量增至50μ 1/min,緩沖溶液的流量減至0，即可認(rèn)為保護(hù)劑加載完畢(不同細(xì)胞和不同濃度的低溫保護(hù)劑，加載方案不同)，關(guān)閉兩個(gè)注射器，打開轉(zhuǎn)矩控制微閥8，關(guān)閉溶液出口 12 ；
8)打開雙通道注射泵I中的低溫保護(hù)劑注射器，使得細(xì)胞從細(xì)胞操作腔9經(jīng)細(xì)胞進(jìn)出通道7，從與細(xì)胞進(jìn)出口通道7相連接的第二微流體芯片毛細(xì)管17流出；沖出的細(xì)胞放在cryotop片上投入液氮,進(jìn)行低溫保存。
[0029]本發(fā)明進(jìn)行卵母細(xì)胞低溫保護(hù)劑的去除應(yīng)用方法的步驟如下:1)將微流體細(xì)胞處理芯片安放固定在顯微鏡的自動(dòng)載物臺(tái)上；
2)打開轉(zhuǎn)矩控制微閥8，見(jiàn)圖4Ca)和溶液出口開關(guān)12，用移液器將卵母細(xì)胞及解凍液{基礎(chǔ)液[組織培養(yǎng)液(TCM) 199 + 20%胎牛血清(FBS)]+0.5 mol/L蔗糖}注入與細(xì)胞進(jìn)出通道7入口連接的第二微流體芯片毛細(xì)管17 ；
3)將一裝有解凍液的注射器連接第二微流體芯片毛細(xì)管17，推動(dòng)注射器使得卵母細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞操作腔9 ；
4)調(diào)整顯微鏡聚光鏡3和物鏡鏡頭，獲得細(xì)胞操作腔9內(nèi)卵母細(xì)胞的清晰圖像；
5)擰緊轉(zhuǎn)矩控制微閥8螺絲，見(jiàn)圖4(b)，關(guān)閉細(xì)胞進(jìn)出通道7 ；
6)打開雙通道注射泵I中的低溫保護(hù)劑注射器和緩沖溶液注射器，兩種溶液分別從相應(yīng)入口進(jìn)入芯片本體內(nèi)的流入通道，然后在蛇形管道6中進(jìn)行混合；低溫保護(hù)劑的流量從50 μ 1/min緩慢減小至0，緩沖溶液的流量從O緩慢增加至50 μ 1/min,使得混合后的溶液中低溫保護(hù)劑的濃度連續(xù)減小，控制流速以實(shí)現(xiàn)保護(hù)劑濃度的連續(xù)變化，混合好的溶液經(jīng)細(xì)胞操作腔9，從溶液出口 11流出； 7)當(dāng)緩沖溶液的流量增至50μ 1/min，保護(hù)劑流量減至0，即可認(rèn)為保護(hù)劑去除完畢(不同細(xì)胞和不同濃度的低溫保護(hù)劑，加載方案不同)，關(guān)閉兩個(gè)注射器，打開轉(zhuǎn)矩控制微閥8，關(guān)閉溶液出口 12 ；
8)打開雙通道注射泵I中的緩沖溶液注射器，使得細(xì)胞從細(xì)胞操作腔9經(jīng)細(xì)胞進(jìn)出通道7沖出芯片。
[0030]最后有必要在此說(shuō)明的是:以上實(shí)施例只用于對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步詳細(xì)地說(shuō)明，不能理解為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容作出的一些非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種微流體細(xì)胞處理芯片，由底層(14)和頂層(15)構(gòu)成，其特征在于:所述頂層(15 )中設(shè)有蛇形管道(6 )和細(xì)胞操作腔(9 )，蛇形管道(6 )的溶液流入口上設(shè)有兩個(gè)流入通道(2)，兩個(gè)流入通道(2)的入口管道上分別設(shè)有保護(hù)劑入口(4)和緩沖溶液入口( 5)，蛇形管道(6 )的溶液流出通道連接細(xì)胞操作腔(9 )，細(xì)胞操作腔(9 )設(shè)有溶液出口( 11)和細(xì)胞進(jìn)出口通道(7 )，細(xì)胞進(jìn)出口通道(7 )上裝有轉(zhuǎn)矩控制微閥(8 )，所述細(xì)胞操作腔(9 )的兩側(cè)各設(shè)有一個(gè)半隔斷(10)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微流體細(xì)胞處理芯片，其特征在于:所述保護(hù)劑入口(4)和緩沖溶液入口(5)對(duì)稱于蛇形管道(6)的溶液流入口，保護(hù)劑入口(4)和緩沖溶液入口(5)的開口直徑相同；并且分別通過(guò)第一微流體芯片毛細(xì)管(13)與一個(gè)雙通道注射泵(I)的兩個(gè)注射器連接；所述入口管道的徑高比為1:41:5。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微流體細(xì)胞處理芯片，其特征在于:所述細(xì)胞操作腔(9)為上凹的長(zhǎng)方體，其容積為0.1-0.2mm3。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微流體細(xì)胞處理芯片，其特征在于:所述溶液出口(11)連接第三微流體芯片毛細(xì)管(18)，第三微流體芯片毛細(xì)管(18)上設(shè)有溶液出口開關(guān)(12)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微流體細(xì)胞處理芯片，其特征在于:所述蛇形管道(6)的橫截面為正方形，其邊長(zhǎng)d=0.05-0.2mm，相鄰管道間距=0.2~0.3mm，總長(zhǎng)度為1.5~2.5cm。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微流體細(xì)胞處理芯片，其特征在于:所述半隔斷(10)為凸形扁平長(zhǎng)方體，其與底層的間隙高度為30-40μπι。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微流體細(xì)胞處理芯片，其特征在于:所述底層(14)材質(zhì)為玻璃基片，頂層(15)材質(zhì)為聚二甲基硅氧烷；細(xì)胞進(jìn)出口通道(7)上面設(shè)有半徑4mm，深2mm的聚氨酯層(16)，所述聚氨酯層(16)面積為所述頂層面積的0.3%~Ο.5%，聚氨酯層中間連接轉(zhuǎn)矩控制微閥(8)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微流體細(xì)胞處理芯片，其特征在于:由底層(14)和頂層(15)構(gòu)成的所述芯片的長(zhǎng):寬:高=60~80:45-55:1~3。
9.一種權(quán)利要求1至8任一項(xiàng)所述的微流體細(xì)胞處理芯片的應(yīng)用方法，包括低溫保護(hù)劑加載方法和低溫保護(hù)劑去除的方法，其特征在于: 所述低溫保護(hù)劑加載方法的步驟為: a)打開轉(zhuǎn)矩控制微閥(8)和溶液出口開關(guān)(12)，用移液器將細(xì)胞及緩沖溶液注入與細(xì)胞進(jìn)出通道入口(7)連接的第二微流體芯片毛細(xì)管(17)，將一注射器連接第二微流體芯片毛細(xì)管(17)，推動(dòng)注射器使得細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞操作腔(9); b)關(guān)閉轉(zhuǎn)矩控制微閥(8)，打開雙通道注射泵(I)中的低溫保護(hù)劑注射器和緩沖溶液注射器，緩慢增加低溫保護(hù)劑的流速，緩慢減小緩沖溶液的流速，使得混合后的溶液中低溫保護(hù)劑的濃度連續(xù)增加； c)在對(duì)細(xì)胞低溫保護(hù)劑加載的同時(shí)，用顯微鏡觀察細(xì)胞體積的變化； d)當(dāng)細(xì)胞達(dá)到處理要求后，關(guān)閉雙通道注射泵(I)中的兩個(gè)注射器，打開轉(zhuǎn)矩控制微閥(8)，關(guān)閉溶液出口開關(guān)(12); e)打開低溫保護(hù)劑注射器，使得細(xì)胞從細(xì)胞操作腔經(jīng)細(xì)胞進(jìn)出通道(7)沖出芯片，加載過(guò)程完畢； 所述低溫保護(hù)劑去除的方法步驟為:a)打開轉(zhuǎn)矩控制微閥(8)和溶液出口開關(guān)(12)，用移液器將細(xì)胞及保護(hù)劑注入與細(xì)胞進(jìn)出通道(7)入口連接的第二微流體芯片毛細(xì)管(17)，將一注射器連接第二微流體芯片毛細(xì)管(17)，推動(dòng)注射器使得細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞操作腔(9)； b)關(guān)閉轉(zhuǎn)矩控制微閥(8)，打開雙通道注射泵(I)中的低溫保護(hù)劑注射器和緩沖溶液注射器，緩慢減小低溫保護(hù)劑的流速，緩慢增加緩沖溶液的流速，使得混合后的溶液中低溫保護(hù)劑的濃度連續(xù)減小； c)在對(duì)細(xì)胞低溫保護(hù)劑去除的同時(shí)，用顯微鏡觀察細(xì)胞體積的變化； d)當(dāng)細(xì)胞達(dá)到處理要求后，關(guān)閉雙通道注射泵(I)中的兩個(gè)注射器，打開轉(zhuǎn)矩控制微閥(8)，關(guān)閉溶液出口開關(guān)(12)； e)打開緩沖溶液注射器，使得細(xì)胞從細(xì)胞操作腔(9)經(jīng)細(xì)胞進(jìn)出通道(7)沖出芯片，去除過(guò)程完 畢。
【文檔編號(hào)】C12M1/00GK103451090SQ201310425428
【公開日】2013年12月18日 申請(qǐng)日期:2013年9月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月18日
【發(fā)明者】周新麗, 周楠峰, 楊云, 李維杰 申請(qǐng)人:上海理工大學(xué)