用于培養(yǎng)及檢測(cè)肺癌細(xì)胞的微流控芯片制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種微流控芯片的制備方法，具體涉及一種用于培養(yǎng)及檢測(cè)肺癌細(xì)胞的微流控芯片制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]肺癌又名支氣管癌，其發(fā)生于支氣管粘膜上皮，是發(fā)病率和死亡率增長(zhǎng)最快，對(duì)人群健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一。由于肺癌早期癥狀不明顯，常常發(fā)現(xiàn)時(shí)已經(jīng)到了晚期，因此，對(duì)肺癌進(jìn)行早期診斷和早期治療是防治肺癌并降低病死率的最有效方法。目前臨床上，肺癌的常見(jiàn)診斷方法有如下幾種:X射線檢測(cè)、電子計(jì)算機(jī)斷層掃描(CO、磁共振斷層掃描(MRI )、痰脫落細(xì)胞檢查、纖維支氣管檢查、經(jīng)皮肺穿刺活檢等，雖然此類檢查方法能達(dá)到預(yù)期肺癌診斷的效果，但是采用這些方法的設(shè)備龐大、價(jià)格昂貴，對(duì)病人創(chuàng)傷大，還需要熟練操作的專業(yè)人員進(jìn)行操作，并且得到的結(jié)果還要專業(yè)的醫(yī)務(wù)人員進(jìn)行分析處理，大大加大了醫(yī)務(wù)人員的負(fù)擔(dān)。
[0003]微流控芯片(microfluidic chip),又稱微全分析系統(tǒng)(micro total analysissystem, i~TAS)或者芯片實(shí)驗(yàn)室(lab-on-a_chip)，是指把化學(xué)和生物等領(lǐng)域中所涉及的樣品制備、反應(yīng)、分離、檢測(cè)及細(xì)胞培養(yǎng)、分選、裂解等基本操作單元集成或基本集成到一塊幾平方厘米(甚至更小)的芯片上，由微通道形成網(wǎng)絡(luò)，以可控流體貫穿整個(gè)系統(tǒng)，用以取代常規(guī)化學(xué)或生物實(shí)驗(yàn)室的各種功能的一種技術(shù)平臺(tái)，其具有分離效率高、分析速度快、分離模式多、所需樣品少、應(yīng)用范圍廣、自動(dòng)化程度高等優(yōu)點(diǎn)。但是，微流控芯片技術(shù)在當(dāng)前主要還處于起步階段，其用于肺癌細(xì)胞培養(yǎng)及檢測(cè)領(lǐng)域的相關(guān)技術(shù)和方法尚未見(jiàn)報(bào)道。
[0004]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的上述不足，本發(fā)明主要目的是提供一種能夠模擬人體肺部組織結(jié)構(gòu)，可對(duì)單個(gè)肺癌細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，并對(duì)其生長(zhǎng)狀況進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控的微流控芯片制備方法。
[0006]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:
用于培養(yǎng)及檢測(cè)肺癌細(xì)胞的微流控芯片制備方法，包括如下步驟:
制備掩膜:采用繪圖軟件分別繪制細(xì)胞培養(yǎng)層和微通道層掩膜圖，并采用菲林膠片打印該掩膜圖，制得細(xì)胞培養(yǎng)層掩膜和微通道層掩膜；
其中，細(xì)胞培養(yǎng)層掩膜上設(shè)有按矩陣排列的60個(gè)圓，每排12個(gè)，共5排，每個(gè)圓的直徑為1.5mm ;靠近矩陣圓的一端設(shè)有一矩形,矩形的長(zhǎng)為16mm,寬為11_ ;細(xì)胞培養(yǎng)層掩膜上的圓和矩形均不透光，其余部分為透光；
微通道層掩膜包括網(wǎng)狀線路和矩形，網(wǎng)狀線路的一端為橫向尺寸為2.5mm的長(zhǎng)方形，長(zhǎng)方形的一端分化為兩條最大橫向尺寸為5_的第一支路，每條第一支路再分化形成第二支路，第二支路再分化形成縱橫交錯(cuò)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的微支路，微支路的橫向尺寸為1mm，在微支路交錯(cuò)處、且與細(xì)胞培養(yǎng)層掩膜上的圓對(duì)應(yīng)的位置設(shè)有直徑為1.5mm的圓；矩形與網(wǎng)狀線路的另一端連接，矩形的長(zhǎng)為16mm，寬為11mm，該矩形與位于細(xì)胞培養(yǎng)層掩膜上的矩形相對(duì)應(yīng)；微通道層掩膜上的網(wǎng)狀線路和矩形部分為不透光，其余部分為透光；
配制水凝膠材料:按體積比為PEGDA =HEMA= (1.5-2.33):1的比例加入PEGDA和HEMA，形成PEGDA和HEMA混合物；加入NVP，NVP的體積為PEGDA和HEMA混合物體積的10%~15%，得到預(yù)聚物；在避光條件下加入光引發(fā)劑，光引發(fā)劑的質(zhì)量為預(yù)聚物質(zhì)量的0.39^0.45%，采用超聲振蕩，將混合物振蕩均勻無(wú)氣泡，靜置，得到水凝膠材料；
制備細(xì)胞培養(yǎng)層:將細(xì)胞培養(yǎng)層掩膜置于玻璃基片之上，細(xì)胞培養(yǎng)層掩膜距離玻璃基片Imm ;將玻璃基片與細(xì)胞培養(yǎng)層掩膜四周封閉，其內(nèi)形成一水凝膠灌注腔體，得到細(xì)胞培養(yǎng)層模具；在避光條件下采用注射器往細(xì)胞培養(yǎng)層模具腔體內(nèi)注入水凝膠材料，使水凝膠材料完全填充滿腔體；然后將細(xì)胞培養(yǎng)層模具整體置于一密閉空間內(nèi)，采用紫外燈垂直照射細(xì)胞培養(yǎng)層掩膜表面30分鐘，使水凝膠材料固化，在固化過(guò)程中始終充氮?dú)獗Ｗo(hù)；待水凝膠固化成型后，去掉細(xì)胞培養(yǎng)層掩摸，得到細(xì)胞培養(yǎng)層；
制備微通道層:將微通道層掩膜置于制得的細(xì)胞培養(yǎng)層6之上，微通道層掩膜距離細(xì)胞培養(yǎng)層Imm ;將細(xì)胞培養(yǎng)層與微通道層掩膜四周封閉，其內(nèi)形成一水凝膠灌注腔體，得到微通道層模具；在避光條件下采用注射器往微通道層模具腔體內(nèi)注入水凝膠材料，使水凝膠材料完全填充滿腔體。然后將微通道層模具整體置于一密閉空間內(nèi)，采用紫外燈垂直照射細(xì)胞培養(yǎng)層掩膜表面10~20分鐘，使水凝膠材料固化，在固化過(guò)程中始終充氮?dú)獗Ｗo(hù)。待水凝膠固化成型后，去掉微通道層掩摸，得到微通道層；
洗脫及制備封蓋層:將制得的微通道層置于PBS緩沖液中進(jìn)行洗脫，去除未反應(yīng)完全的水凝膠材料，再用PDMS封蓋，形成封蓋層；完成微流控芯片的制備。
[0007]進(jìn)一步，所述水凝膠材料中，PEGDA與HEMA的體積比為1.5:1，NVP的體積為PEGDA與HEMA總體積的10%，光引發(fā)劑的質(zhì)量為預(yù)聚物質(zhì)量的0.4%。
[0008]更進(jìn)一步，所述水凝膠材料中，PEGDA與HEMA的體積比為2.3:1，NVP的體積為PEGDA與HEMA總體積的15%，光引發(fā)劑的質(zhì)量為預(yù)聚物質(zhì)量的0.3%。
[0009]相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有如下有益效果:
1、利用本發(fā)明方法制備的微流控芯片，其細(xì)胞培養(yǎng)層上具有多個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)室，最多可同時(shí)培養(yǎng)60組細(xì)胞樣本；將每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)室的直徑設(shè)置為1.5_，可在同等厚度的情況下，大大增加細(xì)胞培養(yǎng)室的體積，有利于細(xì)胞貼壁，有利于細(xì)胞觸角、鞭毛立體生長(zhǎng)。
[0010]2、在微通道層上設(shè)置有模擬人體肺部組織結(jié)構(gòu)的流體微通道，可通過(guò)流體微通道進(jìn)樣口注入細(xì)胞懸浮液或培養(yǎng)液，細(xì)胞懸浮液或培養(yǎng)液通過(guò)流體微通道的分流作用均勻的充滿每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)室，該流體微通道完全模擬人體肺部組織結(jié)構(gòu)，為細(xì)胞提供更接近于人體的生長(zhǎng)環(huán)境，其代謝產(chǎn)物非常接近于人體細(xì)胞的代謝產(chǎn)物，使檢測(cè)數(shù)據(jù)更加貼近于人體真實(shí)情況，為后續(xù)的分析工作提供更準(zhǔn)確的科學(xué)依據(jù)，以利于對(duì)肺癌的早期診斷。
[0011]3、代謝液收集池為16mmX Ilmm的矩形槽結(jié)構(gòu)，其收集的細(xì)胞代謝液體積完全滿足檢測(cè)需要，可直接采用卟啉傳感器可視陣列芯片或其他檢測(cè)儀器對(duì)代謝液收集池中的細(xì)胞代謝液進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)，省略了對(duì)代謝液收集池中的代謝液進(jìn)行收集的步驟，避免了因各微流控芯片培養(yǎng)的細(xì)胞樣本的差異性對(duì)檢測(cè)數(shù)據(jù)的影響。
[0012]4、采用本發(fā)明配方制成的水凝膠材料，具有良好的生物相容性、細(xì)胞粘附力、易得性、低消耗性，制成的水凝膠芯片進(jìn)一步的模擬人體內(nèi)部組織環(huán)境，為下一步的肺癌細(xì)胞代謝液標(biāo)志物檢測(cè)打下基礎(chǔ)。
[0013]
【附圖說(shuō)明】
[0014]圖1為細(xì)胞培養(yǎng)層結(jié)構(gòu)示意圖；
圖2為微通道層結(jié)構(gòu)示意圖；
圖3為封蓋層結(jié)構(gòu)示意圖；
圖4為采用紫外線照射細(xì)胞培養(yǎng)層掩膜示意圖；
圖5為固化而成的細(xì)胞培養(yǎng)層剖視圖；
圖6為采用紫外線照射微通道層掩膜示意圖；
圖7固化而成的微通道層剖視圖；
圖8為微流控芯片剖視圖。
[0015]其中，I為細(xì)胞培養(yǎng)室，2為代謝液收集池a部，3為流體微通道，4為細(xì)胞捕獲孔，5為代謝液收集池b部，6為細(xì)胞培養(yǎng)層，7為微通道層，8為封蓋層，9為門，10為檢測(cè)窗口，11為通孔，12為通氣孔，13為泵孔。
[0016]
【具體實(shí)施方式】
[0017]下面結(jié)合附圖和實(shí)例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)地說(shuō)明。
[0018]參見(jiàn)圖1~圖8:用于培養(yǎng)及檢測(cè)肺癌細(xì)胞的微流控芯片制備方法，包括如下步驟:
制備掩膜:采用繪圖軟件分別繪制細(xì)胞培養(yǎng)層和微通道層掩膜圖，并采用菲林膠片打印該掩膜圖，制得細(xì)胞培養(yǎng)層掩膜和微通道層掩膜，細(xì)胞培養(yǎng)層掩膜與微通道層掩膜的形狀、大小一樣；繪圖軟件可采用coreldraw等。
[0019]其中，細(xì)胞培養(yǎng)層掩膜上設(shè)有按矩陣排列的60個(gè)圓，每排12個(gè)，共5排，每個(gè)圓的直徑為1.5mmο靠近矩陣圓的一端設(shè)有一矩形,矩形的長(zhǎng)為16mm,寬為11mm。細(xì)胞培養(yǎng)層掩膜上的圓和矩形均不透光，其余部分為透光。
[0020]微通道層掩膜包括網(wǎng)狀線路和矩形，網(wǎng)狀線路的一端為橫向尺寸為2.5mm的長(zhǎng)方形，長(zhǎng)方形的一端分化為兩條最大橫向尺寸為5mm的第一支路,每條第一支路再分化形成第二支路，第二支路再分化形成縱橫交錯(cuò)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的微支路，微支路的橫向尺寸為1mm，在微支路交錯(cuò)處、且與細(xì)胞培養(yǎng)層掩膜上的圓對(duì)應(yīng)的位置設(shè)有直徑為1.5mm的圓。矩形與網(wǎng)狀線路的另一端連接，矩形的長(zhǎng)為16mm，寬為11mm，該矩形與位于細(xì)胞培養(yǎng)層掩膜上的矩形相對(duì)應(yīng)。微通道層掩膜上的網(wǎng)狀線路和矩形部分為不透光，其余部分為透光。
[0021]配制水凝膠材料:按體積比為PEGDA =HEMA= (1.5-2.33):1的比例加入PEGDA和HEMA,形成PEGDA和HEMA混合物。加入NVP，NVP的體積為PEGDA和HEMA混合物體積的10°/『15%，得到預(yù)聚物。在避光條件下加入光引發(fā)劑，光引發(fā)劑的質(zhì)量為預(yù)聚物質(zhì)量的0.3%，采用超聲振蕩，將混合物振蕩均勻無(wú)氣泡，靜置，得到水凝膠材料。上述各材料的加入時(shí)間和順序沒(méi)有限制，在加入光引發(fā)劑時(shí)，需要采取避光措施。其中，PEGDA為聚乙二醇雙丙烯酸酯，HEMA為甲基丙烯酸羥乙酯，NVP為N-乙烯基吡咯烷酮，光引發(fā)劑采用Irgacure2959光引發(fā)劑。
[0022]PEGDA (聚乙二醇雙丙烯酸酯)在光引發(fā)劑和紫外光作用下能在室溫下迅速聚合成聚乙二醇雙丙烯酸酯水凝膠。HEMA (甲基丙烯酸羥乙酯)，可有效地進(jìn)一步提高芯片表面的親水性，能夠明顯改善聚乙二醇雙丙烯酸酯水凝膠材料的細(xì)胞親和性。NVP(N-乙烯基吡咯烷酮)有較好固化特性，增加水凝膠芯片的韌性。Irgacure2959是一種水溶性光引發(fā)劑，生物相容性好。采用如上配方制成的水凝膠材料，具有良好的生物相容性、細(xì)胞粘附力、易得性、低消耗性，制成的水凝膠芯片進(jìn)一步的模擬人體內(nèi)部組織環(huán)境，為下一步的肺癌細(xì)胞代謝液標(biāo)志物檢測(cè)打下基礎(chǔ)。
[0023]制備細(xì)胞培養(yǎng)層:將細(xì)胞培養(yǎng)層掩膜置于玻璃基片之上，細(xì)胞培養(yǎng)層掩膜距離玻璃基片Imm ;將玻璃基片與細(xì)胞培養(yǎng)層掩膜四周封閉，其內(nèi)形成一水凝膠灌注腔體，得到細(xì)胞培養(yǎng)層模具。在避光條件下采用注