Col4a5基因突變體及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了COL4A5基因突變體及其應(yīng)用，具體涉及分離的編碼COL4A5突變體的核酸，分離的多肽，篩選易患AS綜合征的生物樣品的方法，篩選易患AS綜合征的生物樣品的系統(tǒng)，以及用于篩選易患AS綜合征的生物樣品的試劑盒。其中，該分離的編碼COL4A5突變體的核酸，與SEQ ID NO：1相比，具有c.1365_1373delTCCAGGCCC突變。通過檢測(cè)該新突變體在生物樣品中是否存在，可以有效地檢測(cè)生物樣品是否易患AS綜合征。
【專利說明】C0L4A5基因突變體及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及C0L4A5基因突變體及其應(yīng)用。具體地，本發(fā)明涉及分離編碼C0L4A5 突變體的核酸，分離的多肽，篩選易患AS綜合征的生物樣品的方法，篩選易患AS綜合征的 生物樣品的系統(tǒng)，用于篩選易患AS綜合征的生物樣品的試劑盒，構(gòu)建體以及重組細(xì)胞。

【背景技術(shù)】
[0002] 遺傳性腎炎（即Alport綜合征，在本文中有時(shí)也稱為"AS綜合征"）是一種主要表 現(xiàn)為血尿、腎功能進(jìn)行性減退、感音神經(jīng)性耳聾和眼部異常的遺傳性腎小球基底膜疾病。AS 是一種單病，存在遺傳異質(zhì)性，現(xiàn)在認(rèn)為共有3種遺傳方式，即性連鎖顯性遺傳、常染色體 顯性遺傳及常染色體隱性遺傳。性連鎖顯性遺傳(0MIM =301050)為本病主要遺傳方式，約 占85%，致病基因?yàn)镃0L4A5,基因突變的發(fā)生率約為1/10000?1/5000。而1/7?1/3家系 按常染色體顯性遺傳(MIM ：203780)方式遺傳，致病基因?yàn)镃0L4A3及C0L4A4。常染色體隱 性遺傳方式（MIM :104200)并不多見，致病基因?yàn)槌Ｈ旧w基因C0L4A3,因而一般近親結(jié)婚 才有發(fā)病的可能。本類疾病的致病相關(guān)機(jī)制已有較多報(bào)道，但目前仍不明確。
[0003] 因而，目前對(duì)AS綜合征的研究尤其是其致病突變的確定仍有待深入。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明旨在至少解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題之一。為此，本發(fā)明的一個(gè)目的 在于提出一種能夠有效篩選易患AS綜合征的生物樣品的方法。
[0005] 本發(fā)明是基于發(fā)明人的下列工作完成的：發(fā)明人通過目標(biāo)區(qū)域捕獲聯(lián)合候 選基因突變驗(yàn)證的方法確定了AS綜合征的一個(gè)新的致病突變--C0L4A5基因的 c. 1365_1373delTCCAGGCCC突變。
[0006] 根據(jù)本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提出了一種分離的編碼C0L4A5突變體的核酸。根 據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述核酸與SEQ ID N0 :1相比，具有c. 1365_1373delTCCAGGCCC突變， 即相對(duì)于野生型C0L4A5基因，本發(fā)明的C0L4A5基因突變體的cDNA缺失第1365位到第1373 位堿基TCCAGGCCC。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，發(fā)明人確定了 C0L4A5基因的突變體，該突變體 與AS綜合征的發(fā)病密切相關(guān)，從而通過檢測(cè)該突變體在生物樣品中是否存在，可以有效地 檢測(cè)生物樣品是否易患AS綜合征。
[0007] 根據(jù)本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提出了一種分離的多肽。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施 例，與SEQIDN0:2相比，所述分離的多肽具有p.456_458delPGP突變，即該突變是由于 c. 1365_1373delTCCAGGCCC突變而引起的，具體地，相對(duì)于野生型C0L4A5,本發(fā)明的分離的 多肽（即C0L4A5突變體）缺失第456位至第458位氨基酸PGP。通過檢測(cè)生物樣品中是否 表達(dá)該多肽，可以有效地檢測(cè)生物樣品是否易患AS綜合征。
[0008] 根據(jù)本發(fā)明的第三方面，本發(fā)明提出了 一種篩選易患AS綜合征的生物樣品 的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該方法包括以下步驟：從所述生物樣品提取核酸樣本； 確定所述核酸樣本的核酸序列；所述核酸樣本的核酸序列與SEQ ID N0:1相比，具有 c. 1365_1373delTCCAGGCCC突變是所述生物樣品易患AS綜合征的指示。通過根據(jù)本發(fā)明實(shí) 施例的篩選易患AS綜合征的生物樣品的方法，可以有效地篩選易患AS綜合征的生物樣品。
[0009] 根據(jù)本發(fā)明的第四方面，本發(fā)明提出了一種篩選易患AS綜合征的生物樣品的系 統(tǒng)。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該系統(tǒng)包括：核酸提取裝置，所述核酸提取裝置用于從所述生物 樣品提取核酸樣本；核酸序列確定裝置，所述核酸序列確定裝置與所述核酸提取裝置相連， 用于對(duì)所述核酸樣本進(jìn)行分析，以便確定所述核酸樣本的核酸序列；判斷裝置，所述判斷裝 置與所述核酸序列確定裝置相連，以便基于所述核酸樣本的核酸序列與SEQIDN0 :1相比， 是否具有c. 1365_1373delTCCAGGCCC突變，判斷所述生物樣品是否易患AS綜合征。利用該 系統(tǒng)，能夠有效地實(shí)施前述篩選易患AS綜合征的生物樣品的方法，從而可以有效地篩選易 患AS綜合征的生物樣品。
[0010] 根據(jù)本發(fā)明的第五方面，本發(fā)明提出了一種用于篩選易患AS綜合征的生物樣品 的試劑盒。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該試劑盒含有：適于檢測(cè)C0L4A5基因突變體的試劑，其中 與SEQIDN0:1相比，該C0L4A5基因突變體具有c. 1365_1373delTCCAGGCCC突變。利用根 據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例的試劑盒，能夠有效地篩選易患AS綜合征的生物樣品。
[0011] 根據(jù)本發(fā)明的第六方面，本發(fā)明還提出了一種構(gòu)建體。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該構(gòu) 建體包含前面所述的分離的編碼C0L4A5突變體的核酸。由此，利用本發(fā)明的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化受 體細(xì)胞獲得的重組細(xì)胞，能夠有效地用于篩選治療AS綜合征的藥物。
[0012] 根據(jù)本發(fā)明的第七方面，本發(fā)明還提出了一種重組細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該 重組細(xì)胞是通過前面所述的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞而獲得的。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，利 用本發(fā)明的重組細(xì)胞，能夠有效地篩選治療AS綜合征的藥物。
[0013] 本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點(diǎn)將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變 得明顯，或通過本發(fā)明的實(shí)踐了解到。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0014] 本發(fā)明的上述和/或附加的方面和優(yōu)點(diǎn)從結(jié)合下面附圖對(duì)實(shí)施例的描述中將變 得明顯和容易理解，其中 ：
[0015] 圖1顯示了根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的篩選易患AS綜合征的生物樣品的系統(tǒng)及其組成 部分的示意圖，其中，
[0016] 圖1A為根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的篩選易患AS綜合征的生物樣品的系統(tǒng)的示意圖，
[0017] 圖1B為根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的核酸提取裝置的示意圖，
[0018] 圖1C為根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的核酸序列確定裝置的示意圖；
[0019] 圖2顯示了根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的AS綜合征患者家系的家系圖；
[0020] 圖3顯示了根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，圖2所示AS綜合征患者家系中未發(fā)病男 性、女性患者及男性患者的C0L4A5基因c. 1365_1373delTCCAGGCCC突變位點(diǎn)的代表性 Sanger測(cè)序驗(yàn)證峰圖。

【具體實(shí)施方式】
[0021] 下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施例，所述實(shí)施例的示例在附圖中示出，其中自始至終 相同或類似的標(biāo)號(hào)表示相同或類似的元件或具有相同或類似功能的元件。下面通過參考附 圖描述的實(shí)施例是示例性的，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制。
[0022] C0L4A5基因突變體
[0023] 根據(jù)本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提出了一種分離的編碼C0L4A5突變體的核酸。根 據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述核酸與SEQ ID N0 :1相比，具有c. 1365_1373delTCCAGGCCC突變。 在本文中所使用的表達(dá)方式"編碼C0L4A5突變體的核酸"，是指與編碼C0L4A5突變體的 基因相對(duì)應(yīng)的核酸物質(zhì)，即核酸的類型不受特別限制，可以是任何包含與C0L4A5突變體的 編碼基因相對(duì)應(yīng)的脫氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于DNA、RNA或 cDNA。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)具體示例，前面所述的編碼C0L4A5突變體的核酸為DNA。根據(jù)本 發(fā)明的實(shí)施例，發(fā)明人確定了 C0L4A5基因的突變體，該突變體與AS綜合征的發(fā)病密切相 關(guān)，從而通過檢測(cè)該突變體在生物樣品中是否存在，可以有效地檢測(cè)生物樣品是否易患AS 綜合征，也可以通過檢測(cè)該突變體在生物體中是否存在，可以有效地預(yù)測(cè)生物體是否易患 AS綜合征。
[0024] 對(duì)于本發(fā)明說明書和權(quán)利要求書中，提及核酸，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，實(shí)際包 括互補(bǔ)雙鏈的任意一條，或者兩條。為了方便，在本說明書和權(quán)利要求書中，雖然多數(shù)情況 下只給出了一條鏈，但實(shí)際上也公開了與之互補(bǔ)的另一條鏈。例如，提及SEQ ID N0 :1，實(shí)際 包括其互補(bǔ)序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員還可以理解，利用一條鏈可以檢測(cè)另一條鏈，反之亦然。
[0025] 該編碼C0L4A5突變體的核酸，是本申請(qǐng)的發(fā)明人通過目標(biāo)區(qū)域捕獲測(cè)序聯(lián)合候 選基因突變驗(yàn)證的方法確定的AS綜合征的致病基因C0L4A5的新的致病突變。該致病突變 位點(diǎn)在現(xiàn)有技術(shù)中并未被提到。需要說明的是，在本文中所使用的表達(dá)方式"目標(biāo)區(qū)域捕獲 測(cè)序"是指利用特制的探針對(duì)客戶感興趣的某段特定序列進(jìn)行捕獲富集后，再利用第二代 測(cè)序技術(shù)進(jìn)行高通量測(cè)序及基因組分析的方法。利用該方法能夠獲得指定目標(biāo)區(qū)域的遺傳 信息，極大的提高了基因組中目標(biāo)區(qū)域的研究效率，顯著降低了研究成本。在本發(fā)明中，將 該方法用于識(shí)別和研究與疾病相關(guān)的編碼區(qū)域內(nèi)的結(jié)構(gòu)變異，進(jìn)而，結(jié)合大量的公共數(shù)據(jù) 庫(kù)提供的數(shù)據(jù)，有利于更好地解釋所得變異結(jié)構(gòu)之間的關(guān)聯(lián)和致病機(jī)理。
[0026] 其中，野生型C0L4A5基因的cDNA具有如下所示的核苷酸序列：

【權(quán)利要求】
1. 一種分離的編碼C0L4A5突變體的核酸，其特征在于，所述核酸與SEQ ID NO :1相比， 具有 c. 1365_1373delTCCAGGCCC 突變， 任選地，所述核酸為DNA。
2. -種分離的多肽，其特征在于，與SEQ ID N0:2相比，所述分離的多肽具有 p. 456_458delPGP 突變， 任選地，所述多肽是由權(quán)利要求1所述的核酸編碼的。
3. -種篩選易患AS綜合征的生物樣品的方法，其特征在于，包括以下步驟： 從所述生物樣品提取核酸樣本； 確定所述核酸樣本的核酸序列； 所述核酸樣本的核酸序列與SEQ ID NO :1相比，具有c. 1365_1373delTCCAGGCCC突變 是所述生物樣品易患AS綜合征的指示， 任選地，所述生物樣本為選自人體血液、皮膚、皮下組織的至少一種， 任選地，所述核酸樣本為全基因組DNA。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，從所述生物樣品提取核酸樣本進(jìn)一步包 括： 從所述生物樣品提取RNA樣本，優(yōu)選所述RNA樣本為mRNA ;以及 基于所述RNA樣本，通過反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，獲得cDNA樣本，所述cDNA樣本構(gòu)成所述核酸樣 本。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，確定所述核酸樣本的核酸序列進(jìn)一步包 括： 針對(duì)所述核酸樣本，構(gòu)建核酸測(cè)序文庫(kù)；以及 對(duì)所述核酸測(cè)序文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序，以便獲得由多個(gè)測(cè)序數(shù)據(jù)構(gòu)成的測(cè)序結(jié)果，任選地，采 用選自Hiseq2000、S0LiD、454和單分子測(cè)序裝置的至少一種對(duì)所述核酸測(cè)序文庫(kù)進(jìn)行測(cè) 序， 任選地，針對(duì)所述核酸樣本，構(gòu)建核酸測(cè)序文庫(kù)進(jìn)一步包括： 利用C0L4A5基因外顯子特異性引物，對(duì)所述核酸樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增；以及 針對(duì)所得到的擴(kuò)增產(chǎn)物，構(gòu)建所述核酸測(cè)序文庫(kù)， 任選地，所述特異性引物具有如SEQ ID NO :5-6所示的核苷酸序列。
6. -種篩選易患AS綜合征的生物樣品的系統(tǒng)，其特征在于，包括： 核酸提取裝置，所述核酸提取裝置用于從所述生物樣品提取核酸樣本； 核酸序列確定裝置，所述核酸序列確定裝置與所述核酸提取裝置相連，用于對(duì)所述核 酸樣本進(jìn)行分析，以便確定所述核酸樣本的核酸序列； 判斷裝置，所述判斷裝置與所述核酸序列確定裝置相連，以便基于所述核酸樣本的核 酸序列與SEQ ID N0:1相比，是否具有c. 1365_1373delTCCAGGCCC突變，判斷所述生物樣品 是否易患AS綜合征， 任選地，所述核酸提取裝置進(jìn)一步包括： RNA提取單元，所述RNA提取單元用于從所述生物樣品提取RNA樣本；以及 反轉(zhuǎn)錄單元，所述反轉(zhuǎn)錄單元與所述RNA提取單元相連，用于對(duì)所述RNA樣本進(jìn)行反轉(zhuǎn) 錄反應(yīng)，以便獲得cDNA樣本，所述cDNA樣本構(gòu)成所述核酸樣本。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的系統(tǒng)，其特征在于，所述核酸序列確定裝置進(jìn)一步包括： 文庫(kù)構(gòu)建單元，所述文庫(kù)構(gòu)建單元用于針對(duì)所述核酸樣本，構(gòu)建核酸測(cè)序文庫(kù)；以及 測(cè)序單元，所述測(cè)序單元與所述文庫(kù)構(gòu)建單元相連，用于對(duì)所述核酸測(cè)序文庫(kù)進(jìn)行測(cè) 序，以便獲得由多個(gè)測(cè)序數(shù)據(jù)構(gòu)成的測(cè)序結(jié)果， 任選地，所述文庫(kù)構(gòu)建單元進(jìn)一步包括： PCR擴(kuò)增模塊，所述PCR擴(kuò)增模塊中設(shè)置有C0L4A5基因外顯子特異性引物，以便利用所 述特異性引物，對(duì)所述核酸樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增， 任選地，所述特異性引物具有如SEQ ID NO :5-6所示的核苷酸序列， 任選地，所述測(cè)序單元包括選自HISEQ2000、S0LiD、454和單分子測(cè)序裝置的至少一 種。
8. -種用于篩選易患AS綜合征的生物樣品的試劑盒，其特征在于，含有： 適于檢測(cè)C0L4A5基因突變體的試劑，其中與SEQ ID N0:1相比，所述C0L4A5基因突變 體具有 c. 1365_1373delTCCAGGCCC 突變， 任選地，所述試劑為核酸探針或引物， 任選地，所述核酸探針或引物具有如SEQ ID NO :5-6所示的核苷酸序列。
9. 一種構(gòu)建體，其特征在于，包含權(quán)利要求1所述的分離的編碼C0L4A5突變體的核酸。
10. -種重組細(xì)胞，其特征在于，所述重組細(xì)胞是通過權(quán)利要求9所述的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化受 體細(xì)胞而獲得的。
【文檔編號(hào)】C12N15/12GK104450726SQ201310425262
【公開日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2013年9月17日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月17日
【發(fā)明者】朱慶燕, 朱倩, 王俊, 汪建, 楊煥明 申請(qǐng)人:深圳華大基因科技有限公司