專利名稱：一種用于細胞檢測的3d微流控結構及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種用于流式細胞檢測的三維微流控芯片結構型式及其制備方法。
背景技術：
流式細胞術是一種對處在液流中的細胞顆粒逐個進行多參數(shù)自動分析和檢測的 技術。它可較為精準地實現(xiàn)對細胞特征和細胞(或細胞器)組成的定性及定量分析，因而 在現(xiàn)代醫(yī)學研究和臨床診斷中有著極為重要的應用價值。流式細胞儀(FCM)就是基于上述 流式細胞術的基本原理，綜合利用光學、機械、流體動力學和計算機控制技術來實現(xiàn)細胞檢 測及分析功能的一種現(xiàn)代化生物醫(yī)學儀器。它的核心部件之一，是帶有特定流體控制結構 (通道)的流動室系統(tǒng)；其基本功能，是通過合理控制液流(包括鞘流及待測樣液)的運動 參數(shù)及形態(tài)，來實現(xiàn)對樣液的“水力聚焦”(hydro-focusing)。整個檢測/分析過程可概要 描述如下將經(jīng)熒光染色或標記的細胞懸浮液放入樣品管中，通過注射等方式壓入流動室； 流動室內(nèi)同時注入鞘流，在鞘流的夾裹作用下，樣液將被“聚焦”為寬度極小(與細胞分子 直徑約在同一數(shù)量級)的微小流束，從而使其中的細胞能排成單列，以一定速度逐個地進 入檢測區(qū)。在此區(qū)域內(nèi)，由光源系統(tǒng)產(chǎn)生的激光光束以特定角度照射到樣液上，在細胞上產(chǎn) 生散射光，并激發(fā)出熒光。利用光學傳感器對這些信號進行接收，并通過光電轉(zhuǎn)換器件將其 轉(zhuǎn)換成電信號，再將采集到的電信號做采樣編碼、濾波整流等后處理，最后通過DAQ數(shù)據(jù)采 集卡送入計算機進行分析，便可得到所需的細胞信息。由此可見，流式細胞儀流控結構的設 計與制造，對液流的聚焦效果，進而對整個儀器的檢測及分析精度，具有至關重要的影響。隨著現(xiàn)代醫(yī)學科技的發(fā)展，開發(fā)新型的高性能、便攜式的流式細胞分析儀，以進一 步提升分子細胞學檢測、分析的效率和水平，已成為一項迫在眉睫的任務。近年來，微機電 系統(tǒng)(MEMS)和微流控技術的興起和發(fā)展，為上述目標的實現(xiàn)提供了一種全新和有效的技 術手段。利用這一技術，我們可以在玻璃、硅片、有機聚合物等材料上制作微通道、微泵、微 閥、微電極和連接器等功能器件，因此也可方便地制作用于細胞檢測的微流動室結構，并可 望將其與微泵和光學檢測器件等集成到單一芯片上，形成所謂微流控芯片實驗室。相比于 傳統(tǒng)裝置，微流控芯片的微米級結構將顯著增大流體環(huán)境的面積/體積比，從而使系統(tǒng)性 能發(fā)生顯著改善(如體積減小、效率提高、成本降低，試樣和試劑消耗量下降等)，具有明顯 的技術和經(jīng)濟優(yōu)勢。然而，目前已有的用于細胞分析的微流控芯片，盡管具體形式和尺寸參數(shù)各不相 同，但卻基本都屬于一種“二維”聚焦結構，主要體現(xiàn)在整個流控結構系一次性刻蝕得到，所 有的液流通道及匯聚區(qū)都具有相同的深度，且底部平整，這使得流體的聚焦只能在芯片所 在二維平面內(nèi)實現(xiàn)(即樣液在左右兩側鞘流的夾裹下沿寬度方向匯聚)，而在與之垂直的 方向即通道的深度方向，則無法實現(xiàn)匯聚。這就有可能造成同一時刻有不止一個細胞分子 上下重疊通過檢測點(激光光束照射處)，影響到檢測結果的準確性。而理想的情況，是希 望樣液同時也能在垂直方向受到某種力或約束的作用，實現(xiàn)真正的“三維”聚焦，以保證通 過檢測點細胞數(shù)目的唯一性。這就需要對現(xiàn)有流控結構進行創(chuàng)新設計，使之既能滿足上述三維聚焦的功能需求，又便于加工制備，具有較好的經(jīng)濟性及實用性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種能夠?qū)崿F(xiàn)三維聚焦的新型細胞計數(shù)用微流控芯片結 構，以及加工制備這種結構的工藝方法。本發(fā)明的技術方案是這樣實現(xiàn)的—種用于細胞檢測的3D微流控結 構，該結構為上行式微流控結構，其結構由玻璃 蓋片和聚二甲基硅氧烷PDMS的流控結構和基底封接而成，流控結構由鞘流入流通道、樣液 入流通道、匯流腔、匯聚通道以及上行臺階和出口構成，所述的鞘流入流通道在樣液入流通 道左右兩側對稱排列，樣液入流通道在中間，此三股通道與匯流腔相通并具有相同的深度， 匯流腔通過上行臺階與匯聚通道相通，匯聚通道的深度小于匯流腔。一種用于細胞檢測的3D微流控結構，該結構為下行式微流控結構，其結構由玻璃 蓋片和聚二甲基硅氧烷PDMS的流控結構和基底封接而成，流控結構由鞘流入流通道、樣液 入流孔、匯流腔、匯聚通道以及下行臺階和出口構成，所述的鞘流入流通道為左右對稱排 列，與匯流腔相通并具有相同的深度，樣液入流孔位于匯流腔底部，匯流腔通過下行臺階與 匯聚通道相通，匯聚通道的深度大于匯流腔。一種用于細胞檢測的3D微流控結構的制備方法，采用兩次光刻，一次顯影的制備 方法，即(a)在硅片或玻璃基底的一表面涂覆一層負型感光材料；(b)提供第一塊掩模板，該掩模板的曝光圖案為上述微結構的二維圖案，利用紫外 光光束對負型感光材料進行曝光；(c)曝光后不顯影，緊接著再在第一層負型感光材料上涂覆第二層相同的負型感 光材料；(d)提供第二塊掩模板，制作上行式結構時，該第二塊掩模板的曝光圖案為鞘流、 樣流入流通道及匯流腔的二維圖案，制作下行式結構時該第二塊掩模板的曝光圖案為匯聚 通道的二維圖案，與第一塊掩模板對準后利用紫外光光束對負型感光材料進行二次曝光；(e)經(jīng)兩次曝光后，進行顯影程序，得到所需陽模；(f)在此陽模上注塑聚二甲基硅氧烷PDMS材料，固化后得到所需的3D微流控結 構。其中該負型感光材料均為SU-8光刻膠。在上行式結構中，由于匯流腔的深度比匯聚通道區(qū)大，而前后兩次涂覆負型感光 材料的總厚度正是聚二甲基硅氧烷PDMS微通道匯流腔的深度，因此第一層負型感光材料 涂覆的厚度等于匯聚通道區(qū)深度，第一塊掩模板的曝光圖案為整體微結構的二維圖案；第 二層負型感光材料涂覆的厚度等于匯流腔深度與匯聚通道深度之差，第二塊掩模板的曝光 圖案為液流入流通道及匯流腔的二維圖案。同理，在下行式結構中，由于匯流腔的深度比匯聚通道區(qū)小，因此第一層負型感光 材料涂覆的厚度等于匯流腔深度，第一塊掩模板的曝光圖案為整個微通道的二維圖案；第 二層負型感光材料涂覆的厚度等于匯聚通道深度減去匯流腔深度，第二塊掩模板的曝光圖 案為液流匯聚通道的二維圖案。
本發(fā)明所述用于流式細胞分析的新型3D微流控芯片結構，可以同時實現(xiàn)微流體 在垂直方向和水平方向的三維聚焦，從而保證了在某一時刻通過激光檢測點的細胞數(shù)目的 唯一性。該結構加工方便，用PDMS做結構材料，成本較低，生物兼容性較好。


圖1顯示的是2D微流控芯片細胞檢測結果圖2顯示的是本發(fā)明新型3D微流控芯片細胞檢測結果圖3-a為本發(fā)明上行式新型3D微流控結構示意(玻璃蓋片省略)圖3-b為本發(fā)明下行式新型3D微流控結構示意(玻璃蓋片省略)圖4至圖12顯示本發(fā)明聚二甲基硅氧烷PDMS微流控結構制備工藝示意圖。簡單符號說明1 玻璃該片2 PDMS流控結構3 基底4 鞘流入流通道5 樣液入流通道(孔)6 匯流腔7 匯聚通道8 上行臺階結構9 下行臺階結構10 出口100檢測激光20 基底21 第一層SU-8光刻膠22 第一塊掩模板23 紫外光光束24 第二層SU-8光刻膠25 第二塊掩模板26 SU-8 陽模27 PDMS 材料28 PDMS流控結構29 玻璃蓋片201 基底的表面
具體實施例方式圖1顯示的是2D微流控芯片細胞檢測結果。由于2D微流控芯片流體的聚焦只能 在芯片所在二維平面內(nèi)實現(xiàn)(即樣液在左右兩側鞘流的夾裹下沿寬度方向匯聚)，而在與 之垂直的方向即通道的深度方向，則無法實現(xiàn)匯聚。因此就有可能造成同一時刻有不止一 個細胞分子上下重疊通過檢測點(激光光束照射處)，影響到檢測結果的準確性。
圖2顯示的是本發(fā)明新型3D微流控芯片細胞檢測結果。由于在匯聚通道添加了 臺階結構，使得3D微流控芯片的流體在垂直方向也受到約束而實現(xiàn)聚焦，使得同一時刻只 有一個細胞通過檢測點，改善了 2D微流控芯片的不足。圖3-a為本發(fā)明上行式新型3D微流控結構示意(玻璃蓋片省略)。其結構由玻璃 蓋片(1)和聚二甲基硅氧烷(PDMS)流控結構2和基底3封接而成，流控結構2由鞘流入流 通道4、樣液入流通道5、匯流腔6、匯聚通道7以及上行臺階8和出口 10構成，所述的鞘流 入流通道4在樣液入流通道5左右兩側對稱排列，樣液入流通道5在中間，此三股通道與匯 流腔6相通并具有相同的深度，匯流腔6通過上行臺階8與匯聚通道7相通，匯聚通道7的 深度小于匯流腔6。圖3-b為本發(fā)明下行式新型3D微流控結構示意(玻璃蓋片省略)。其結構由玻璃 蓋片1和聚二甲基硅氧烷(PDMS)流控結構2和基底3封接而成，流控結構2由鞘流入流通 道4、樣液入流孔5、匯流腔6、匯聚通道7以及下行臺階9和出口 10構成，所述的鞘流入流 通道4為左右對稱排列，與匯流腔6相通并具有相同的深度，樣液入流孔5位于匯流腔6底 部，匯流腔6通過下行臺階9與匯聚通道7相通，匯聚通道7的深度大于匯流腔6。圖4至圖12，顯示本發(fā)明PDMS微流控結構制備工藝的示意 圖。首先，參考圖4，提 供一基底20，該基底20的材料一般為硅或玻璃。接著，參考圖5，涂覆第一層SU-8光刻膠 21于該基底20的一表面201上，該第一層SU-8光刻膠21為一種負型感光材料。接著，參考圖6，提供第一光掩模板22，利用紫外光光束23對該第一層SU_8光刻 膠21進行曝光程序，使得相對應部分的該第一層SU-8光刻膠21發(fā)生光固化反應而成為固 體。接著，參考圖7，在顯影程序之前，于第一層SU-8光刻膠21基礎上再涂覆第二層SU-8 光刻膠24。接著，參考圖8，提供第二光掩模板25，利用紫外光光束23對該第二層SU-8光 刻膠24進行曝光程序，使得相對應部分的該第二層SU-8光刻膠24發(fā)生光固化反應而成為 固體。由于第二塊掩模板曝光圖案的面積當小于該第一塊掩模板，因此，曝光后發(fā)生光固化 反應，第二層SU-8光刻膠24固化體積小于第一層SU-8光刻膠21固化體積，由此而形成 臺階形狀SU-8模具26。接著，參考圖9，對進行過光刻的第一層SU-8光刻膠21和第二層 SU-8光刻膠24共同進行顯影程序，未曝光部分被顯影液溶解掉，曝光部分保留下來，形成 臺階狀SU-8模具26。至此，臺階狀SU-8模具制作完成，接下來是PDMS澆鑄、固化、鉆孔、封裝等程序。 接著，參考圖10，將PDMS材料27澆鑄在SU-8模具26表面并固化。接著，參考圖11，去除 SU-8模具26后得到具有微流體通道的PDMS流控結構28。參考圖12，打孔，并使用玻璃29 封裝。(1)本發(fā)明所述新型3D微流控芯片結構描述為整體結構由玻璃蓋片1、聚二甲基硅氧烷PDMS流控結構2和基底3封接而成。流 控結構2由左右對稱的鞘流入流通道4、樣液入流通道(孔)5、匯流腔6、匯聚通道7以及臺 階狀結構8、9構成和出口 10。為實現(xiàn)三維聚焦，匯聚通道和前述其它結構區(qū)具有不同的深 度，即在它們的結合處設計有臺階狀結構。根據(jù)匯聚液流Z向約束方位的不同，又可分為液 流上行式與下行式兩種結構(a)上行式。鞘流、樣液入流通道和匯流腔一次刻蝕形成，具有相同的深度，并通過 上行臺階與較淺的匯聚通道相通。這樣，液流被壓入芯片并進行匯聚后，將溯臺階而上，樣液將同時受左、右、下三個方向的作用(約束)而實現(xiàn)三維聚焦；(b)下行式。鞘流入流通道和匯流腔一次刻蝕形成，具有相同的深度，并通過下行 臺階與較深的匯聚通道相通；樣液通過匯流腔底部的入流孔進入芯片。液流在匯流腔匯聚 后，將沿臺階向下流入?yún)R聚通道，樣液將始終被壓迫在通道底部，同時受左、右、上三個方向 的作用而實現(xiàn)三維聚焦；(2)本發(fā)明所述微流控芯片聚二甲基硅氧烷PDMS流控結構的制作步驟是

(a)提供一基底20，并在該基底一表面涂覆一層負型感光材料21 ；(b)提供第一塊掩模板22，利用紫外光光束23對該負型感光材料21進行曝光；(c)曝光后先不進行顯影程序，緊接著在第一層負型感光材料21基礎上涂覆第二 層負型感光材料24 ；(d)提供第二光掩模板25，利用紫外光光束對該第二層負型感光材料24進行曝 光；(e)兩次曝光后，利用顯影液對該第一層和該第二層負型感光材料進行顯影處理， 可得到臺階狀陽模26;(f)在此陽模上注塑聚二甲基硅氧烷PDMS材料27，固化后得到所需微流控芯片的 PDMS流控結構28。(g)對“下行式”結構，在匯流腔底部利用激光打孔，形成樣液入流孔。(h)將脫模后的PDMS流控結構反置粘貼在基底210上，并在其上表面覆蓋玻璃 29，形成封裝芯片。由此，可以解決具有臺階狀結構通道的聚二甲基硅氧烷PDMS微流控芯片制備的 問題。
權利要求
1.一種用于細胞檢測的3D微流控結構，其特征在于，該結構為上行式微流控結構，其 結構由玻璃蓋片(1)和聚二甲基硅氧烷PDMS的流控結構(2)和基底(3)封接而成，流控結 構(2)由鞘流入流通道(4)、樣液入流通道( 、匯流腔(6)、匯聚通道(7)以及上行臺階(8) 和出口(10)構成，所述的鞘流入流通道(4)在樣液入流通道( 左右兩側對稱排列，樣液 入流通道( 在中間，此三股通道與匯流腔(6)相通并具有相同的深度，匯流腔(6)通過上 行臺階⑶與匯聚通道(7)相通，匯聚通道(7)的深度小于匯流腔(6)。
2.一種用于細胞檢測的3D微流控結構，其特征在于，該結構為下行式微流控結構，其 結構由玻璃蓋片(1)和聚二甲基硅氧烷PDMS的流控結構(2)和基底(3)封接而成，流控結 構⑵由鞘流入流通道G)、樣液入流孔(5)、匯流腔(6)、匯聚通道(7)以及下行臺階(9) 和出口(10)構成，所述的鞘流入流通道⑷為左右對稱排列，與匯流腔(6)相通并具有相 同的深度，樣液入流孔( 位于匯流腔(6)底部，匯流腔(6)通過下行臺階(9)與匯聚通道 (7)相通，匯聚通道(7)的深度大于匯流腔(6)。
3.—種如權利要求1或2所述用于細胞檢測的3D微流控結構的制備方法，其特征在 于，采用兩次光刻，一次顯影的制備方法，即(a)在硅片或玻璃基底00)的一表面涂覆一層負型感光材料；(b)提供第一塊掩模板(22)，該掩模板的曝光圖案為上述微結構的二維圖案，利用紫 外光光束對負型感光材料進行曝光；(c)曝光后不顯影，緊接著再在第一層負型感光材料上涂覆第二層相同的負型感光材料；(d)提供第二塊掩模板(25)，制作上行式結構時，該第二塊掩模板的曝光圖案為鞘流、 樣流入流通道及匯流腔的二維圖案，制作下行式結構時該第二塊掩模板的曝光圖案為匯聚 通道的二維圖案，與第一塊掩模板02)對準后利用紫外光光束對負型感光材料進行 二次曝光；(e)經(jīng)兩次曝光后，進行顯影程序，得到所需陽模06)；(f)在此陽模上注塑聚二甲基硅氧烷PDMS材料(XT)，固化后得到所需的3D微流控結 構(28)。
4.如權利要求3所述的方法，其中該負型感光材料均為SU-8光刻膠。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于細胞檢測的3D微流控結構及其制備方法，整體結構由玻璃蓋片、聚二甲基硅氧烷PDMS流控結構和基底封接而成。其PDMS流控結構上刻有鞘流及樣流入流通道(孔)、匯流腔及用以實現(xiàn)三維聚焦的臺階狀結構和匯聚通道。在匯流腔，所設計的通道形狀可實現(xiàn)流體左、右兩個方向聚焦，在匯聚通道中，液流通過一個臺階狀結構，受到垂直方向的約束，從而可實現(xiàn)三維聚焦。同時提出了采用“兩次光刻、一次顯影”的方式來制備上述微流控結構的工藝方法。本發(fā)明用簡單的結構方案即可實現(xiàn)三維流體聚焦，應用效果好、加工方便；用聚二甲基硅氧烷PDMS做結構材料，成本低，生物兼容性好。
文檔編號G01N15/14GK102128777SQ20101055723
公開日2011年7月20日 申請日期2010年11月24日 優(yōu)先權日2010年11月24日
發(fā)明者李義平, 王冰, 王小鵬, 王敬元, 王永泉, 陳花玲 申請人:西安交通大學