專利名稱：一種細(xì)胞芯片制作方法及其器具的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)胞的檢測方法，具體涉及一種細(xì)胞芯片。
背景技術(shù)：
目前培養(yǎng)細(xì)胞制備細(xì)胞芯片的方法有3種細(xì)胞離心沉淀紙包固定的石蠟包埋法、瓊脂糖為基質(zhì)固定的石蠟包埋法以及瓊脂糖平板上鑿孔，孔內(nèi)灌注細(xì)胞固定的石蠟包埋法。這三種方法各有其缺點，前兩種方法導(dǎo)致過于細(xì)胞彌散，盡管后一種方法能得到密度較高均勻一致的細(xì)胞，但工藝流程多，操作復(fù)雜。此外，制作細(xì)胞芯片時，上述三種處理方法的最大缺陷在于制作細(xì)胞芯片時均需按制作組織芯片的方法對受體石蠟塊進(jìn)行穿刺制作受體細(xì)胞芯條，由于培養(yǎng)細(xì)胞無間質(zhì)纖維，穿刺細(xì)胞時常導(dǎo)致細(xì)胞分散，不利于重復(fù)穿刺制作細(xì)胞芯片。隨著人類基因組計劃的完成，后基因組時代的功能基因組學(xué)研究方法正朝著大規(guī)模、高能量的方向發(fā)展?；蛐酒?、組織芯片、蛋白質(zhì)芯片等芯片的研制開發(fā)為功能基因組學(xué)的研究提供了一系列高通量的研究工具，極大地加快了功能基因組的研究步伐。但是目前市場上的各種芯片不能滿足于大規(guī)模原位檢測各種蛋白和基因在永生化的良惡性研究培養(yǎng)細(xì)胞株中表達(dá)。因此研究開發(fā)出一種更為簡單實用、一步到位的制作細(xì)胞芯片方法，使細(xì)胞芯片用于基因原位表達(dá)的研究則是需要解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供一種工藝簡單，不需要穿刺制作的新方法，制作的細(xì)胞芯片可用于基因原位表達(dá)的研究。
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)發(fā)明目的的。經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)、收集固定細(xì)胞、細(xì)胞脫水、細(xì)胞透明后，浸蠟是將細(xì)胞懸液從Tube管移入透明條形模具中，將在條形模具中均勻沉積的細(xì)胞與模具直立浸入溶點為58℃的低溶點石蠟溶液中浸蠟三次，受體石蠟塊和受體孔的制作是制作間距為2mm的點陣列模具紙貼于按細(xì)胞芯片的密度制作的相應(yīng)規(guī)格大小的受體石蠟塊上，依次用真空穿刺針在網(wǎng)格紙中穿出受體孔，受體細(xì)胞芯片石蠟塊的制作是將經(jīng)置于37℃溫箱內(nèi)軟化的細(xì)胞石蠟混合物截去條形模具的下端，從切端擠出條形細(xì)胞石蠟混合物，并截斷成段，放入相應(yīng)石蠟塊受體孔中。浸蠟用一種透明條形模具，該模具底部直徑為1.0mm，底部塞有少量阻擋細(xì)胞并有利于松節(jié)油經(jīng)模具底部流出的棉花。
下面結(jié)合附圖進(jìn)一步詳述本發(fā)明。


圖1為條形模具示意圖；其中1、底部直徑1mm模具；2、底部填塞的棉花圖2為條形細(xì)胞石蠟混合物；
圖3為置于Tube管中的石蠟細(xì)胞芯條；圖4為受體細(xì)胞點陣圖；圖5為受體細(xì)胞點陣圖；圖6為免疫組化，4×細(xì)胞微陣列圖；圖7為HE，4×細(xì)胞微陣列圖；圖8為HE，20×細(xì)胞微陣列圖；圖9為免疫組化，20×細(xì)胞微陣列圖；圖10為免疫組化，20×細(xì)胞微陣列圖。
制作細(xì)胞芯片的具體方法如下(1)培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)各種組織和器官來源的永生化惡性腫瘤細(xì)胞和良性永生化細(xì)胞株于100ml培養(yǎng)瓶，每種細(xì)胞培養(yǎng)3瓶。(2)收集固定細(xì)胞待細(xì)胞長至90％密度時，收集細(xì)胞進(jìn)行如下處理D-Hanker’s液洗滌細(xì)胞4次，充分洗凈殘余培養(yǎng)基，培養(yǎng)瓶中加入1ml D-Hanker’s液，塑料細(xì)胞刮子輕輕刮下細(xì)胞，細(xì)胞移入1.0ml～1.5ml Tube管中，離心2500轉(zhuǎn)/分，共5min，倒掉Tube管中液體，濾紙吸凈殘余液體，加入1.0ml～1.5ml 4％多聚甲醛于Tube管中并輕輕吹打重懸細(xì)胞(隨后每一步驟的無特殊說明時，均在1.0ml～1.5ml Tube管中進(jìn)行，試劑為1.0ml～1.5ml)，使其分散為單個細(xì)胞懸液，4℃放置固定過夜。(3)細(xì)胞脫水依次按以下6個步驟梯級脫水，每次脫水后，離心5000轉(zhuǎn)/分，5min/次，棄去前一步的脫水劑，70％(酒精中含有0.5％伊紅指示劑)酒精脫水40min，80％酒精脫水40min，90％酒精脫水45min，95％酒精脫45min，100％酒精脫水60min共2次。(4)細(xì)胞透明脫水后離心5000轉(zhuǎn)/分，5min/次，濾紙吸盡殘余酒精，松節(jié)油(二甲苯具有毒性，用松節(jié)油代替二甲苯，)使細(xì)胞透明二次，每次60min。(5)浸蠟離心5000轉(zhuǎn)/分，5min/次，吸去上層0.8ml松節(jié)油，反復(fù)吹打細(xì)胞形成松節(jié)油細(xì)胞懸液，然后把細(xì)胞懸液從Tube管移入底部直徑為1.0mm的透明條形塑料模具(1)中，模具底部塞有少量棉花(2)阻擋細(xì)胞并有利于松節(jié)油經(jīng)模具底部流出，在重力作用下，細(xì)胞均勻沉積在條形模具中。依次將裝有細(xì)胞的條形模具直立浸入3個裝有低溶點石蠟溶液燒杯中(溶點為58℃)，每一燒杯中放置有模具架的，浸蠟時間分別為30min，45min，60min，共三次。浸蠟后的條形模具中細(xì)胞石蠟混合物編號保存于常溫或4℃冰箱中備用。(6)細(xì)胞芯片受體石蠟塊和受體孔的制作按所需制作細(xì)胞芯片的密度，制作相應(yīng)規(guī)格大小的受體石蠟塊。間距為2mm的點陣列模具紙貼于石蠟塊上，依次用直徑1.0mm真空穿刺針在網(wǎng)格紙中穿出直徑為1.0mm，深度為4～10mm的受體孔。(7)受體細(xì)胞芯片石蠟塊的制作裝有細(xì)胞石蠟混合物的條形模具放置于37℃溫箱內(nèi)，30min，目的使細(xì)胞石蠟混合物軟化。截去條形模具的下端，止血鉗夾住條形模具的上端逐步往下移動，從切端擠出直徑為1.0mm左右的條形細(xì)胞石蠟混合物(圖2)。將條形細(xì)胞石蠟混合物截斷成4-10mm/段，放入相應(yīng)石蠟塊受體孔中。待全部受體孔中填滿細(xì)胞石蠟條形混合物后，受體石蠟塊37℃烤箱中30min，玻璃切片平壓受體蠟塊表面，使所有細(xì)胞芯條在同一平面。(8)細(xì)胞芯片切片的制作在輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)上先進(jìn)行粗切修片，HE染色鏡下觀察證實全部切出所有受體細(xì)胞點陣(圖4、5)后，利用石蠟?zāi)z帶轉(zhuǎn)移系統(tǒng)切片，5μm厚切片粘貼于載玻片上，紫外燈下交聯(lián)1min，切片浸于膠帶溶解液中30sec，剝離膠帶，常規(guī)脫蠟水化，進(jìn)行各種研究，如需長期保存則快速浸入溶化石蠟中，使切片表面重新履蓋薄層石蠟，-20℃貯存。(9)細(xì)胞芯片的質(zhì)量檢測和實際應(yīng)用的評估隨機(jī)抽取一張切片進(jìn)行HE染色，圖像分析系統(tǒng)在低倍鏡下采集每個完整細(xì)胞點陣的圖像，體視學(xué)分析模塊下對每一個細(xì)胞株的點陣圖像進(jìn)行分析計數(shù)。原位雜交和免疫組化檢測LRRC4mRNA和P53蛋白在細(xì)胞芯片中表達(dá)。
本發(fā)明方法制作的細(xì)胞芯片為基因功能研究提供了另一種新的高通量工具，具有多個方面的用途。細(xì)胞芯片與組織芯片一樣，可用于基因原位表達(dá)的研究如原位雜交、原位PCR、免疫組化、免疫熒光等。此外，細(xì)胞芯片還具有組織芯片不可替代的如下用途。(1)可作為蛋白質(zhì)微陣列的替代方法來證實藥物的作用靶；(2)作為一種克隆表達(dá)系統(tǒng)用于發(fā)現(xiàn)改變細(xì)胞生理功能的基因產(chǎn)物。(3)用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞的基因構(gòu)型改變的研究。(4)轉(zhuǎn)染目的基因細(xì)胞克隆的篩選。(5)用于高通量地研究藥物不同劑量和不同藥物作用下細(xì)胞中相關(guān)基因或蛋白表達(dá)的差異，試驗藥物的敏感性，有利于發(fā)現(xiàn)新藥物。(6)石蠟細(xì)胞混合物具有組織石蠟塊一樣能長期保存優(yōu)點，為長期保存各種細(xì)胞提供一種經(jīng)濟(jì)簡單的方法。
具體實施例方式實施例含20種細(xì)胞系的細(xì)胞芯片制備1.1細(xì)胞處理(1)細(xì)胞系的種類與細(xì)胞培養(yǎng)引進(jìn)并保存的細(xì)胞系包括以下15種。COS7非洲綠猴腎細(xì)胞系；3T3鼠成纖維細(xì)胞系；CNE-1和HNE1中國人鼻咽癌細(xì)胞系；Hella人宮頸癌細(xì)胞系；U251人星形膠質(zhì)瘤細(xì)胞系；C6大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞系；HT29和SW480人結(jié)腸癌細(xì)胞系；Soas-2和MG-63人成骨肉瘤細(xì)胞系；K562慢性骨髓性白血病細(xì)胞系；B16鼠惡性黑色素瘤細(xì)胞系；293人腎細(xì)胞系；BHK-21鼠腎細(xì)胞系。建立并鑒定穩(wěn)定轉(zhuǎn)染目的基因細(xì)胞系有3種細(xì)胞系，共5個克隆。CNE-1-BRD7，CNE-1-LMP1轉(zhuǎn)染BRD7基因、LMP1基因的人鼻咽癌細(xì)胞系；HT29-NGX6-2和HT29-NGX6-10轉(zhuǎn)染NGX6基因的人結(jié)腸癌細(xì)胞系克隆2和克隆5；U251-LRRC4轉(zhuǎn)染LRRC4基因的人星形膠質(zhì)瘤細(xì)胞系。按常規(guī)方法復(fù)蘇上述細(xì)胞系并傳代，每種細(xì)胞用100cm2培養(yǎng)瓶培養(yǎng)5瓶。
(2)收集、固定細(xì)胞待細(xì)胞形態(tài)良好，細(xì)胞長至90％密度時，收集細(xì)胞進(jìn)行如下處理D-Hanker’s液洗滌細(xì)胞4次，充分洗凈殘余培養(yǎng)基，培養(yǎng)瓶中加入1ml D-Hanker’s液，塑料細(xì)胞刮子輕輕刮下細(xì)胞，并移入1.5ml Tube管中，離心2500轉(zhuǎn)/分，共5min，倒掉Tube管中D-Hanker’s液，濾紙吸凈殘余液體，加1.5ml 4％多聚甲醛于Tube管中，1.0ml吸頭輕輕吹打細(xì)胞使其成為均勻細(xì)胞懸液(隨后每一步驟無特殊說明時，均在1.5mlTube管中進(jìn)行，試劑為1.5ml)，4℃放置固定過夜。
(3)細(xì)胞脫水依次按以下6個步驟梯級脫水，每次脫水后，離心5000轉(zhuǎn)/分，5min/次，棄去前一步脫水劑，70％(此步驟酒精中含有0.5％伊紅使細(xì)胞染成紅色便于操作觀察細(xì)胞)酒精40min，80％酒精40min，90％酒精45min，95％酒精45min，100％酒精60min共2次。
(4)細(xì)胞透明脫水后離心5000轉(zhuǎn)/分，5min/次，濾紙吸盡殘余酒精，松節(jié)油使細(xì)胞透明二次，每次60min。
(5)浸蠟離心5000轉(zhuǎn)/分，5min/次，吸去上層1.0ml松節(jié)油，200μl吸頭反復(fù)吹打細(xì)胞形成細(xì)胞松節(jié)油懸液后，細(xì)胞懸液從Tube管移入底部直徑為1.0mm的透明條形塑料模具中，模具底部塞有少量棉花阻擋細(xì)胞并有利于松節(jié)油經(jīng)模具底部流出，在重力作用下，細(xì)胞均勻沉積在條形模具中。依次將裝有細(xì)胞的條形模具插入模具架上，模具架依次直立浸入3個裝有低溶點石蠟溶液燒杯中(來卡公司，溶點為58℃)，分別浸蠟30min，45min，60min。浸蠟后細(xì)胞石蠟混合物的條形模具編號保存于4℃冰箱中備用。
1.2細(xì)胞微陣列受體石蠟塊和切片的制作(1)來卡公司的58℃石蠟與蜂蠟按9∶1混合制成2×2×2cm的受體石蠟塊，制作間距為2mm的網(wǎng)格紙貼于石蠟塊上，依次用直徑1.0mm真空的穿刺針在網(wǎng)格紙中穿出直徑為1.0mm，深度為10mm的受體孔。
(2)細(xì)胞石蠟混合物的條形模具置于37℃溫箱加熱30min，軟化細(xì)胞石蠟混合物。手術(shù)刀截去條形模具的下端，止血鉗夾住條形模具的上端逐步往下移動，從切端擠出直徑為1.0mm條形細(xì)胞石蠟混合物。手術(shù)刀將條形細(xì)胞石蠟混合物截斷為每段長10mm，放入相應(yīng)石蠟塊受體孔中，用載玻片輕壓細(xì)胞芯條，使其進(jìn)入受體蠟塊受體孔中。每一細(xì)胞系制作5個受體細(xì)胞芯條，待全部受體孔中填滿石蠟細(xì)胞混合物后，受體石蠟塊水平放置于37℃溫箱內(nèi)中30min，然后用載玻片輕壓受體蠟塊表面，使所有細(xì)胞芯條在同一平面。如果石蠟細(xì)胞芯條暫不用于制作細(xì)胞微陣列，亦可放置于Tube管中，編號4℃長期保存。
(3)細(xì)胞微陣列切片的制作受體石蠟塊首先在輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)上進(jìn)行粗切，HE染色鏡下觀察證實所有受體細(xì)胞點陣都完整切出后(圖4、5)，利用石蠟?zāi)z帶轉(zhuǎn)移輔助系統(tǒng)進(jìn)行受體石蠟塊切片，每次切片時，帶有標(biāo)記的膠帶貼于石蠟塊表面，5μm厚細(xì)胞膠帶切片粘貼于特殊粘附基質(zhì)的載玻片上，紫外燈下交聯(lián)90sec，玻片浸于膠帶溶解液中30sec，溶解并輕輕剝離膠帶，然后切片快速浸入溶化石蠟中，使切片表面重新履蓋薄層石蠟，便于長期保存，處理完畢的切片可在-20℃長期貯存?zhèn)溆?。如果切片立即使用，在膠帶剝離后，即可常規(guī)脫蠟水化，進(jìn)行各種研究。每20張切片后，需重新進(jìn)行HE染色，鏡下觀察，如果發(fā)現(xiàn)有細(xì)胞點陣缺失時，需中止切片。
1.3細(xì)胞芯片的質(zhì)量檢測和實際應(yīng)用(1)質(zhì)量檢測隨機(jī)抽取一張切片進(jìn)行HE染色，圖像分析系統(tǒng)在低倍鏡下采集每個完整細(xì)胞點陣的圖像，體視學(xué)分析模塊下對所有細(xì)胞系的點陣圖像進(jìn)行分析計數(shù)。
(2)細(xì)胞微陣列在免疫組化中的應(yīng)用DAKO公司EnVision兩步法免疫組化檢測試劑盒檢測P53和P16在此細(xì)胞微陣列中的表達(dá)。按常規(guī)組織切片的免疫組化操作程序進(jìn)行。切片脫蠟至水，3％的H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶30min，切片置于枸椽酸鈉緩沖液(PH 6.4)中，微波爐中進(jìn)行抗原修復(fù)20min；分別滴加鼠抗人單克隆抗體P53，P21，PTEN和P16(Santa Cruz公司)于切片上，4℃溫盒中過夜，PBS洗3×5min，二抗室溫孵育45分鐘，PBS洗3×5min，DAB顯色，鏡下控制顯色反應(yīng)；蘇木素復(fù)染，膠帶轉(zhuǎn)移系統(tǒng)專用封片劑封片。
(3)細(xì)胞微陣列在原位雜交中的應(yīng)用檢測BRD7(GenbankAF179285)，NGX6(GenbankAF188239)基因在細(xì)胞微陣列中的表達(dá)；BRD7和NGX6基因閱讀框內(nèi)設(shè)計引物，PCR分別擴(kuò)增350bp，400bp目的片段，膠回收，生物素隨機(jī)引物標(biāo)識試劑盒(KPL公司)進(jìn)行探針標(biāo)識。原位雜交檢測試劑盒(PE公司，有TSA信號放大系統(tǒng))對雜交信號進(jìn)行檢測。切片脫蠟，入梯級酒精，DEPC水洗，3％雙氧水滅活內(nèi)源性的過氧化物酶。蛋白酶K進(jìn)行細(xì)胞通透性處理暴露細(xì)胞中的mRNA，37℃15-20分鐘。預(yù)雜交，每一切片預(yù)雜交液100μl/片，封口膜覆蓋，42℃預(yù)雜交3小時。不洗，含探針的雜交液95℃變性10min，訊速冰上冷卻，滴加雜交液100μl/片，封口膜覆蓋，42-45雜交15小時。雜交后2×SSC，0.5×SSC，0.2×SSC洗滌15分鐘/次。TNB緩沖液阻斷非特異性染色。滴加SA-HRP(鏈霉卵白素-辣根過氧化物酶)，室溫30分鐘。TNT緩沖液洗，5分鐘/次，加信號放大試劑(Biotinyl Tyamid)，室溫10分鐘。TNT緩沖液洗，5分鐘/次，滴加SA-HRP(鏈霉卵白素-辣根過氧化物酶)，室溫30分鐘。TNT緩沖液洗5分鐘/次，DAB顯色，鏡下控制顯色反應(yīng)；蘇木素復(fù)染，膠帶轉(zhuǎn)移系統(tǒng)專用封片劑封片2、結(jié)果(1)成功地制作100個點陣的細(xì)胞微陣列，每種細(xì)胞包含5個點陣，所有細(xì)胞系點陣的HE染色，鏡下觀察細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，形態(tài)整齊；對所有細(xì)胞系點陣圖像進(jìn)行計數(shù)分析，細(xì)胞數(shù)為1150～1324個/細(xì)胞點。使用細(xì)胞微陣列進(jìn)行原位雜交和免疫組化檢測，結(jié)果表明細(xì)胞微陣列無完全掉片現(xiàn)象，且檢測結(jié)果與細(xì)胞涂片一致(圖6-10)。
權(quán)利要求
1.一種細(xì)胞芯片制作方法，包括細(xì)胞培養(yǎng)、收集固定細(xì)胞、細(xì)胞脫水、細(xì)胞透明，浸蠟、細(xì)胞芯片受體石蠟塊和受體孔的制作、受體細(xì)胞芯片石蠟塊的制作及細(xì)胞芯片切片的制作，其特征在于(1)浸蠟是將細(xì)胞懸液從Tube管移入透明條形模具(1)中，將在條形模具中均勻沉積的細(xì)胞與模具直立浸入溶點為58℃的低溶點石蠟溶液中浸蠟三次，(2)受體石蠟塊和受體孔的制作制作間距為2mm的點陣列模具紙貼于按細(xì)胞芯片的密度制作的相應(yīng)規(guī)格大小的受體石蠟塊上，依次用真空穿刺針在網(wǎng)格紙中穿出受體孔，(3)受體細(xì)胞芯片石蠟塊的制作經(jīng)置于37℃溫箱內(nèi)軟化的細(xì)胞石蠟混合物截去條形模具的下端，從切端擠出條形細(xì)胞石蠟混合物，并截斷成段，放入相應(yīng)石蠟塊受體孔中。
2.一種如權(quán)利要求1所述的細(xì)胞芯片制作方法專用的器具，其特征在于浸蠟用一種透明條形模具(1)，該模具底部直徑為1.0mm，底部塞有阻擋細(xì)胞并有利于松節(jié)油經(jīng)模具底部流出的少量棉花(2)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種細(xì)胞芯片。細(xì)胞芯片的制作方法為細(xì)胞固定、脫水、透明后，將經(jīng)透明處理后的細(xì)胞置于一定規(guī)格的條形模具中浸蠟制成條狀石蠟細(xì)胞芯條，然后直接將一定長度的條狀石蠟細(xì)胞芯條按序放置于受體石蠟塊中，利用膠帶轉(zhuǎn)移輔助系統(tǒng)進(jìn)行切片，制成不同密度的細(xì)胞芯片。細(xì)胞芯片為基因功能研究提供一種高通量工具，除有組織芯片的用途外，還有組織芯片不可替代的用途。如作蛋白質(zhì)芯片的替代方法用于證實藥物作用的靶；作為一種克隆表達(dá)系統(tǒng)用于發(fā)現(xiàn)改變細(xì)胞生理功能的基因產(chǎn)物；用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞的基因構(gòu)型改變的研究；用于高通量地研究藥物不同劑量和不同藥物作用下細(xì)胞中相關(guān)基因或蛋白表達(dá)的差異，試驗藥物的敏感性，利于發(fā)現(xiàn)新藥物。用于轉(zhuǎn)染目的基因克隆的篩選；為長期保存各種細(xì)胞提供一種經(jīng)濟(jì)簡單的方法。
文檔編號G01N33/50GK1556407SQ200410022819
公開日2004年12月22日 申請日期2004年1月8日 優(yōu)先權(quán)日2004年1月8日
發(fā)明者李桂源, 范松青, 周潔, 肖炳燚, 熊煒, 曹利, 歐陽玨, 李偉芳, 唐珂 申請人:中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院腫瘤研究所