專利名稱：原核細(xì)菌光誘導(dǎo)基因表達(dá)系統(tǒng)及其調(diào)控基因表達(dá)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)中的遺傳工程或合成生物學(xué)領(lǐng)域，具體地涉及基因表達(dá)調(diào)控領(lǐng)域更具體地涉及原核細(xì)菌細(xì)胞中基于光敏蛋白的光誘導(dǎo)基因表達(dá)系統(tǒng)，及采用該表達(dá)系統(tǒng)調(diào)控原核細(xì)菌細(xì)胞中基因表達(dá)的方法。
背景技術(shù)：
在遺傳工程領(lǐng)域，準(zhǔn)確控制基因的表達(dá)對于研究基因的功能以及生命體的生命活動均具有非常重要的意義。相對于真核細(xì)胞復(fù)雜的基因表達(dá)系統(tǒng)，原核細(xì)菌的基因表達(dá)系統(tǒng)則簡單很多。以原核細(xì)菌中被使用最廣泛的大腸桿菌為例，基因表達(dá)的第一步是由RNA聚合酶完成的DNA轉(zhuǎn)錄為RNA。大腸桿菌的RNA聚合酶有五個亞基組成，其分子量為約為480Kd,含有α , β , β ’，σ等4種不同的多肽,其中α為兩個分子,所以全酶(holoenzyme)的組成是％^3 0’ σ。α亞基與RNA聚合酶的四聚體核心(α2β β ’)的形成有關(guān)；β亞基含有核苷三磷酸的結(jié)合位點；β ’亞基含有與DNA模板的結(jié)合位點；而σ因子只與RNA轉(zhuǎn)錄的起始有關(guān)，與鏈的延伸沒有關(guān)系。一旦轉(zhuǎn)錄開始，σ因子就被釋放，鏈的延伸則由四聚體核心酶(core enzyme)催化。所以，σ因子的作用就是識別轉(zhuǎn)錄的起始信號,并使RNA聚合酶結(jié)合在啟動子部位。DNA分子上的起始信號，即“啟動序列”稱為啟動子。大腸桿菌的啟動子序列主要由-10區(qū)和-35 區(qū)組成，-10區(qū)位于轉(zhuǎn)錄起點上游大約IObp處，含6個堿基的TATATA保守序列，它是RNA聚合酶的緊密結(jié)合位點；位于轉(zhuǎn)錄起點上游大約35bp處還有6個堿基的TTGACA保守序列，-35區(qū)提供了 RNA聚合酶全酶識別的信號；大腸桿菌啟動子的強(qiáng)弱主要取決于-10區(qū)和-35區(qū)的剪輯堿基組成以及彼此的間隔長度。雖然單獨的核心酶能與DNA結(jié)合，但主要是由于堿性蛋白質(zhì)與酸性核酸之間的非特異性靜電引力造成的，DNA仍保持雙螺旋形式，而σ亞基能改變RNA聚合酶與DNA之間的親和力，大大地增加酶與啟動子的結(jié)合常數(shù)和停留時間。因此開始時核心酶在σ亞基參與下與DNA分子接觸，形成非專一性復(fù)合物，這樣的復(fù)合物是很不穩(wěn)定的，酶分子可在DNA鏈上滑動。在σ亞基作用下幫助全酶迅速找到啟動子，并與之結(jié)合生成較松弛的封閉型啟動子復(fù)合物。這時酶與DNA外部結(jié)合，識別部位大約在啟動子的-35位點處。接著是DNA構(gòu)象改變活化，得到開放型的啟動子復(fù)合物，此時酶與啟動子緊密結(jié)合，在-10位點處解開DNA雙鏈，識別其中的模板鏈。由于該部位富含A-T堿基對，故有利于DNA解鏈。開放型復(fù)合物一旦形成，DNA就繼續(xù)解鏈，酶移動到起始位點。使用比較廣泛的另一原核細(xì)菌是芽孢桿菌，它是一種革蘭氏陽性細(xì)菌。與大腸桿菌不同的是，芽孢桿菌含有多種RNA聚合酶和σ因子，它們分別識別不同的啟動子序列。原核細(xì)菌的基因表達(dá)系統(tǒng)主要分為兩種，一種是組成型表達(dá)，即在不需要誘導(dǎo)的條件下，使目的蛋白自主連續(xù)性的表達(dá)。另一種是誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)，在誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)中，根據(jù)誘導(dǎo)物的不同又可分成化學(xué)小分子誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)和物理方法誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)兩種。化學(xué)小分子誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)中，IPTG是最常用的一種誘導(dǎo)劑。IPTG作為乳糖的類似物，是一種極強(qiáng)的誘導(dǎo)劑，它不被細(xì)菌代謝且十分穩(wěn)定。目前最常用的一些表達(dá)載體中，多數(shù)含Τ7啟動子、Lac啟動子、Tac啟動子、grac啟動子的，其誘導(dǎo)劑均是IPTG。阿拉伯糖和色氨酸誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)現(xiàn)在也越來越被更多的采用，小分子阿拉伯糖和色氨酸具有對細(xì)胞沒有毒性且能達(dá)到緊密調(diào)控等優(yōu)點。Mn2+、Fe2+、Cu+等金屬離子感受蛋白的發(fā)現(xiàn)使得人們的視線也漸漸投入到金屬離子結(jié)合相應(yīng)的感受蛋白來誘導(dǎo)蛋白表達(dá)的方向。物理方法誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)中常用的是利用溫度變化來誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，例如大腸桿菌中的LacI的溫度敏感突變體，在30°C時具有抑制啟動子的活性，在42°C時失活從而失去抑制啟動子的活性。紫外線(UV)調(diào)控的“囚籠(caged)”技術(shù)是另一種常用的物理誘導(dǎo)表達(dá)方法[Keyes, W.M.等，TrendsBiotechnol, 2003. 21 (2) : 53-55. ] [I]。以上所述原核細(xì)菌誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)雖已獲得較廣泛應(yīng)用，但是仍存在一些缺點(I)誘導(dǎo)劑本身對細(xì)胞有較大的毒性、且價格偏貴(如IPTG)，在制備醫(yī)療目的的重組蛋白時并不合適；(2)金屬離子誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)中，金屬離子感受蛋白識別金屬離子的特異性不強(qiáng)，同一家族或同一周期的不同金屬離子可被同一感受蛋白結(jié)合而激活轉(zhuǎn)錄，因此原核細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)部壞境中存在的多種金屬離子會對轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生一定的干擾，而且原核細(xì)菌細(xì)胞本身的氧化環(huán)境會對低價金屬離子產(chǎn)生氧化作用，從而干擾對氧化環(huán)境要求較高的金屬離子的激活轉(zhuǎn)錄；(3)溫度誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)中，外界溫度的升高會導(dǎo)致大腸桿菌的熱休克蛋白激活，一些蛋白酶會影響產(chǎn)物的穩(wěn)定，很多目的蛋白質(zhì)在高溫下也難以正確折疊，因而UV誘導(dǎo)的囚籠技術(shù)可能造成對細(xì)胞的不可逆性損傷；(4)最重要的是，化學(xué)誘導(dǎo)物只能在時間上調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，不能在空間上特異性調(diào)控某些細(xì)胞及組織的基因表達(dá)。然而，光是一種易于時間和空間操作的誘導(dǎo)物，一般對細(xì)胞無上述毒性，且易獲取。近些年來，人們也發(fā)現(xiàn)了一些生物體內(nèi)調(diào)節(jié)生物鐘系統(tǒng)中存在光可調(diào)節(jié)蛋白(也稱為光敏蛋白)，光照對其功能存在重要的 影響。我們設(shè)想通過分子設(shè)計的方法，改造天然存在轉(zhuǎn)錄因子去合成具有光反應(yīng)性的人工轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)而在原核細(xì)菌細(xì)胞中構(gòu)建光調(diào)控基因表達(dá)系統(tǒng)。目前在原核細(xì)菌中這方面的報道很少，共涉及兩個系統(tǒng)。Anselm Levskaya等在2005年報道了一個基于光敏色素Cphl和大腸桿菌自身EnvZ/OmpR雙組分信號通路的光調(diào)控蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)[Levskaya, A.等，Nature, 2005. 438 (7067) :ρ· 441-2. ] [2]。在黑暗條件下，光敏轉(zhuǎn)錄因子發(fā)生自磷酸化后結(jié)合到OmpR依賴的ompC啟動子上，從而啟動目的基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)。在紅光的照射下，光敏轉(zhuǎn)錄因子的自磷酸化作用被抑制，不能結(jié)合到ompC啟動子，因而不能激活目的基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)。隨后的幾年里，同一研究小組對這種光誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行了一些改變，得到可用多種顏色的光共同調(diào)節(jié)目的蛋白的表達(dá)[Tabor，J. J.等，JMol Biol, 2011. 405(2) :ρ· 315-24,Tabor, J. J.等，Cell, 2009. 137(7) :ρ· 1272-81. ] [3，4]。Keith Moffat課題組開發(fā)了另一個新的重組光敏轉(zhuǎn)錄因子YF1，它是基于來自枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的YtvA藍(lán)光光敏蛋白和來自慢生根瘤菌(Bradyrhizobiumjaponicum)的 FixL 蛋白[Moglich，A.等，J Mol Biol, 2009. 385(5) :p. 1433-44,Ohlendorf, R.等，J Mol Biol，2012. 416，534-542. ] [5，6]?；?YFl 的光誘導(dǎo)基因表達(dá)系統(tǒng)在藍(lán)光存在的情況下目的蛋白的表達(dá)受到抑制，沒有藍(lán)光存在時目的基因則高水平表達(dá)。然而，這兩種原核基因表達(dá)系統(tǒng)都有較大的局限性。前者的系統(tǒng)非常復(fù)雜，它除了需要光敏轉(zhuǎn)錄因子和報告系統(tǒng)外，還需要引入hoi和pcyA兩個基因才能將血紅素(haem)轉(zhuǎn)化成系統(tǒng)正常工作所必需的藻藍(lán)素(phycocyanobilin)，大大增加了構(gòu)建系統(tǒng)時的工作量。后者的系統(tǒng)在藍(lán)光照射下依舊有較多的泄漏表達(dá)，誘導(dǎo)倍數(shù)僅有幾十倍，這樣就不能對目的基因的表達(dá)量進(jìn)行非常精確的調(diào)控。以上所述缺點限制了這兩個光誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)在原核細(xì)菌中的使用。到目前為止，除了上述系統(tǒng)使用的Cphl和YtvA光敏蛋白外，已知的其它光敏蛋白還有以黃素類物質(zhì)為生色團(tuán)的光敏蛋白(亦稱為黃素蛋白家族藍(lán)光受體)，分為三類一是含光-氧-電壓(light-oxygen-voltage, LOV)結(jié)構(gòu)域的光受體蛋白，如光敏色素；二是類似光裂解酶的隱花色素(photolyase-like cryptochromes);第三類是近些年來才發(fā)現(xiàn)的利用 FAD 的藍(lán)光蛋白(blue light using FAD, BLUF) 光敏色素是含LOV結(jié)構(gòu)域的光受體蛋白質(zhì)最多的一類，研究較多的有photl、WC-1> WC-2> PYP (光敏黃色蛋白，photoactive yellow protein)、Phy3、VIVID 等。光敏色素通常是膜偶聯(lián)激酶蛋白，在藍(lán)光照射下發(fā)生自磷酸化改變激酶活性而調(diào)控相關(guān)的生理過程。大多數(shù)光敏色素的C端為絲氨酸/蘇氨酸激酶結(jié)構(gòu)域N端為結(jié)合黃素分子的兩個LOV結(jié)構(gòu)域，藍(lán)光照射時LOV結(jié)構(gòu)域與黃素分子共價結(jié)合生成黃色-半胱酰胺加成產(chǎn)物引起黃素結(jié)合口袋空間構(gòu)象變化，導(dǎo)致C端激酶結(jié)構(gòu)域改變其激酶活性，但此過程完全可逆。迄今，在真核生物細(xì)胞中已建立的最成功的光誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)正是基于VIVID光敏蛋白。Yang課題組[Wang, X.等，Nat Methods, 2012. p. 266-269. ] [7]利用粗糙鏈孢霉菌的VIVID藍(lán)光光敏蛋白經(jīng)藍(lán)光照射后會形成同源二聚體的原理構(gòu)建了一個真核光調(diào)控基因表達(dá)系統(tǒng)。在這個系統(tǒng)中，光敏轉(zhuǎn)錄因子由三個或者四個多肽組成，藍(lán)光照射后重組光敏轉(zhuǎn)錄因子的二聚化能力發(fā)生變化，二聚化的轉(zhuǎn)錄因子可結(jié)合于靶轉(zhuǎn)錄單元核苷酸序列中的反應(yīng)元件，并通過該融合蛋白的第三多肽的轉(zhuǎn)錄激活/阻遏結(jié)構(gòu)域和募集的宿主細(xì)胞本身的其它轉(zhuǎn)錄輔因子，一起協(xié)同作用于該靶轉(zhuǎn)錄單元中的啟動子，從而調(diào)節(jié)(啟動或阻遏)目的基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。該系統(tǒng)組分簡單且具有誘導(dǎo)迅速、誘導(dǎo)倍數(shù)高、可逆性好、時間和空間特異性高等優(yōu)點而被認(rèn)為是迄今最優(yōu)秀的真核生物細(xì)胞基因表達(dá)系統(tǒng)。但遺憾的是，由于原核細(xì)菌和真核生物細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄翻譯機(jī)理的不同，因此該系統(tǒng)不能應(yīng)用于原核細(xì)菌中。此外,MasayukiYazawa等[Yazawa, Μ.等,Nat Biotechnol, 2009. 27 (10) :ρ· 941-5. ] [8]利用擬南芥的 FKFl(flavin-binding, kelch repeat, fboxl)與 GI (GIGANTEA)蛋白二者經(jīng)藍(lán)光激發(fā)后可發(fā)生相互作用的原理也構(gòu)建了一個真核光調(diào)控基因表達(dá)系統(tǒng)，但其低誘導(dǎo)倍數(shù)和稍顯復(fù)雜的系統(tǒng)組分大大限制了它的應(yīng)用。

來自擬南芥(Arabidopsis thaliana)的隱花色素是第一個被分離得到的植物藍(lán)光光敏蛋白，研究比較多的有隱花色素I (CryptochromesI, CRYI)、隱花色素2(Cryptochromes2, CRY2)、光敏色素 A (phytochrome A, phyA)和光敏色素 B (phytochromeB, phyB)等，主要功能是接受:晝夜節(jié)律光調(diào)節(jié)聞等植物的生長和運動。隱花色素的氣基酸序列和生色團(tuán)組成與光裂解蛋白很相似，多數(shù)隱花色素的大小為70kD-80kD，包含相對保守的N端PHR (光裂酶相關(guān))結(jié)構(gòu)域和長度差異較大的C端未知結(jié)構(gòu)域，其PHR結(jié)構(gòu)域可非共價結(jié)合黃素。有研究利用擬南芥CRY2 (隱花色素2)與CIBl (隱花色素2相互作用的螺旋環(huán)螺旋)蛋白二者經(jīng)藍(lán)光激發(fā)后可發(fā)生相互作用，構(gòu)建了一個真核生物細(xì)胞內(nèi)的光誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)[Kennedy, M. J.等，Nat Methods, 2010. 7 (12) :ρ· 973-5. ] [9]。包含BLUF結(jié)構(gòu)域的藍(lán)光受體蛋白和包含LOV結(jié)構(gòu)域的光受體蛋白與隱花色素不同的是，前者光照激活后不會與黃素生色團(tuán)反應(yīng)生成共價產(chǎn)物，而是導(dǎo)致生色團(tuán)構(gòu)象變化引起黃色吸收光發(fā)生IOnm紅移。包含BLUF結(jié)構(gòu)域的光受體蛋白研究最多的是ΑρρΑ，它是球狀紅桿菌(Rhodobacter sphaeroides)的一種轉(zhuǎn)錄抗阻遏蛋白，黑暗時AppA與細(xì)胞中的一種PpsR轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合形成AppA-PpsR2復(fù)合物，使PpsR不能結(jié)合DNA ;強(qiáng)藍(lán)光照射可使AppA從復(fù)復(fù)合物上解離而釋放PpsR形成四聚體結(jié)合于特定DNA序列導(dǎo)致抑制相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄[Pandey, R.等，F(xiàn)EBS J, 2012. ] [10]。Haifeng Ye 等人[Ye, H.等，Science, 2011. 332 (6037) :ρ· 1565-8. ] [11]利用黑視素(melanopsin)及細(xì)胞內(nèi)信號通路構(gòu)建得到一個藍(lán)光激發(fā)的真核生物細(xì)胞光誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)。黑視素是一種在某些視網(wǎng)膜細(xì)胞表面的感光色素。在藍(lán)光存在下，黑視素會觸發(fā)鈣離子快速地涌入細(xì)胞內(nèi)，經(jīng)過細(xì)胞內(nèi)一系列信號級聯(lián)反應(yīng)后，I丐調(diào)蛋白(calmodulin)激活具有絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶活性的鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(calcineurin)，后者將轉(zhuǎn)錄因子NFAT去磷酸化，去磷酸化的NFAT轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)與NFAT特異性的啟動子結(jié)合后啟動目的基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)。該系統(tǒng)最大的缺點是系統(tǒng)復(fù)雜且參與了細(xì)胞內(nèi)的信號通路，因而系統(tǒng)本身穩(wěn)定性差，并且有可能通過影響細(xì)胞的信號通路而影響細(xì)胞的正常生命活動。相對于真核生物細(xì)胞，原核細(xì)菌具有增殖快、培養(yǎng)成本低、能夠高效表達(dá)外源蛋白(甚至可以達(dá)到細(xì)菌總蛋白量的90%以上)等多種優(yōu)點，這些優(yōu)點使得原核細(xì)菌更適合作為大量表達(dá)目的蛋白的宿主細(xì)胞。然而如上所述，目前已有的廣泛用于原核細(xì)菌的基因表達(dá)系統(tǒng)大多數(shù)采用化學(xué)誘導(dǎo)劑調(diào)控，雖然其誘導(dǎo)效果較好，背景低、表達(dá)強(qiáng)度高，但許多系統(tǒng)具有多效性因而副作用廣泛并有潛在的細(xì)胞毒性。更為重要的是，化學(xué)誘導(dǎo)劑不能在空間上精確調(diào)控基因的表達(dá)；而物理方法(如溫度)調(diào)節(jié)基因表達(dá)的系統(tǒng)目前很少，且溫度的升高帶來的副作用很多。少數(shù)幾種基于光敏蛋白的基因表達(dá)系統(tǒng)，由于系統(tǒng)本身的復(fù)雜性或者誘導(dǎo)倍數(shù)低等原因限制了其應(yīng)用。綜上所述，我們認(rèn)為有可能綜合這些系統(tǒng)的優(yōu)點在原核細(xì)菌中創(chuàng)造出一種新的更優(yōu)秀的光誘導(dǎo)基因表達(dá)系統(tǒng)，以克服前人研究的缺陷而廣泛用于生物醫(yī)藥研究中。經(jīng)過潛心研究，發(fā)明了一種新型的原核細(xì)菌光誘導(dǎo)基因表達(dá)系統(tǒng)，它具有良好的基因表達(dá)調(diào)控能力，可以在時間和空間上共同調(diào)控基因的表達(dá)。

因此，本發(fā)明的第一個目的是提供一種新型原核細(xì)菌光誘導(dǎo)基因表達(dá)系統(tǒng)。本發(fā)明的第二個目的是提供用所述光誘導(dǎo)基因表達(dá)系統(tǒng)調(diào)節(jié)原核細(xì)菌細(xì)胞中基因表達(dá)的方法。本發(fā)明的第三個目的是提供含有所述光誘導(dǎo)基因表達(dá)系統(tǒng)的原核細(xì)菌表達(dá)載體。本發(fā)明的第四個目的是提供所述光誘導(dǎo)基因表達(dá)系統(tǒng)在調(diào)節(jié)原核細(xì)菌的生命活動(如細(xì)菌的移動、裂解等)上的用途。本發(fā)明的第五個目的是提供裝有所述原核細(xì)菌光誘導(dǎo)基因表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)載體或基因組上整合了所述表達(dá)系統(tǒng)中光敏轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)框的原核細(xì)菌菌株的試劑盒。發(fā)明概述本發(fā)明涉及提供一種原核細(xì)菌光誘導(dǎo)基因表達(dá)系統(tǒng)，包括a)重組光敏轉(zhuǎn)錄因子編碼基因，所述重組光敏轉(zhuǎn)錄因子包括作為DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的第一多肽和作為光敏結(jié)構(gòu)域的第二多肽山)靶轉(zhuǎn)錄單元，包括被第一多肽識別/結(jié)合的包含至少一個反應(yīng)元件的啟動子或啟動子-反應(yīng)元件或反應(yīng)元件-啟動子和待轉(zhuǎn)錄核酸序列。本發(fā)明的原核細(xì)菌光誘導(dǎo)基因表達(dá)系統(tǒng)中，重組光敏轉(zhuǎn)錄因子是一種重組光敏DNA結(jié)合蛋白，在光照前后這種光敏DNA結(jié)合蛋白與相應(yīng)反應(yīng)元件的結(jié)合能力發(fā)生顯著變化，從而直接抑制或者啟動基因的轉(zhuǎn)錄與翻譯。
重組光敏轉(zhuǎn)錄因子的第一多肽為DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，它能夠特異性地識別反應(yīng)元件，單獨不能夠結(jié)合到反應(yīng)元件上或者是結(jié)合能力很弱，需要第二多肽來輔助其結(jié)合到反應(yīng)元件。第一多肽與第二多肽之間可操作性連接。第一多肽可選自螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、鋅指基序或鋅簇DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、亮氨酸拉鏈DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、翼狀螺旋DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、翼狀螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、螺旋-環(huán)-螺旋DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、高遷移率族DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、B3DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。第二多肽為光敏結(jié)構(gòu)域，通常來自以黃素類為生色團(tuán)的光敏蛋白。第一多肽和第二多肽之間可以直接連接，也可操作性地通過接頭肽連接。接頭肽的氨基酸個數(shù)是可變的(如O - 10個或更多)。第一多肽可進(jìn)一步選自大腸桿菌LexA DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、λ曬菌體cl阻遏蛋白的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、Lac阻遏蛋白LacI的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、酵母Gal4DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、四環(huán)素組合蛋白TetR的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，及其截短體或/和氨基酸序列同源性80%_99%的突變體。第二多肽選自含黃素類生色團(tuán)的光敏蛋白的光敏結(jié)構(gòu)域和含LOV結(jié)構(gòu)域的光敏蛋白的光敏結(jié)構(gòu)域。進(jìn)一步可選自粗糙鏈孢霉菌的VIVID的LOV結(jié)構(gòu)域、燕麥光敏色素I基因的L0V2結(jié)構(gòu)域AsL0V2、無隔藻金色素蛋白I的LOV結(jié)構(gòu)域AuLOV和假單胞菌的LOV結(jié)構(gòu)域PpSBl-LOV及其截短體或氨基酸序列15%-99%相同或氨基酸序列36%_99%相似的突變體。本發(fā)明的原核細(xì)菌光誘導(dǎo)基因表達(dá)系統(tǒng)中，靶轉(zhuǎn)錄單元中的啟動子-待轉(zhuǎn)錄核酸序列之間，或者啟動子-反應(yīng)元件-待轉(zhuǎn)錄核酸序列之間，或者反應(yīng)元件-啟動子與待轉(zhuǎn)錄核酸序列之間均可直接或操作性連接。所述反應(yīng)元件為可被第一多肽特異性識別和結(jié)合的DNA基序。反應(yīng)元件選自LexA結(jié)合元件、Cl結(jié)合元件、LacI結(jié)合元件、Gal4結(jié)合元件和TetR結(jié)合元件。所述啟動子選自大腸桿菌的colE啟動子、sulA啟動子、recA啟動子、umuDC啟動子、Iac最小啟動子、T7噬 菌體的T7啟動子、λ噬菌體的012啟動子，枯草芽孢桿菌的grac啟動子。按照本發(fā)明的原核細(xì)菌光誘導(dǎo)基因表達(dá)系統(tǒng)，重組光敏轉(zhuǎn)錄因子還可進(jìn)一步包含附加的多肽，如可以招募RNA聚合酶其他組分的第三多肽。第三多肽與第一、第二多肽可直接連接或通過接頭肽連接。第三肽可選自大腸桿菌的ω因子、α因子或氨基酸序列36%-99%相似的突變體。本發(fā)明還涉及含有本發(fā)明的光誘導(dǎo)基因表達(dá)系統(tǒng)的原核細(xì)菌表達(dá)載體。所述表達(dá)載體可以是單獨含有重組光敏轉(zhuǎn)錄因子編碼基因的原核細(xì)菌表達(dá)載體，也可以是單獨含有靶轉(zhuǎn)錄單元的原核細(xì)菌表達(dá)載體，所述靶轉(zhuǎn)錄單元中含有啟動子但待轉(zhuǎn)錄核酸序列空缺或啟動子-反應(yīng)元件但待轉(zhuǎn)錄核酸序列空缺或反應(yīng)元件-啟動子但待轉(zhuǎn)錄核酸序列空缺。或者，也可以是同時含有重組光敏轉(zhuǎn)錄因子編碼基因和靶轉(zhuǎn)錄單元的原核細(xì)菌表達(dá)載體。所述表達(dá)載體中的所述重組光敏轉(zhuǎn)錄因子編碼基因選自序列48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106,109ο本發(fā)明還涉及基因組上整合了本發(fā)明的光誘導(dǎo)基因表達(dá)系統(tǒng)中光敏轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)框的原核細(xì)菌菌株。
本發(fā)明也涉及用本發(fā)明的光誘導(dǎo)基因表達(dá)系統(tǒng)在原核細(xì)菌細(xì)胞中調(diào)控基因表達(dá)的方法，包括以下步驟a)將所述原核細(xì)菌光誘導(dǎo)基因表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建在原核細(xì)菌表達(dá)載體中；b)引入含被調(diào)控基因的原核細(xì)菌細(xì)胞；和c)光照誘導(dǎo)所述原核細(xì)菌細(xì)胞，使原核細(xì)菌細(xì)胞中的被調(diào)控的核苷酸進(jìn)行表達(dá)。本發(fā)明的在原核細(xì)菌中調(diào)控基因表達(dá)的方法，涉及光源的選擇和照射方法的選擇。光源非限制地包括LED燈、白熾燈、熒光燈、激光；照射方法包括光照量、光照時間、光照強(qiáng)度及光照頻率的選定。用掃描、投影、光模具等方法在空間上控制目的基因的表達(dá)也包含在本發(fā)明范圍中。本發(fā)明還涉及用本發(fā)明的光誘導(dǎo)基因表達(dá)系統(tǒng)來調(diào)控原核細(xì)菌生命活動的方法，如移動、裂解等。本發(fā)明還涉及一種試劑盒，該試劑盒裝有含本發(fā)明光誘導(dǎo)基因表達(dá)系統(tǒng)的原核細(xì)菌(如大腸桿菌)表達(dá)載體或基因組上整合了本發(fā)明光誘導(dǎo)基因表達(dá)系統(tǒng)中光敏轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)框的原核細(xì)菌菌株，及相應(yīng)的說明書。本發(fā)明試劑盒中的原核細(xì)菌表達(dá)載體所包含的靶轉(zhuǎn)錄單元中待轉(zhuǎn)錄核酸序列可以是空缺的。發(fā)明詳述本發(fā)明提供一種基于光敏多肽的、光誘導(dǎo)的原核細(xì)菌基因表達(dá)系統(tǒng)，用于在時間和空間上調(diào)節(jié)目的基因在原核細(xì)菌細(xì)胞中基因的表達(dá)。本發(fā)明的光誘導(dǎo)基因表達(dá)系統(tǒng)涉及至少兩個部分第一部分是能夠在原核細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)的重組光敏轉(zhuǎn)錄因子融合蛋白的編碼核苷酸序列，該融合蛋白由兩個多肽組成，其中第一多肽是其DNA識別/結(jié)合域，第二多肽為光敏多肽；第二部分是由`含啟動子-待轉(zhuǎn)錄核苷酸序列或者啟動子-反應(yīng)元件-待轉(zhuǎn)錄核苷酸序列或者反應(yīng)元件-啟動子-待轉(zhuǎn)錄核苷酸序列組成的祀轉(zhuǎn)錄單元核苷酸序列，其中反應(yīng)元件是與上述重組光敏轉(zhuǎn)錄因子融合蛋白第一多肽所識別/結(jié)合的DNA核苷酸序列。第一部分的兩個多肽優(yōu)選采用有關(guān)蛋白的截短的功能活性片段(即結(jié)構(gòu)域)。可通過基因工程技術(shù)將本發(fā)明的光誘導(dǎo)基因表達(dá)系統(tǒng)的第一部分和第二部分構(gòu)建在一個原核細(xì)菌表達(dá)載體中或分別構(gòu)建在二個原核細(xì)菌表達(dá)載體中。在具體使用過程中，利用常規(guī)轉(zhuǎn)化的方法將上述的兩個組分轉(zhuǎn)化到原核細(xì)菌細(xì)胞中去，或者將第一部分利用常規(guī)的基因敲除的方法整合到原核細(xì)菌細(xì)胞的基因組上去，使之表達(dá)本發(fā)明的重組光敏轉(zhuǎn)錄因子融合蛋白，用適當(dāng)波長的光照射可導(dǎo)致其第二光敏多肽二聚化能力改變，二聚化的光敏多肽可以結(jié)合到本發(fā)明第二部分靶轉(zhuǎn)錄單元核苷酸序列中的反應(yīng)元件上去，通過阻礙RNA聚合酶與啟動子區(qū)域的結(jié)合來直接抑制下游目的基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，或者通過招募RNA聚合酶的其他組分到啟動子區(qū)域來啟動下游基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)。本發(fā)明提供的這種原核細(xì)菌光誘導(dǎo)基因表達(dá)系統(tǒng)，可利用不會損傷細(xì)胞的光照射，在時間上和空間上調(diào)節(jié)目的蛋白基因在原核細(xì)菌細(xì)胞中的表達(dá)。本發(fā)明的這種原核細(xì)菌光誘導(dǎo)基因表達(dá)系統(tǒng)，可利用不同的光照強(qiáng)度等光照條件的差異來調(diào)節(jié)目的蛋白基因在原核細(xì)菌細(xì)胞中的表達(dá)。本發(fā)明的這種原核細(xì)菌光誘導(dǎo)基因表達(dá)系統(tǒng)，可通過光來誘導(dǎo)一些蛋白的表達(dá)來控制原核細(xì)菌的生命活動，如運動、裂解等。所用的光廉價、易于獲得、對細(xì)胞沒有毒性。本文所用術(shù)語的定義和解釋
“宿主細(xì)胞”在本專利中特指原核細(xì)菌細(xì)胞，可以是原始的未經(jīng)改造的原核細(xì)菌細(xì)胞，也可以是基因組經(jīng)過改造的商業(yè)化原核細(xì)菌菌株，如實驗常用的BL21、JM109 (DE3),DH5a、枯草芽孢桿菌WB800等，也可以是在這些商業(yè)化菌株的基礎(chǔ)上再進(jìn)行基因組改造的得到的原核細(xì)菌菌株，如本發(fā)明中敲除了基因組中sulA基因、LexA基因得到的JM109 (DE3, SulA_，LexA_)大腸桿菌菌株，或者基因組上整合有本發(fā)明重組光敏轉(zhuǎn)錄因子的JM109 (DE3, sulA_，LexA: : Amp-LV-LO)大腸桿菌菌株；也可以是其他和本發(fā)明的光誘導(dǎo)基因表達(dá)系統(tǒng)相容的宿主細(xì)胞均可以?！澳康牡鞍住币部煞Q為“感興趣蛋白”，指任何有用的蛋白，例如可用于預(yù)防或治療目的或其他用途的、需要在大腸桿菌細(xì)胞中表達(dá)的有用生物蛋白質(zhì)，包括天然的或人工修飾或突變的有用蛋白質(zhì)?！皥蟾娴鞍住睘槟康牡鞍椎囊环N，指其表達(dá)容易被檢測的有用蛋白質(zhì)。為便于檢測本發(fā)明基于光敏多肽的、光可誘導(dǎo)的目的蛋白基因表達(dá)系統(tǒng)的效果，可以選擇以下已知的廣泛應(yīng)用的報告蛋白紅色突光蛋白(mCherry), β _半乳糖苷酶(LacZ)等。但本發(fā)明的光可誘導(dǎo)目的蛋白基因表達(dá)系統(tǒng)不限于表達(dá)報告蛋白，而可用于表達(dá)任何有用的目的蛋白。“基因”、蛋白質(zhì)的“編碼核苷酸序列”、“待轉(zhuǎn)錄核苷酸序列”在本文中含義相同可互換使用，指天然或重組的攜帶蛋白質(zhì)氨基酸序列信息密碼子的DNA序列?！澳康牡鞍谆颉薄ⅰ澳康牡鞍椎木幋a核苷酸序列”或簡稱為“目的基因”在本文中含義相同，可互換使用，指編碼目的蛋白的基因，通常為脫氧核糖核酸DNA雙鏈序列。這種基因可包含在宿主細(xì)胞的基因組DNA序列中或包含在人工構(gòu)建的表達(dá)載體中，如本發(fā)明的靶轉(zhuǎn)錄單元序列中。同樣，“報告基因”指編碼報告蛋白的基因?！稗D(zhuǎn)錄”在本文中專指原核細(xì)菌細(xì)胞中通過RNA聚合酶將目的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生攜帶該基因信息的RNA。 “表達(dá)”、“目的蛋白基因表達(dá)”、“基因表達(dá)”在本文中含義相同可互換使用，指目的基因的DNA序列轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生攜帶該基因信息的RNA CmRNA或反義RNA)和該RNA攜帶的信息在核糖體中被翻譯產(chǎn)生目的蛋白二者，即轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生信息RNA和翻譯產(chǎn)生目的蛋白都叫做表達(dá)。本文包括這二種含義，主要指產(chǎn)生目的蛋白。“轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)”本文專門指原核細(xì)菌細(xì)胞中基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)?！稗D(zhuǎn)錄因子”或“轉(zhuǎn)錄因子融合蛋白”在本文中含義相同可互換使用，指原核細(xì)菌的轉(zhuǎn)錄因子，一般情況下是一個蛋白質(zhì)，可以是天然的或人工改造的或人為融合的，包括能識別/結(jié)合靶轉(zhuǎn)錄單元核苷酸序列中的反應(yīng)元件的多肽，通過與靶轉(zhuǎn)錄單元中反應(yīng)元件的結(jié)合和相互作用，本身就能或者募集RNA聚合酶其他組分一起調(diào)節(jié)目的蛋白基因的轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄因子視其組成的不同可分為“轉(zhuǎn)錄激活因子”或“轉(zhuǎn)錄抑制因子”，二者簡稱“轉(zhuǎn)錄因子”?！鞍修D(zhuǎn)錄單元”指人造的由含反應(yīng)元件的啟動子和目的基因組成的DNA序列(不是蛋白質(zhì))，其中反應(yīng)元件位于啟動子序列內(nèi)部或者位于啟動子的-35區(qū)的上游或者位于啟動子-10區(qū)的下游，目的基因位于啟動子下游，彼此可直接相連或操作性(即可隔開若干個核苷酸)相連?！胺磻?yīng)元件”指轉(zhuǎn)錄因子特異性識別/結(jié)合的一個或多個順式DNA基序，不同的轉(zhuǎn)錄因子有與其相對應(yīng)的不同的反應(yīng)元件，轉(zhuǎn)錄因子包含能與這種DNA基序結(jié)合的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。當(dāng)轉(zhuǎn)錄因子與其相對應(yīng)的反應(yīng)元件特異性結(jié)合后，該反應(yīng)元件即向啟動子傳達(dá)反應(yīng)性，轉(zhuǎn)錄因子本身就可以或者通過招募RNA聚合酶的其他組分一起抑制或者激活啟動子活性，阻礙或激活下游目的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生相應(yīng)的RNA。在本發(fā)明中，反應(yīng)元件指能夠與重組光敏轉(zhuǎn)錄因子的第一多肽特異性識別/結(jié)合的DNA基序，例如LexA識別/結(jié)合的反應(yīng)元件為長16bp的DNA基序(序列11)?！皢幼印敝竼雍椭笇?dǎo)其下游目的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生RNA的DNA序列，它是基因表達(dá)不可缺少的重要調(diào)控序列。啟動子可以是天然基因的啟動子或人工修飾的啟動子。原核細(xì)菌的啟動子是由兩段彼此分開且又高度保守的核苷酸序列組成，對mRNA的合成極為重要。在轉(zhuǎn)錄起始點上游5 IObp處，有一段由6 8個堿基組成，富含A和T的區(qū)域，稱為Pribnow盒，又名TATA盒或一 10區(qū)。來源不同的啟動子，Pribnow盒的堿基順序稍有變化。在距轉(zhuǎn)錄起始位點上游35bp處，有一段由IObp組成的區(qū)域，稱為-35區(qū)。轉(zhuǎn)錄時大腸桿菌RNA聚合酶識別并結(jié)合啟動子。-35區(qū)與RNA聚合酶σ亞基結(jié)合，-10區(qū)與RNA聚合酶的核心酶結(jié)合,在轉(zhuǎn)錄起始位點附近DNA被解旋形成單鏈,RNA聚合酶使第一和第二核苷酸形成磷酸二酯鍵，以后在RNA聚合酶作用下向前推進(jìn)，形成新生的RNA鏈?！拜d體”、“表達(dá)載體”、“基因表達(dá)載體”、“重組基因表達(dá)載體”或“質(zhì)?！痹诒疚闹泻x相同可互換使用，指能在原核細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)重組目的蛋白的載體?！稗D(zhuǎn)化”指利用化學(xué)方法或者物理方法使外源質(zhì)粒DNA分子進(jìn)入原核細(xì)菌細(xì)胞中。具體的方法可參見Sambrooka等人(分子克隆實驗手冊，第二版，冷泉港出版社(1989))，和其它有關(guān)教材。本發(fā)明的光誘導(dǎo)原核細(xì)菌基因表達(dá)系統(tǒng)中，第一部分的重組光敏轉(zhuǎn)錄因子是由兩種或三種功能性多肽片段直接通過肽鍵串聯(lián)連接或通過短肽接頭串聯(lián)連接形成的融合蛋白。在適當(dāng)波長的光照射下，該融合蛋白能結(jié)合于本發(fā)明第二部分靶轉(zhuǎn)錄單元核苷酸序列的反應(yīng)元件，并通過其自身或者募集宿主細(xì)胞中RNA聚合酶其他組分，一起協(xié)同作用于啟動子區(qū)域，從而阻遏或啟動靶轉(zhuǎn)錄單元中目的蛋白基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)。本文中，“重組光敏轉(zhuǎn)錄因子融合蛋白”與“重組光敏轉(zhuǎn)錄因子”含義相同，可互換使用。 本發(fā)明的重組光敏轉(zhuǎn)錄因子含有第一多肽，該多肽雖能特異性識別所述靶轉(zhuǎn)錄單元核苷酸序列中的反應(yīng)元件但不能與其結(jié)合或結(jié)合能力弱，只有在第二多肽的協(xié)助下同質(zhì)二聚化后方能結(jié)合反應(yīng)元件；該多肽可衍生自任何已知的蛋白質(zhì)DNA識別/結(jié)合結(jié)構(gòu)域，優(yōu)選氨基酸序列更短的DNA識別/結(jié)合結(jié)構(gòu)域，包括天然的和合成的這種DNA識別/結(jié)合域或其類似物(如保留了甚至增強(qiáng)了結(jié)合能力的結(jié)合域突變體或截短體)?？捎米鞅景l(fā)明的第一多肽選自螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、鋅指基序或鋅簇DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、亮氨酸拉鏈DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、翼狀螺旋DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、翼狀螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、螺旋-環(huán)-螺旋DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、高遷移率族DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、B3DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。第一多肽優(yōu)選包括但不限于=LexA蛋白的DNA識別/結(jié)合域(序列2)、λ噬菌體CI阻遏蛋白cl蛋白的DNA識別/結(jié)合域(序列4)、Lac阻遏蛋白LacI的DNA識別/結(jié)合域(序列6)、酵母Gal4DNA識別/結(jié)合結(jié)構(gòu)域(序列8)、四環(huán)素組合蛋白TetR的DNA識別/結(jié)合域(序列
10)等，及其截短體或/和氨基酸序列同源性80%-99%的突變體。更優(yōu)選LexA的DNA識別/結(jié)合域和Cl的DNA識別/結(jié)合域。LexA蛋白是存在于大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)的一種轉(zhuǎn)錄抑制因子，能調(diào)控細(xì)胞內(nèi)20多種基因的轉(zhuǎn)錄，同源二聚化后的LexA 二聚體能夠識別/結(jié)合啟動子中的反應(yīng)元件16個堿基的CTgT(N)8ACAg回文結(jié)構(gòu)，從而阻止RNA聚合酶對后面基因的轉(zhuǎn)錄。LexA含有202個氨基酸，其中1-87位氨基酸是其DNA識別/結(jié)合結(jié)構(gòu)域，88-202位氨基酸是二聚化結(jié)構(gòu)域，只有同源二聚化的LexA才能特異性結(jié)合相應(yīng)的反應(yīng)元件，LexA單體蛋白則不能。正常情況下大腸桿菌細(xì)胞中的LexA是二聚體形式存在，當(dāng)細(xì)胞受到內(nèi)部或外部SOS信號刺激時，二聚化的LexA被細(xì)胞內(nèi)某些酶(如RecA)切斷分開并從反應(yīng)元件上解離，使得原來被LexA抑制的基因激活，大腸桿菌啟動針對SOS的修復(fù)功能[12，13] [Schnarr, M.等，Biochimie, 1991. 73(4) :ρ· 423-31，Little, J. W.等，Cell, 1982. 29(1) :ρ· 11-22.]?；贚exA的雙雜交系統(tǒng)也被用于研究基因表達(dá)與蛋白質(zhì)相互作用。例如,Clonetech公司生產(chǎn)的酵母雙雜交系統(tǒng)(MATCHMAKER LexA Two-Hybrid System)就是基于此系統(tǒng)。d蛋白是λ噬菌體Cl基因編碼的一種轉(zhuǎn)錄抑制因子，它可以阻止λ左、λ右兩個早期起動子的轉(zhuǎn)錄導(dǎo)致不能產(chǎn)生復(fù)制及細(xì)胞裂解的蛋白。Cl蛋白含有236個氨基酸，其N端為DNA識別/結(jié)合域(1-102位氨基酸)和C端為二聚化域(132-236位氨基酸)。cl蛋白同源二聚體識別/結(jié)合匕和Pk兩個操縱子序列上，每個操縱子各含有Cl三個識別結(jié)合位點，分為PL的0L1、0L2和0L3以及PR的0R1、0R2和0R3。cl與ORl的結(jié)合能力相對強(qiáng)些，ORl的保守DNA序列為TACCTCTGGCGGTGATA，單體Cl蛋白幾乎無這種結(jié)合能力[Burz，D.S.等，Biochemistry33 (28)，8399-8405 (1994)，Hu, J. C.等，Science250 (4986)，1400-1403(1990)][14， 15]。Lac阻遏蛋白LacI能特異性識別/結(jié)合大腸桿菌乳糖操縱子系統(tǒng)，進(jìn)而調(diào)節(jié)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)。LacI蛋白包含N端的DNA識別/結(jié)合域(1_62位氨基酸)、核心蛋白域(63-340位氨基酸)和C端四聚化域(341-357位氨基酸)。其特異性識別/結(jié)合的DNA保守序列為GAATTGTGAGCGCTCACAATT，只有二聚化或者四聚化的LacI才能與之結(jié)合，單體LacI蛋白幾乎不能結(jié)合[Lewis, Μ.等,Science271 (5253), 1247-1254 (1996)，F(xiàn)riedman, A. M.等，Science, 1995. 268 (5218):p. 1721-7. ][16，17]。

Gal4是釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌的轉(zhuǎn)錄激活蛋白(其編碼基因?qū)懗蒅AL4)，能識別/結(jié)合基因啟動子的上游反應(yīng)元件-激活基序UASJ長17bp的一段序列
-CGGRNNRCYNYNYNCNCCG-3; (R表示嘌呤，Y表示嘧啶，N表示脫氧核苷酸)]。它可介導(dǎo)半乳糖誘導(dǎo)的基因，如GAL1，GAL2, GAL7, GALlO和MELl轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。Gal4的N末端為DNA識別/結(jié)合域，C末端為轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(AD)。此DNA識別/結(jié)合域含一個鋅簇(Zinc cluster),即Zn(2)-Cys(6)雙核簇，需形成同質(zhì)二聚體才能結(jié)合反應(yīng)元件發(fā)揮其作用[Kraulis，P.J.等，Nature, 1992. 356 (6368) :ρ· 448-50. ,Marmorstein, R.等，Nature, 1992. 356 (6368):p. 408-14. ] [18，19]?；贕AL4/UAS的雙雜交系統(tǒng)是用于研究基因表達(dá)的一種有效工具。例如，普洛麥格公司(Promega)公司生產(chǎn)的哺乳動物雙雜交系統(tǒng)(CheckMate MammaI ianTwo-Hybrid System)就采用了此 GAL4/UAS 系統(tǒng)。TetR阻遏蛋白是存在于很多革蘭陰性菌中的一種轉(zhuǎn)錄因子，通過結(jié)合特定DNA基序抑制相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。TetR蛋白的N端為DNA識別/結(jié)合域和C端為二聚化域。單體TetR蛋白可形成同質(zhì)二聚體而識別/結(jié)合含有特定DNA序列的操縱子上，單體TetR幾乎無結(jié)合能力[ffissmann, A.等·，EMBO JlO (13), 4145-4152 (1991), Ramos, J. L.等·，MicrobiolMol Biol Rev69(2)，326-356(2005)][20，21]。
在本發(fā)明一優(yōu)選實施方式中，第一多肽為LexA蛋白的1_87位氨基酸，即其DNA識別/結(jié)合域(其核酸和蛋白質(zhì)序列分別為序列I和序列2)，其單獨不能結(jié)合反應(yīng)元件(序列
11)。在另一優(yōu)選實施方式中，第一多肽為Cl蛋白的1-102位氨基酸，即其DNA識別/結(jié)合域的截短體(其核酸和蛋白質(zhì)序列分別為序列3和序列4)，其單獨不能結(jié)合反應(yīng)元件(序列12)。在另一優(yōu)選實施方式中,第一多肽為LacI蛋白的1-62位氨基酸，即其DNA識別/結(jié)合域的截短體(其核酸和蛋白質(zhì)序列分別為序列5和序列6)，其單獨也不能結(jié)合反應(yīng)元件(序列13)。在另一優(yōu)選實施方式中，第一多肽為Gal4蛋白的1-65位氨基酸,即其DNA識別/結(jié)合域的截短體(其核酸和蛋白質(zhì)序列分別為序列7和序列8)，其單獨也不能結(jié)合反應(yīng)元件(序列14)。在另一優(yōu)選實施方式中，第一多肽為TetR蛋白的1-63位氨基酸，即其DNA識別/結(jié)合結(jié)的截短體(其核酸和蛋白質(zhì)序列分別為序列9和序列10)，其單獨也不能結(jié)合反應(yīng)元件(序列15)。本發(fā)明的光誘導(dǎo)基因表達(dá)系統(tǒng)中，重組光敏轉(zhuǎn)錄因子中的第二多肽是光敏多肽，來自以黃素類(FMN或FAD)為生色團(tuán)的光敏結(jié)構(gòu)域。如含有光-氧-電壓(LOV)結(jié)構(gòu)域的光敏蛋白、類似光裂解酶的隱花色素(photolyase-like cryptochromes)、利用FAD的藍(lán)光蛋白(blue light using FAD, BLUF)0優(yōu)選含LOV結(jié)構(gòu)域的光敏蛋白，經(jīng)適當(dāng)波長光照射后，第二多肽的二聚化能力發(fā)生改變，使轉(zhuǎn)錄因子的二聚化能力發(fā)生變化，二聚化的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合于相對應(yīng)的反應(yīng)元件，從而直接調(diào)節(jié)目的基因的表達(dá)水平。本發(fā)明包括但不限于以下幾種優(yōu)選光敏蛋白或其功能活性截短體。一個優(yōu)選的第二多肽是粗糙鏈孢霉菌的VIVID(VVD)蛋白的光敏結(jié)構(gòu)域及其突變體。VVD是存在于粗糙鏈孢霉菌(Neurospora crassa)細(xì)胞內(nèi)參與藍(lán)光調(diào)控細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路的一種光敏蛋白質(zhì)。在藍(lán)光照射下它能與黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD, Flavin AdenineDinucleotide)發(fā)生蛋白分子間反應(yīng)形成二聚體。全長VVD蛋白含有186個氨基酸,只含一個對光敏感的LOV結(jié)構(gòu)域。研究表明VVD蛋白缺失了 N端36個氨基酸的截短體蛋白(VVD36)穩(wěn)定性比全長蛋白更好，而藍(lán)光照射后形成的VVD36 二聚體不光照恢復(fù)其單體形式的半衰期為 18000s，含點突變 C71V 的 VIVID36 二聚化能力更強(qiáng)[Zoltowski, B. D.等，Biochemistry, 2008. 47 (27) :ρ· 7012-9，Schwerdtfeger, C.等，EMBO J, 2003. 22 (18) :ρ· 4846-55.][23，24]。在本發(fā)明一優(yōu)選實施方式中，第二多肽是含一個點突變的刪除前1-36個氨基酸的VVD(C71V)、VVD(N56K)、VVD(Y50W)突變蛋白(核酸序列分別為16、18、20，氨基酸序列分別為17、19、21)。在本發(fā)明一個更優(yōu)選實施方式中，第二多肽是含二個點突變的刪除前1-36 個氨基酸 VVD (N56K C71V)、VVD (I52A C71V)、VVD (I52S C71 V)和 VVD (N56R C71V)突變蛋白(其核酸序列分別為22、24、26、28，氨基酸序列分別為23、25、27和29)。第二個優(yōu)選的第二多肽是燕麥(Avena sativa)光敏色素I基因的L0V2結(jié)構(gòu)域(簡寫為AsL0V2，其核苷酸和氨基酸序列分別為30、31) [Peter, E. , B.等，NatCommun, 2010.1 (8) : 122，Halavaty, A. S.等，Biochemistry, 2007. 46 (49) :p. 14001-9.][25，26]。燕麥細(xì)胞光敏色素I的N端為LOVl和L0V2光氧電壓(LOV)結(jié)構(gòu)域，在藍(lán)光照射下均能與黃素單核苷酸(flavin mononucleotide,FMN)結(jié)合生成一種加成產(chǎn)物。本發(fā)明將燕麥光敏色素I的L0V2結(jié)構(gòu)域連接于第一多肽，成功導(dǎo)致可用光照調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子的第一多肽與對相應(yīng)的反應(yīng)元件的結(jié)合能力。本發(fā)明含有AsL0V2第二多肽的轉(zhuǎn)錄因子LA，在黑暗時可以結(jié)合其對應(yīng)的反應(yīng)元件導(dǎo)致目的基因表達(dá)，而在光照下這種結(jié)合減弱導(dǎo)致目的基因表達(dá)水平上調(diào)。第三個優(yōu)選的第二多肽是無隔藻(Stramenopilealgae Vaucheria frigida)金色素I (aureochromel)蛋白C端的LOV結(jié)構(gòu)域(簡寫為AuLOV,其核酸和蛋白質(zhì)序列分別為序列32和序列33) [Takahashi, F.等，Proc Natl Acad Sci U SA, 2007. 104(49) :19625-19630] [27]。本發(fā)明含有AuLOV第二多肽的重組轉(zhuǎn)錄因子LAu光照后二聚化能力增強(qiáng)使目的基因的表達(dá)水平下調(diào)。以上所述第二多肽中，VVD和AuLOV用適當(dāng)波長光照射可使由其構(gòu)成的重組光敏轉(zhuǎn)錄因子二聚化增強(qiáng)，導(dǎo)致其結(jié)合到反應(yīng)元件上，從而抑制下游基因的轉(zhuǎn)錄；而AsL0V2構(gòu)成的重組光敏轉(zhuǎn)錄因子，在黑暗時二聚化而結(jié)合反應(yīng)元件，從而抑制下游基因的轉(zhuǎn)錄。對來自光敏蛋白的6種不同的LOV結(jié)構(gòu)域用Accelry Discovery Studio2.1進(jìn)行同源性分析，這幾種LOV結(jié)構(gòu)域分別來自VIVID (Ne VVD)、白領(lǐng)-l(Nc WcI),FKFl (At FKF1)、金色素I (Vf AureolLOV)、燕麥向光素I (As phot LOVl和As phot L0V2)。結(jié)果顯示，這幾種蛋白完全相同的氨基酸約為15%，具有相似性的序列約為36% (圖36)。本發(fā)明的光誘導(dǎo)基因表達(dá)系統(tǒng)中，重組光敏轉(zhuǎn)錄因子還可包括第三多肽，該多肽可以招募RNA聚合酶其他組分?？捎米鞅景l(fā)明的第三多肽包括但不限于來自大腸桿菌的ω因子結(jié)構(gòu)域和α因子結(jié)構(gòu)域，這兩種結(jié)構(gòu)域在先前的大腸桿菌單雜交系統(tǒng)中已廣泛被人們采用[Dove, S. L.等，1998. 12(5) :ρ· 745-54，Dove, S. L.等，Nature, 1997. 386(6625) :p.627-30. ] [28，29]。第三多肽可與第一、第二多肽直接或通過接頭肽相連。如上所述，重組光 敏轉(zhuǎn)錄因子所含的兩種或三種多肽之間可以有多種選擇，將兩種或者三種多肽連接成融合蛋白又可以有多種組合選擇，本發(fā)明優(yōu)選具有良好活性的兩種或者三種多肽的功能結(jié)構(gòu)域片段制備盡可能短的重組轉(zhuǎn)錄因子融合蛋白，通過在原核細(xì)菌細(xì)胞中選擇對目的基因的表達(dá)調(diào)控效果好的，即光照和黑暗時導(dǎo)致目的基因表達(dá)量差異大的該光敏轉(zhuǎn)錄因子，以調(diào)節(jié)目的基因的表達(dá)，但不論何種選擇與組合，只要能實現(xiàn)本發(fā)明所設(shè)想的光調(diào)控基因表達(dá)性能的的重組光敏轉(zhuǎn)錄因子，各種組合都包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。本發(fā)明的原核細(xì)菌光誘導(dǎo)基因表達(dá)系統(tǒng)中，第二部分靶轉(zhuǎn)錄單元由轉(zhuǎn)錄因子特異性識別/結(jié)合的啟動子-待轉(zhuǎn)錄核苷酸序列組成，或由啟動子-反應(yīng)元件-待轉(zhuǎn)錄核苷酸序列組成，或由反應(yīng)元件-啟動子-待轉(zhuǎn)錄核苷酸序列組成。其中啟動子或啟動子-反應(yīng)元件或反應(yīng)元件-啟動子的核苷酸序列視不同實施方式所選重組光敏轉(zhuǎn)錄因子的第一多肽不同而不同。換言之，必須根據(jù)所選擇的第一多肽來選擇與其相對應(yīng)的啟動子或者啟動子-反應(yīng)元件或者反應(yīng)元件-啟動子序列。例如，第一多肽為LexA蛋白的DNA識別/結(jié)合域時，其對應(yīng)的反應(yīng)元件為“序列11” ;第一多肽為Cl蛋白的DNA識別/結(jié)合域時，其對應(yīng)的反應(yīng)元件為“序列12”基序；第一多肽為LacI蛋白的DNA識別/結(jié)合域時，其對應(yīng)的反應(yīng)元件為“序列13”基序；第一多肽為Gal4蛋白的DNA識別/結(jié)合結(jié)構(gòu)域時，其對應(yīng)的反應(yīng)元件為“序列14”基序；第一多肽為TetR蛋白的DNA識別/結(jié)合域時，其對應(yīng)的反應(yīng)元件為“序列15”基序。本發(fā)明中與光敏轉(zhuǎn)錄因子相對應(yīng)的反應(yīng)元件一般是包含在啟動子核苷酸序列內(nèi)部，或者位于啟動子的-10區(qū)下游，光敏轉(zhuǎn)錄因子與之結(jié)合后通過阻止RNA聚合酶與啟動子區(qū)域的結(jié)合而下調(diào)下游目的基因的轉(zhuǎn)錄。在本發(fā)明具體的實施方式中，啟動子是大腸桿菌colE啟動子、sulA啟動子、recA啟動子、umuDC啟動子、λ噬菌體012啟動子、噬菌體Τ7啟動子和枯草芽孢桿菌的grac啟動子(核酸序列分別為34、35、36、37、38、39、40)。另外，反應(yīng)元件也可以位于啟動子-35區(qū)的上游，通過光敏轉(zhuǎn)錄因子的第三多肽招募RNA聚合酶的其他組分來啟動下游基因的轉(zhuǎn)錄。分析相關(guān)文獻(xiàn)，這類啟動子包括但不限于Iac最小啟動子(核酸序列為41)，其中上游反應(yīng)元件的個數(shù)可以是I 一 5個或者更多。在本發(fā)明的實施方式中，啟動子以選擇大腸桿菌Iac最小啟動子為佳。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道,所謂“操作性連接”指反應(yīng)元件與啟動子之間或多個反應(yīng)元件之間不是直接相連而可以隔開若干個核苷酸，只要仍能協(xié)同作用即可。本發(fā)明靶轉(zhuǎn)錄單元啟動子下游是待轉(zhuǎn)錄的核苷酸序列，指編碼目的蛋白的核苷酸序列。如上所述，目的蛋白可以是目前已知和將來發(fā)現(xiàn)的任何有用的蛋白。為了驗證本發(fā)明系統(tǒng)的效果和便于檢測，在本發(fā)明的實施例中，采用了示范性的報告蛋白紅色熒光蛋白mCherry (其核酸和氨基酸序列分別為序列42和序列43)、β -半乳糖苷酶(LacZ，其核酸和氨基酸序列分別為序列44和序列45)、Erol巰基氧化酶(其核酸和氨基酸序列分別為序列46和序列47)作為目的蛋白，但本發(fā)明的目的蛋白不限于這些報告蛋白。可用標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)將本發(fā)明光誘導(dǎo)基因表達(dá)系統(tǒng)的第一部分和第二部分構(gòu)建在一個原核細(xì)菌表達(dá)載體中或分別構(gòu)建在二個原核細(xì)菌表達(dá)載體中?？捎脴?biāo)準(zhǔn)技術(shù)將這種表達(dá)載體引入各種原核細(xì)菌細(xì)胞中以表達(dá)所需目的蛋白。本發(fā)明提供含有所述兩種或者三種多肽各種組合的多種重組光敏轉(zhuǎn)錄因子基因的原核細(xì)菌表達(dá)載體。在本發(fā)明一優(yōu)選實施方式中，提供含不同LexA(l-87)與VVD36(C71V)間接頭肽的重組光敏轉(zhuǎn)錄因子LexA(l-87)-VVD36(C71V)基因原核細(xì)菌表達(dá)載體 pLV-LO、pLV-L1、pLV_L2、pLV_L3、pLV_L4、pLV_L5、pLV_L6、pLV_L7、pALV-LO、pALV-L1、pALV-L2、pALV-L3、pALV_L4、pALV_L5、pALV_L6、ApLV_L7 (重組光敏轉(zhuǎn)錄因子簡寫為 LV-L0、LV-LU LV-L2、LV-L3、LV-L4、LV-L5、LV-L6、LV-L7，核苷酸序列分別為 48、50、52、54、56、58、60、62，氨基酸序列分別為49、51、53、55、57、59、61、63)。在另一優(yōu)選實施方式中，提供其中VVD含有單 個點突變的重組光敏轉(zhuǎn)錄因子LexA (1-87) -VVD基因的原核細(xì)菌表達(dá)載體pALV - LO (Y50W)、pALV-LO (N56K)，其中括弧中為VVD中的突變位點，這兩種重組光敏轉(zhuǎn)錄因子的編碼核酸序列分別為64、66，氨基酸序列分別為65、67。在另一優(yōu)選的實施方式中，提供其中VVD含有雙突變點的重組光敏轉(zhuǎn)錄因子LexA(1-87)-VVD基因的原核細(xì)菌表達(dá)載體 pALV-LO (N56K C71V)、pALV-LO (I52A C71V)、pALV-LO (IS2SC71V)和 pALV-LO (N56RC71V)，這四種重組光敏轉(zhuǎn)錄因子的核苷酸序列為68、70、72、74，氨基酸序列分別為69、71、73、75。在另一實施方式中，提供含重組光敏轉(zhuǎn)錄因子LeXA(l-87)-AsL0V2 (簡寫為LA，其編碼核酸和氨基酸序列分別為序列76和序列77)基因的原核細(xì)菌表達(dá)載體pALA。在另一實施方式中，提供含重組光敏轉(zhuǎn)錄因子LeXA(l-87)-AuL0V (簡寫為LAu，其編碼核酸和氨基酸序列分別為序列78和序列79)基因的原核細(xì)菌表達(dá)載體pALAu。在另一實施方式中，提供含重組光敏轉(zhuǎn)錄因子cI(l-102)-VVD36(C71V)(簡寫為CV，其編碼核酸和氨基酸序列分別為序列80和序列81)基因的原核細(xì)菌表達(dá)載體pACV。在另一實施方式中，提供含重組光敏轉(zhuǎn)錄因子LacI(l-62)-VVD36(C71V)(簡寫為LaV，其編碼核酸和氨基酸序列分別為序列82和序列83)基因的原核細(xì)菌表達(dá)載體pALaV。在另一實施方式中，提供含重組光敏轉(zhuǎn)錄因子Gal4 (1-65)-VVD36(C71V)(簡寫為GV，其編碼核酸和氨基酸序列分別為序列84和序列85)基因的原核細(xì)菌表達(dá)載體pAGV。在另一實施方式中，提供含重組光敏轉(zhuǎn)錄因子TetR(l-63)-VVD36(C71V)(簡寫為TV，其編碼核酸和氨基酸序列分別為序列86和序列87)基因的原核細(xì)菌表達(dá)載體pATV。在另一實施方式中，提供含重組光敏轉(zhuǎn)錄因子LexA(1-87) _VVD36(C7IV)-α (簡寫為LV α，其編碼核酸和氨基酸序列分別為序列88和序列89)基因的原核細(xì)菌表達(dá)載體pALVa。在另一實施方式中，提供含重組光敏轉(zhuǎn)錄因子ω-LexA (1-87) _VVD36(C7IV)(簡寫為ω LV，其編碼核酸和氨基酸序列分別為序列90和序列91)基因的原核細(xì)菌表達(dá)載體pAcoLV。在另一實施方式中，提供含重組光敏轉(zhuǎn)錄因子cI(l-102)-VVD36(C71V)-a (簡寫為CV a，其編碼核酸和氨基酸序列分別為序列92和序列93)基因的原核細(xì)菌表達(dá)載體pALVa。在另一實施方式中，提供含重組光敏轉(zhuǎn)錄因子ω-Cl (1-102) _VVD36(C71V)(簡寫為ω CV，其編碼核酸和氨基酸序列分別為序列94和序列95)基因的原核細(xì)菌表達(dá)載體pAcoCV。在另一實施方式中，提供含重組光敏轉(zhuǎn)錄因子LacI(l-62)-VVD36(C71V)-a (簡寫為LaV a，其編碼核酸和氨基酸序列分別為序列96和序列97)基因的原核細(xì)菌表達(dá)載體pALaV a。在另一實施方式中，提供含重組光敏轉(zhuǎn)錄因子ω-LacI (1-62) _VVD36(C71V)(簡寫為ω LaV，其編碼核酸和氨基酸序列分別為序列98和序列99)基因的原核細(xì)菌表達(dá)載體pAcoLaV。在另一實施方式中，提供含重組光敏轉(zhuǎn)錄因子Gal4(l-65)_VVD36(C71V)-a (簡寫為GV a，其編碼核酸和氨基酸序列分別為序列100和序列101)基因的原核細(xì)菌表達(dá)載體pAGVa。在另一實施方式中，提供含重組光敏轉(zhuǎn)錄因子o-Gal4(l-65)-VVD36(C71V)(簡寫為ω GV，其編碼核酸和氨基酸序列分別為序列102和序列103)基因的原核細(xì)菌表達(dá)載體pAcoGV。在另一實施方式中，提供含重組光敏轉(zhuǎn)錄因子TetR(l-63)-VVD36(C71V)-a (簡寫為TVa，其編碼核酸和氨基酸序列分別為序列104和序列105)基因的原核細(xì)菌表達(dá)載體pATV a。在另一實施方式中，提供含重組光敏轉(zhuǎn)錄因子ω-TetR(1-63)_VVD36(C7IV)(簡寫為ω ，其編碼核酸和氨基酸序列分別為序列106和序列107)基因的原核細(xì)菌表達(dá)載體ρΑω 。在另一實施方式中，提供含重組光敏轉(zhuǎn)錄因子LV-LO基因以及祀轉(zhuǎn)錄單元colE-mCherry的原核細(xì)菌表達(dá)載體 pD_coIEnCherry-Amp-LV(其中 ter-colE-mCherry-Amp-LV-ter 核苷酸序列為108)。在另一實施方式中，提供含重組光敏轉(zhuǎn)錄因子LacI(l-62，wt)-VVD36(C71V)基因(簡寫為LaV (wt)，其編碼 核酸和氨基酸序列分別為序列109和序列110)以及靶轉(zhuǎn)錄單元Pgrac-mCherry 的原核細(xì)菌表達(dá)載 pHTOl-LaV (wt) -PgracmCherry (其中 LaV (wt) -Pgrac-mCherry核苷酸序列為111)。本發(fā)明提供含待轉(zhuǎn)錄核苷酸序列空缺的靶轉(zhuǎn)錄單元的原核細(xì)菌表達(dá)載體，待轉(zhuǎn)錄的核苷酸序列空缺是讓用戶可以自行選擇所需的待轉(zhuǎn)錄的核苷酸序列，例如目的蛋白的編碼基因，用標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA技術(shù)將其插入本發(fā)明的這種表達(dá)載體中，與上面所述含重組光敏轉(zhuǎn)錄因子基因的表達(dá)載體共同轉(zhuǎn)化原核細(xì)菌細(xì)胞，來調(diào)節(jié)待轉(zhuǎn)錄核苷酸序列(基因)的表達(dá)。在本發(fā)明的一些實施方式中，原核細(xì)菌表達(dá)載體的靶轉(zhuǎn)錄單元中空缺的待轉(zhuǎn)錄核苷酸序列分別是LexA對應(yīng)的colE-待轉(zhuǎn)錄核苷酸序列、LexA對應(yīng)的sulA-待轉(zhuǎn)錄核苷酸序列、LexA對應(yīng)的RecA-待轉(zhuǎn)錄核苷酸序列、LexA對應(yīng)的umuDC-待轉(zhuǎn)錄核苷酸序列、LexA對應(yīng)的LexA反應(yīng)元件-1ac最小啟動子-待轉(zhuǎn)錄核苷酸序列、cl對應(yīng)的PA()1；r待轉(zhuǎn)錄核苷酸序列、Cl對應(yīng)的Cl反應(yīng)元件012-lac最小啟動子-待轉(zhuǎn)錄核苷酸序列、IacI對應(yīng)的T7_lacl反應(yīng)元件-待轉(zhuǎn)錄核苷酸序列、IacI對應(yīng)的IacI反應(yīng)元件-1ac最小啟動子-待轉(zhuǎn)錄核苷酸序列、Gal4對應(yīng)的T7-Gal4反應(yīng)元件-待轉(zhuǎn)錄核苷酸序列、Gal4對應(yīng)的Gal4反應(yīng)元件-1ac最小啟動子-待轉(zhuǎn)錄核苷酸序列、TetR對應(yīng)的T7_TetR反應(yīng)元件-待轉(zhuǎn)錄核苷酸序列、TetR對應(yīng)的TetR反應(yīng)元件-1ac最小啟動子-待轉(zhuǎn)錄核苷酸序列。本發(fā)明也提供分別轉(zhuǎn)化了各種重組光敏轉(zhuǎn)錄因子基因的原核細(xì)菌表達(dá)載體或者基因組上整合了各種重組光敏轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)框的原核細(xì)菌菌株，同時提供含有啟動子或啟動子-反應(yīng)元件或反應(yīng)元件-啟動子而待轉(zhuǎn)錄核苷酸序列空缺的原核細(xì)菌表達(dá)載體。用戶可用標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)將自行選擇的待轉(zhuǎn)錄核苷酸序列(目的蛋白基因)插入該表達(dá)載體中，然后用該重新構(gòu)建的載體轉(zhuǎn)化已轉(zhuǎn)化了各種重組光敏轉(zhuǎn)錄因子基因的原核細(xì)菌表達(dá)載體或者基因組上已整合了各種重組光敏轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)框的原核細(xì)菌菌株，并培養(yǎng)這種原核細(xì)菌細(xì)胞表達(dá)他們所需的目的基因，或供他們研究如何調(diào)節(jié)目的基因的表達(dá)。 本發(fā)明還提供裝有各種表達(dá)載體或已轉(zhuǎn)化了這種載體或者基因組上整合了各種重組光轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)框的原核細(xì)菌細(xì)胞的試劑盒。在一個實施方式中，該試劑盒中一些容器分別裝有含一種或多種重組光敏轉(zhuǎn)錄因子基因的原核細(xì)菌表達(dá)載體。在另一個實施方式中，該試劑盒中的一些容器分別裝有含一種或多種重組光敏轉(zhuǎn)錄因子基因的原核細(xì)菌表達(dá)載體，另一些容器分別裝有含靶轉(zhuǎn)錄單元(其中啟動子-待轉(zhuǎn)錄核苷酸序列空缺或啟動子-反應(yīng)元件-待轉(zhuǎn)錄核苷酸序列空缺或反應(yīng)元件-啟動子-待轉(zhuǎn)錄核苷酸序列空缺)的原核細(xì)菌表達(dá)載體。在還有一個實施方式中，該試劑盒中一些容器裝有已轉(zhuǎn)化了含重組光敏轉(zhuǎn)錄因子基因的原核細(xì)菌表達(dá)載體或者基因組上已整合了各種重組光敏轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)框的原核細(xì)菌細(xì)胞，另一些容器裝有啟動子-待轉(zhuǎn)錄核苷酸序列空缺或者啟動子-反應(yīng)元件-待轉(zhuǎn)錄核苷酸序列空缺或者反應(yīng)元件-啟動子-待轉(zhuǎn)錄核苷酸序列空缺的原核細(xì)菌表達(dá)載體。本發(fā)明的試劑盒還可以包含相應(yīng)的光照控制設(shè)備，例如LED燈及其調(diào)控裝置。所有試劑盒都裝有相應(yīng)的說明書，以說明盒中的各成分、使用目的和使用方法，并提供有關(guān)的參考文獻(xiàn)目錄。本發(fā)明還包括光誘導(dǎo)基因表達(dá)系統(tǒng)在原核細(xì)菌細(xì)胞中調(diào)控基因表達(dá)的方法，包括步驟a)將所述原核細(xì)菌光誘導(dǎo)基因表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建在原核細(xì)菌表達(dá)載體中；b)引入含被調(diào)控基因的原核細(xì)菌細(xì)胞；和c)光照誘導(dǎo)所述原核細(xì)菌細(xì)胞，使所述原核細(xì)菌細(xì)胞中的被調(diào)控的核苷酸進(jìn)行表達(dá)。光照誘導(dǎo)所述原核細(xì)菌細(xì)胞的方法包括光源的選擇和光源的使用。光源非限制地包括LED燈、白熾燈、熒光燈、激光。在本發(fā)明的一個實施方式中，光源選用藍(lán)色LED(460-470nm)。光照方法包括光照量、光照強(qiáng)度、光照時間、光照頻率以及用掃描、投影、光模具等方法在空間上控制目的基因的表達(dá)也包含在本發(fā)明范圍中。在本發(fā)明的一個實施方式中，光照強(qiáng)度為0-0. 125mff/cm2不等；在另一個實施方式中，用打印的投影片作為光模具，在空間上調(diào)節(jié)不同位置的細(xì)胞的目的基因的表達(dá)水平；在另一個實施方式中，用中性灰度片作為光模具，在空間上調(diào)節(jié)不同位置的細(xì)胞的目的基因的表達(dá)水平。附圖簡要說明

圖1是重疊PCR的示意圖。圖2是同源重組連接示意圖。圖3為反向PCR的原理。
圖4為以T7啟動子進(jìn)行表達(dá)的含不同接頭肽的重組光敏轉(zhuǎn)錄因子原核細(xì)菌表達(dá)載體構(gòu)建示意圖。上方為不同接頭肽重組光敏轉(zhuǎn)錄因子融合蛋白的示意圖，下方為環(huán)狀的表達(dá)載體的示意圖。表達(dá)載體的骨架為P⑶FDuetl。圖5為以Amp啟動子進(jìn)行表達(dá)的含不同接頭肽的重組光敏轉(zhuǎn)錄因子原核細(xì)菌表達(dá)載體構(gòu)建示意圖。上方為不同接頭肽重組光敏轉(zhuǎn)錄因子融合蛋白的示意圖，下方為環(huán)狀的表達(dá)載體的示意圖。表達(dá)載體的骨架為P⑶FDuetl。圖6為含以不同VVD突變體、AsL0V2和AuLOV為第二多肽的光敏轉(zhuǎn)錄因子原核表達(dá)載體的構(gòu)建示意圖。上方為各光敏轉(zhuǎn)錄因子融合蛋白的示意圖，下方為環(huán)狀的表達(dá)載體的示意圖。表達(dá)載體的骨架為P⑶FDuetl。圖7為含以cl、Lac1、Gal4、和TetR為第一多肽的光敏轉(zhuǎn)錄因子原核表達(dá)載體的構(gòu)建示意圖。上方為光敏轉(zhuǎn)錄因子融合蛋白的示意圖，下方為環(huán)狀的表達(dá)載體的示意圖。表達(dá)載體的骨架為pCDFDuetl。圖8為含以ω因子為第三多肽的重組光敏轉(zhuǎn)錄因子原核表達(dá)載體的構(gòu)建示意圖。上方為光敏轉(zhuǎn)錄因子融合蛋白的示意圖，下方為環(huán)狀的表達(dá)載體的示意圖。表達(dá)載體的骨架為 pCDFDuetl。圖9為含以α因子為第三多肽的重組光敏轉(zhuǎn)錄因子原核表達(dá)載體的構(gòu)建示意圖。上方為各光敏轉(zhuǎn)錄因子融合蛋白的示意圖，下方為環(huán)狀的表達(dá)載體的示意圖。表達(dá)載體的骨架為 pCDFDuetl。圖10為含有LexA、cl、Lac1、Gal4和TetR相對應(yīng)反應(yīng)元件的靶轉(zhuǎn)錄單元的原核細(xì)菌表達(dá)載體的構(gòu)建示意圖。上方為各靶轉(zhuǎn)錄單元的示意圖，下方為環(huán)狀的表達(dá)載體的示意圖。表達(dá)載體的骨架為pRSETb。圖11為以ω因子或α因 子為第三多肽的重組光敏轉(zhuǎn)錄因子所對應(yīng)的含有LexA、cl、LacI> Gal4和TetR相對應(yīng)反應(yīng)元件的祀轉(zhuǎn)錄單元的原核細(xì)菌表達(dá)載體的構(gòu)建示意圖。上方為各靶轉(zhuǎn)錄單元的示意圖，下方為環(huán)狀的表達(dá)載體的示意圖。表達(dá)載體的骨架為pRSETbο圖12為以Cl阻遏蛋白為間接調(diào)控作用的原核細(xì)菌表達(dá)載體的構(gòu)建示意圖。上方為各靶轉(zhuǎn)錄單元的示意圖，下方為環(huán)狀的表達(dá)載體的示意圖。表達(dá)載體的骨架為pRSETb。圖13為以T7啟動子表達(dá)不同接頭肽的光敏轉(zhuǎn)錄因子的JM109(DE3，sulA_，LexA_)細(xì)胞中，光照對mCherry的表達(dá)水平的調(diào)節(jié)。橫軸為共轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒名稱，縱軸為mCherry相對表達(dá)水平。圖14為以Amp啟動子表達(dá)不同接頭肽的光敏轉(zhuǎn)錄因子的JM109(DE3，SulA_，LexA_)細(xì)胞中，光照對mCherry的表達(dá)水平的調(diào)節(jié)。橫軸為共轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒名稱，縱軸為mCherry相對表達(dá)水平。圖15為光敏轉(zhuǎn)錄因子LV-LO對LacZ表達(dá)水平的調(diào)節(jié)。橫軸為共轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒名稱，縱軸為LacZ相對表達(dá)水平。圖16為光敏轉(zhuǎn)錄因子LV-LO對其他三種含LexA相對應(yīng)反應(yīng)元件的原核表達(dá)載體中mCherry表達(dá)水平的調(diào)節(jié)。橫軸為共轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒名稱，縱軸為mCherry相對表達(dá)水平。圖17為在表達(dá)以幾種VVD突變體的第二多肽的轉(zhuǎn)錄因子的JM109 (DE3, sulA_，LexAO細(xì)胞中，光照對mCherry的表達(dá)水平的調(diào)節(jié)。橫軸為共轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒名稱，縱軸為mCherry相對表達(dá)水平。圖18為在表達(dá)以Cl、LacI, Gal4、和TetR為第一多肽的轉(zhuǎn)錄因子的JM109 (DE3, sulA_，LexAO細(xì)胞中，光照對mCherry的表達(dá)水平的調(diào)節(jié)。橫軸為共轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒名稱，縱軸為mCherry相對表達(dá)水平。圖19為在表達(dá)以AsL0V2和AuLOV第二多肽的轉(zhuǎn)錄因子的JM109 (DE3, sulA_，LexAO細(xì)胞中，光照對mCherry的表達(dá)水平的調(diào)節(jié)。橫軸為共轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒名稱，縱軸為mCherry相對表達(dá)水平。圖20為在表達(dá)以ω因子為第三多肽的轉(zhuǎn)錄因子的JM109(DE3，suM—，LexA—)細(xì)胞中，光照對mCherry的表達(dá)水平的調(diào)節(jié)。橫軸為共轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒名稱，縱軸為mCherry相對表達(dá)水平。圖21為在表達(dá)以α因子為第三多肽的轉(zhuǎn)錄因子的JM109(DE3，SulA_，LexA_)細(xì)胞中，光照對mCherry的表達(dá)水平的調(diào)節(jié)。橫軸為共轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒名稱，縱軸為mCherry相對表達(dá)水平。圖22為光敏轉(zhuǎn)錄因子LV-LO在不同溫度條件下對mCherry表達(dá)水平的調(diào)節(jié)。橫軸為共轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒名稱，縱軸為mCherry相對表達(dá)水平。圖23為光敏轉(zhuǎn)錄因子LV-LO對以cl阻遏蛋白為間接調(diào)控作用的原核細(xì)菌表達(dá)載體中mCherry表達(dá)量的調(diào)節(jié)。橫軸為共轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒名稱，縱軸為mCherry相對表達(dá)水平。圖24為含光敏轉(zhuǎn)錄因子LV-LO和靶轉(zhuǎn)錄單元的單表達(dá)載體在光照前后mCherry表達(dá)量的差異。橫軸為共轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒名稱，縱軸為mCherry相對表達(dá)水平。圖25為了檢測含光敏轉(zhuǎn)錄因子LaV(Wt)和靶轉(zhuǎn)錄單元的原核表達(dá)質(zhì)粒在枯草芽孢桿菌細(xì)胞中對mCherry表達(dá)量的調(diào)節(jié)。橫軸為共轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒名稱，縱軸為mCherry相對表達(dá)水平。 圖26為檢測JM109(DE3，sulA_，LexA Amp-LV-LO)菌株自身表達(dá)光敏轉(zhuǎn)錄因子LV-LO對mCherry表達(dá)量的調(diào)節(jié)。橫軸為共轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒名稱，縱軸為mCherry相對表達(dá)水平。圖27為表達(dá)重組光敏轉(zhuǎn)錄因子LV-LO的細(xì)胞中，光照誘導(dǎo)的目的基因表達(dá)的時間動力學(xué)過程和可逆性過程。橫軸為光照時間，表示樣品在該時間點由光照轉(zhuǎn)移到黑暗條件，縱軸為mCherry的表達(dá)水平。圖28為表達(dá)重組光敏轉(zhuǎn)錄因子LV-LO的細(xì)胞中，光照誘導(dǎo)的目的基因表達(dá)的時間動力學(xué)過程和可逆性過程。橫軸為光照時間，表示樣品在該時間點由黑暗轉(zhuǎn)移到光照條件，縱軸為mCherry的表達(dá)水平。圖29為在表達(dá)重組光敏轉(zhuǎn)錄因子LV-LO的細(xì)胞中，不同的光照強(qiáng)度對目的基因表達(dá)水平的調(diào)節(jié)。橫軸為光照強(qiáng)度，縱軸為mCherry的相對表達(dá)水平。圖30為用打印圖案投影片給表達(dá)重組光敏轉(zhuǎn)錄因子LV-LO細(xì)胞“拍照”得到的“Stop”圖案。左圖為貼有培養(yǎng)板底部的投影片的照片，右圖為克隆長出來后對平板進(jìn)行成像的熒光圖像。圖31為表達(dá)了重組光敏轉(zhuǎn)錄因子LV-LO對細(xì)菌移動的調(diào)節(jié)的白光成像結(jié)果，左邊為黑暗條件下，右邊是光照條件下的，1、2、3代表不同的共轉(zhuǎn)化質(zhì)粒。圖32為表達(dá)了重組光敏轉(zhuǎn)錄因子LV-LO對細(xì)菌細(xì)胞裂解的調(diào)節(jié)結(jié)果。橫軸為共轉(zhuǎn)化質(zhì)粒名稱，縱軸為細(xì)胞的裂解效率。圖33為AKTA purifier的離子交換柱洗脫峰圖。橫軸為洗脫管號，縱軸為紫外吸收值。圖34為離子交換柱洗脫后部分管蛋白的12%SDS_PAGE蛋白電泳圖。圖35為合并后最終蛋白溶液的12%SDS_PAGE蛋白電泳圖。圖36為6種來自光敏蛋白的不同LOV結(jié)構(gòu)域的同源性分析，其中黑色表示100%相同的氨基酸序列，深灰色表相似性較高的序列，淺灰色表示相似性中等的序列。
具體實施例方式以下用實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步闡述。這些實施例僅僅用于舉例說明，而不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。實施例中主要采用常規(guī)的基因工程分子生物學(xué)克隆方法，這些方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的，例如簡·羅斯凱姆斯等的《分子生物學(xué)實驗參考手冊》和J.薩姆布魯克，D.W.拉塞爾著，黃培堂等譯《分子克隆實驗指南》(第三版，2002年8月，科學(xué)出版社出版，北京)中的有關(guān)章節(jié)。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員按照以下實施例，不難根據(jù)具體情況略作修改和變換而成功實施本發(fā)明，這些修改和變換均落在本申請權(quán)利要求的范圍內(nèi)。實施例中所用的pCDFDuetl質(zhì)粒載體購自Novagen公司，pRSETb、pBAD/His A質(zhì)粒載體購自Invitrogen公司，pKD3、pKD4、pCP20、pKD46由華東理工大學(xué)鮑杰老師實驗室慷慨饋贈。所有用于PCR的引物均由上海杰瑞生物工程技術(shù)有限公司合成、純化和經(jīng)質(zhì)譜法鑒定正確。實施例中構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒都經(jīng)過序列測定，序列測定由華大基因公司和杰李測序公司完成。各實施例所用的Taq DNA聚合酶購自東盛生物，pfu DNA聚合酶購自天根生化科技(北京)有限公司，PrimeSTAR DNA聚合酶購自TaKaRa公司，三種聚合酶購買時都附帶贈送對應(yīng)聚合酶緩沖液和 dNTP。BamH1、BglI1、HindII1、Nde1、Xho1、Sac1、EcoR1、SpeI等限制性內(nèi)切酶、T4連接酶、T4磷酸化酶(T4PNK)購自Fermentas公司，購買時附帶有相對應(yīng)的緩沖液等。實施例中所用的CloneEZ PCR克隆試劑盒(含同源重組酶)購自南京金斯瑞生物科技有限公司(原金思特科技(南京)有限公司)。除非特別聲明，無機(jī)鹽類化學(xué)試劑均購自國藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司?？敲顾?Kanamycin)購自Ameresco公司；氨節(jié)青霉素(Amp)購自Ameresco公司；鏈霉素購自Ameresco公司；0NPG購自Ameresco公司；384孔發(fā)光檢測白板、384孔突光檢測黑板購自Grenier公司。實施例中所用的DNA純化試劑盒購自BBI公司(加拿大)，普通質(zhì)粒小抽試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司?？寺【闙achl購自Invitrogen公司。JM109 (DE3)表達(dá)菌株購自Promega公司，BL21 (DE3)菌株購自Novagen公司。實施例中用到的主要儀器Biotek Synergy2多功能酶標(biāo)儀(美國Bio-Tek公司)，X-15R高速冷凍離心機(jī)(美國Beckman公司)，Microfuge22R臺式高速冷凍離心機(jī)(美國Beckman公司),PCR擴(kuò)增儀(德國Biometra公司),活體成像系統(tǒng)(美國Kodak公司),光度計(日本和光公司)，核酸電泳儀(申能博彩公司)。縮寫詞意義如下“h”指小時，“min”指分鐘，“s”指秒，“d”指天，“ μ L”指微升，“ml”指毫升，“L “指升，“bp”指堿基對，“mM”指毫摩爾，“μΜ”指微摩爾。20種氨基酸及簡稱
權(quán)利要求
1.一種原核細(xì)菌光誘導(dǎo)基因表達(dá)系統(tǒng)，包括a)重組光敏轉(zhuǎn)錄因子編碼基因，所述重組光敏轉(zhuǎn)錄因子包括作為DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的第一多肽和作為光敏結(jié)構(gòu)域的第二多肽；b)革巴轉(zhuǎn)錄單元，包括被所述第一多肽識別/結(jié)合的包含至少一個反應(yīng)元件的啟動子或啟動子-反應(yīng)元件或反應(yīng)元件-啟動子，及待轉(zhuǎn)錄核酸序列。
2.如權(quán)利要求1所述的原核細(xì)菌光誘導(dǎo)基因表達(dá)系統(tǒng)，其中所述第一多肽與第二多肽之間可直接或操作性連接，和/或所述祀轉(zhuǎn)錄單元中的所述啟動子或啟動子-反應(yīng)元件或反應(yīng)元件-啟動子與所述待轉(zhuǎn)錄核酸序列之間可直接或操作性連接。
3.如權(quán)利要求1所述的原核細(xì)菌光誘導(dǎo)基因表達(dá)系統(tǒng)，其中所述第一多肽選自螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、鋅指基序或鋅簇DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、亮氨酸拉鏈DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、翼狀螺旋DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、翼狀螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、螺旋-環(huán)-螺旋DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、高遷移率族DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，和B3DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
4.如權(quán)利要求3所述的原核細(xì)菌光誘導(dǎo)基因表達(dá)系統(tǒng)，其中所述第一多肽選自大腸桿菌LexA DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、λ噬菌體CI阻遏蛋白的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、Lac阻遏蛋白LacI的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、Gal4蛋白的DNA識別/結(jié)合域、四環(huán)素阻遏蛋白TetR的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、色氨酸阻遏蛋白TrpR的DNA識別/結(jié)合域，及其截短體或/和氨基酸序列同源性80%_99%的突變體。
5.如權(quán)利要求1所述的原核細(xì)菌光誘導(dǎo)基因表達(dá)系統(tǒng)，其中所述第二多肽選自含黃素類生色團(tuán)的光敏蛋白的光敏結(jié)構(gòu)域和含LOV結(jié)構(gòu)域的光敏蛋白的光敏結(jié)構(gòu)域。
6.如權(quán)利要求5所述的原核細(xì)菌光誘導(dǎo)基因表達(dá)系統(tǒng)，其中所述第二多肽選自粗糙鏈孢霉菌的VIVID的L0V2結(jié)構(gòu)域、燕麥光敏色素I基因的L0V2結(jié)構(gòu)域AsL0V2和無隔藻金色素蛋白I的LOV結(jié)構(gòu)域AulOV和假單胞菌的LOV結(jié)構(gòu)域PpSBl_L0V及其截短體或氨基酸序列15%-99%相同或氨基酸序列36%-99%相似的突變體。
7.如權(quán)利要求1所述的原核細(xì)菌光誘導(dǎo)基因表達(dá)系統(tǒng)，其中還包含招募RNA聚合酶其他組分的第三多肽，所述第三多肽與第一、第二多肽直接或通過接頭肽相連。
8.如權(quán)利要求7所述的原核細(xì)菌光誘導(dǎo)基因表達(dá)系統(tǒng)，其中所述的第三多肽選自大腸桿菌的ω因子、α因子或氨基酸序列36%_99%相似的突變體。
9.如權(quán)利要求1所述的原核細(xì)菌光誘導(dǎo)基因表達(dá)系統(tǒng)，其中所述反應(yīng)元件為可被所述第一多肽特異性識別和結(jié)合的DNA基序,選自LexA結(jié)合元件、cl結(jié)合元件、LacI結(jié)合元件、Gal4結(jié)合元件和TetR結(jié)合元件。
10.如權(quán)利要求1所述的原核細(xì)菌光誘導(dǎo)基因表達(dá)系統(tǒng)，其中所述的啟動子選自大腸桿菌的colE啟動子、sulA啟動子、recA啟動子、umuDC啟動子、Iac最小啟動子、T7噬菌體的T7啟動子、λ噬菌體的012啟動子，枯草芽孢桿菌的grac啟動子。
11.含有權(quán)利要求ι- ο之一所述原核細(xì)菌光誘導(dǎo)基因表達(dá)系統(tǒng)中所述重組光敏轉(zhuǎn)錄因子編碼基因和/或所述靶轉(zhuǎn)錄單元的原核細(xì)菌表達(dá)載體。
12.如權(quán)利要求11所述的原核細(xì)菌表達(dá)載體，其中所述靶轉(zhuǎn)錄單元中待轉(zhuǎn)錄核酸序列空缺。
13.如權(quán)利要求12所述的原核細(xì)菌表達(dá)載體，其中所述重組光敏轉(zhuǎn)錄因子編碼基因的核苷酸序列選自序列 48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、.86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、109 ;氨基酸序列選自序列 49、51、53、55、57、.59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、.107,110ο
14.用權(quán)利要求1-10之一所述原核細(xì)菌光誘導(dǎo)基因表達(dá)系統(tǒng)在原核細(xì)菌細(xì)胞中調(diào)控基因表達(dá)的方法，包括步驟a)將所述原核細(xì)菌光誘導(dǎo)基因表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建在原核細(xì)菌表達(dá)載體中；b)引入含被調(diào)控基因的原核細(xì)菌細(xì)胞；和c)光照誘導(dǎo)所述原核細(xì)菌細(xì)胞，使所述原核細(xì)菌細(xì)胞中的被調(diào)控的核苷酸進(jìn)行表達(dá)。
15.如權(quán)利要求14所述的調(diào)控基因表達(dá)的方法，其中還包括光源的選擇和照射方法的選擇，所述光源包括LED燈、熒光燈、激光和白熾燈，所述照射方法是持續(xù)的光照或不連續(xù)的光照。
16.如權(quán)利要求14所述的調(diào)控基因表達(dá)的方法，包括用光掃描、投影、光模具在空間上控制不同位置的細(xì)胞的基因表達(dá)水平。
17.如權(quán)利要求14所述的調(diào)控基因表達(dá)的方法，其中還包括用打印的投影膠片、中性灰度片在空間上控制不同位置的細(xì)胞的基因表達(dá)水平。
18.—種試劑盒，裝有權(quán)利要求11所述原核細(xì)菌表達(dá)載體或基因組上整合了權(quán)利要求1所述表達(dá)系統(tǒng)中光敏轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)框的原核細(xì)菌菌株，及相應(yīng)的說明書。
19.如權(quán)利要求18所述的試劑盒，其中所述原核細(xì)菌表達(dá)載體中待轉(zhuǎn)錄核酸序列空缺。
20.權(quán)利要求1所述原核細(xì)菌光誘導(dǎo)基因表達(dá)系統(tǒng)在調(diào)節(jié)原核細(xì)菌的生命活動上的用途，所述生命活動包括細(xì)菌的移動、裂解。
全文摘要
本發(fā)明提供一種原核細(xì)菌光誘導(dǎo)基因表達(dá)系統(tǒng)，包括a)重組光敏轉(zhuǎn)錄因子編碼基因，所述重組光敏轉(zhuǎn)錄因子包括作為DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的第一多肽和作為光敏結(jié)構(gòu)域的第二多肽；b)靶轉(zhuǎn)錄單元，包括被所述第一多肽識別/結(jié)合的至少一個反應(yīng)元件的啟動子或啟動子-反應(yīng)元件或反應(yīng)元件-啟動子和待轉(zhuǎn)錄核酸序列。本發(fā)明還提供包含這種光誘導(dǎo)基因表達(dá)系統(tǒng)的原核細(xì)菌表達(dá)載體，和用這種光誘導(dǎo)基因表達(dá)系統(tǒng)在原核細(xì)菌中調(diào)控基因表達(dá)的方法，以及裝有所述光誘導(dǎo)基因表達(dá)系統(tǒng)各組分的試劑盒。本發(fā)明的原核細(xì)菌光誘導(dǎo)基因表達(dá)系統(tǒng)誘導(dǎo)快速、高效且強(qiáng)，比其他誘導(dǎo)劑安全，毒性小或無毒性；它可在時間和空間上控制基因的表達(dá)；可用于調(diào)節(jié)原核細(xì)菌的生命活動。
文檔編號C12N15/75GK103031327SQ201210274040
公開日2013年4月10日 申請日期2012年8月2日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月2日
發(fā)明者楊弋, 陳顯軍, 馬正才, 劉韌玫 申請人:華東理工大學(xué)