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一種微生物可誘導(dǎo)基因表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)的制作方法

文檔序號(hào):9722666閱讀:1582來(lái)源:國(guó)知局
一種微生物可誘導(dǎo)基因表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域,具體涉及一種微生物基因表達(dá)調(diào)控方法。
【背景技術(shù)】
[0002]基因在轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控是微生物主要的基因表達(dá)調(diào)控方式,也是當(dāng)前微生物代謝工程的研究熱點(diǎn)。轉(zhuǎn)錄調(diào)控受到多種順式作用元件和反式作用因子的相互協(xié)調(diào)控制,其中啟動(dòng)子是重要的順式作用元件,它基本決定一個(gè)基因是否表達(dá)、何時(shí)和何處表達(dá)。啟動(dòng)子通常位于功能基因的5’端上游,能夠與RNA聚合酶以及其他蛋白輔助因子等反式元件相結(jié)合,從而控制基因轉(zhuǎn)錄的起始和效率。微生物的啟動(dòng)子可分為組成型啟動(dòng)子和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。組成型啟動(dòng)子能在所有細(xì)胞中,不分時(shí)間和空間地啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄;誘導(dǎo)型啟動(dòng)子則能在某些特定的物理、化學(xué)和生物信號(hào)(誘導(dǎo)物)的刺激下,可以大幅度增加目的基因的轉(zhuǎn)錄水平。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子具有廣闊的基因工程應(yīng)用前景,它可根據(jù)需要在細(xì)胞特定的生長(zhǎng)階段或生長(zhǎng)環(huán)境下,快速誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄的“開(kāi)”與“關(guān)”,實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的預(yù)想調(diào)控,從而實(shí)現(xiàn)控制微生物生理代謝的目的。
[0003]以纖維素降解梭菌的應(yīng)用為例,梭菌屬含有多種纖維素降解菌株,如解纖維梭菌(Cl os tridium cellulolyticum )和熱纖梭菌(Cl os tridium thermocellum )等,他們能夠高效降解纖維素合成乙醇,是潛在的通過(guò)整合生物加工技術(shù)實(shí)現(xiàn)木質(zhì)纖維素高效利用的生產(chǎn)菌株。然而,野生型菌株尚不能滿足木質(zhì)纖維素轉(zhuǎn)化的工業(yè)化要求,必須進(jìn)行系統(tǒng)的代謝工程改造,這需要對(duì)目標(biāo)內(nèi)源或外源基因及相關(guān)代謝或調(diào)控途徑功能的精確控制。
[0004]采用可誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)是常用的實(shí)現(xiàn)基因功能可控的方法。目前已報(bào)道一些以化合物或射線為誘導(dǎo)劑的可誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)(Appl Environ Microb1l 2014;80:2410-6;Metab Eng 2012;14:59-67; Appl Environ Microb1l 2003;69:4985-8; Appl EnvironMicrob1l 2011;77:471-8; Gene Ther 2001;8:1197-201)。其中,誘導(dǎo)系統(tǒng) Pcm_2tet01具有最高的誘導(dǎo)效率及嚴(yán)謹(jǐn)性,及在有誘導(dǎo)劑脫水四環(huán)素存在的條件下,基因表達(dá)水平可以上調(diào)313倍。但是,高濃度脫水四環(huán)素對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有害,因此該誘導(dǎo)系統(tǒng)不能在具有高劑量誘導(dǎo)劑的最優(yōu)化條件下工作(Metab Eng 2012; 14:59_67)。因此,需要進(jìn)一步開(kāi)發(fā)誘導(dǎo)劑不抑制生長(zhǎng)且更為高效和嚴(yán)謹(jǐn)?shù)恼T導(dǎo)表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)。
[0005]基于二類內(nèi)含子的Targetron、Clostron基因革巴向操作方法具有操作簡(jiǎn)單、周期短、效率高、無(wú)需抗性篩選、對(duì)轉(zhuǎn)化效率要求低等優(yōu)點(diǎn),能夠彌補(bǔ)同源重組方法的缺點(diǎn),已廣泛的應(yīng)用于基礎(chǔ)研究和工程菌株的改造(Csh Perspect B1l 2011; 3.;J Microb1lMethods 2007;70:452-64)。二類內(nèi)含子基因失活的原理是RNA “歸巢(retrohoming)”效應(yīng),以L1.LtrB內(nèi)含子為例,二類內(nèi)含子的基因失活分兩階段進(jìn)行:1) L1.LtrB內(nèi)含子(核酶)自我切割形成“套索”結(jié)構(gòu);2)自我剪切形成“套索”結(jié)構(gòu)的二類內(nèi)含子與具有反轉(zhuǎn)錄酶活性的IEP (intron-encoded protein)蛋白結(jié)合,形成RNP復(fù)合體。RNP復(fù)合體識(shí)別特定的DNA序列,并將內(nèi)含子RNA序列插入識(shí)別位點(diǎn)的DNA正義鏈。IEP部分消化反義鏈,并以內(nèi)含子RNA為模板,剩余反義鏈DNA為引物,逆轉(zhuǎn)錄出與內(nèi)含子RNA互補(bǔ)的cDNA序列。隨后內(nèi)含子RNA被胞內(nèi)RNA酶消化,最后DNA正義鏈缺口被胞內(nèi)DNA修復(fù)系統(tǒng)修復(fù),完成基于二類內(nèi)含子的基因失活過(guò)程。然而二類內(nèi)含子基因靶向操作技術(shù)的特異性依賴于RNP復(fù)合體對(duì)特定序列的識(shí)別,而識(shí)別序列較短,通常為幾個(gè)到十余個(gè)堿基,導(dǎo)致非特異性識(shí)別頻率(即脫靶率)較高,嚴(yán)重影響了其在精確基因靶向操作方面的應(yīng)用。縮短二類內(nèi)含子元件在胞內(nèi)的作用時(shí)間和強(qiáng)度有可能改善脫靶率高這一技術(shù)難題,然而該技術(shù)需要與嚴(yán)謹(jǐn)高效的誘導(dǎo)表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)相結(jié)合。
[0006]為了解決以上對(duì)高效嚴(yán)謹(jǐn)且誘導(dǎo)劑價(jià)廉對(duì)細(xì)胞無(wú)害的誘導(dǎo)表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)的需求,本發(fā)明人開(kāi)發(fā)了一種基于阿拉伯糖誘導(dǎo)的基因誘導(dǎo)表達(dá)調(diào)控系統(tǒng),在微生物基因工程改造中具有良好的應(yīng)用前景。
[0007]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的在于提供一種誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、基于該啟動(dòng)子的基因誘導(dǎo)表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)、以及基于該表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)開(kāi)發(fā)的改良微生物遺傳操作工具及方法。采用L-阿拉伯糖為誘導(dǎo)劑,阿拉伯糖是一種自然界普遍存在的碳源,對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)抑制作用。該誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)能夠使基因表達(dá)水平上調(diào)最高達(dá)到800倍,且具有較好的嚴(yán)謹(jǐn)性,可以用于梭菌屬或其它微生物細(xì)胞中目標(biāo)基因的可控表達(dá),以及用于現(xiàn)有遺傳改造技術(shù)的優(yōu)化及新工具的開(kāi)發(fā)。
[0009]本發(fā)明涉及:
(1)一種L-阿拉伯糖誘導(dǎo)的啟動(dòng)子DNA,具有序列表中SEQ ID NO:2所示的序列。
[0010](2)DNA還包括具有SEQ ID NO:2所示的序列的DNA的功能等價(jià)體,即具有SEQIDN0:2的變異序列的DNA,其仍舊能夠指導(dǎo)連接在其下游的核酸在阿拉伯糖誘導(dǎo)條件下表達(dá)。變異序列包括在嚴(yán)格條件下能夠與具有SEQ ID NO:2所示的序列DNA雜交的DNA序列。本文中使用的“嚴(yán)格條件”是公知的,包括諸如在含400mM NaCl、40mM PIPES(pH6.4)和ImM EDTA的雜交液中于60V雜交12-16小時(shí),然后在65°C下用含0.1SDS、和0.1%SSC的洗滌液洗滌15-60分鐘。
[0011](3)變異序列還包括與SEQ ID NO:2所示序列有至少90%、95%、96%、97%、98%、或99%序列同一性的DNA序列。其中,序列同一性的百分比可以通過(guò)公知的生物信息學(xué)算法來(lái)獲得,包括 Myers 和 Miller 算法(B1informatics,4(1):11-17,1988)、Needleman-Wunsch 全局比對(duì)法(J.Mol.B1l., 48 (3):443-53,1970)、Smith-Waterman 局部比對(duì)法(J.Mol.B1l.,147:195-197,1981)、Pearson 和 Lipman 相似性搜索法(PNAS,85(8):2444-2448,1988)、Karlin 和 Altschul 的算法(Altschul 等,J.Mol.B1l.,215(3):403-410,1990 ;PNAS, 90:5873-5877,1993)。這對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是熟悉的。
[0012](4)誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的組成:該誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)包含誘導(dǎo)劑L-阿拉伯糖、反饋抑制蛋白AraR (SEQ ID NO: 1)和可與反饋抑制蛋白結(jié)合的啟動(dòng)子Para(SEQ ID NO: 2)。
[0013](5)誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建:構(gòu)建該誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)需要通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得反饋抑制蛋白AraR的結(jié)構(gòu)基因及其啟動(dòng)子區(qū)PaMR (SEQ ID NO: 3)和終止子區(qū)TaraR (SEQ ID NO: 4),通過(guò)PCR獲得具有反饋抑制蛋白結(jié)合位點(diǎn)的啟動(dòng)子Para;通過(guò)基因克隆的方法將上述元件整合到一個(gè)具有抗性基因的質(zhì)粒骨架上,并在具有反饋抑制蛋白結(jié)合位點(diǎn)的啟動(dòng)子區(qū)下游設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn),用于目標(biāo)基因的克隆;將具有誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到微生物細(xì)胞中,通過(guò)質(zhì)粒復(fù)制或者同源重組基因組整合的形式實(shí)現(xiàn)誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)在微生物細(xì)胞中發(fā)揮功能,調(diào)控Para下游的目標(biāo)基因的表達(dá)。
[0014](6)該誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)可以廣泛適用于革蘭氏陽(yáng)性及陰性微生物,尤其適用于梭菌屬(clostridia)微生物,包括解纖維梭菌(Clostridium cellulolyticum)、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、熱纖梭菌(Clostridium thermocellum)、幾堆梭菌(Clostridium stercorarium)。
[0015](7)誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)特征分析:利用綠色熒光蛋白作為報(bào)告基因分析該誘導(dǎo)系統(tǒng)的可用性,當(dāng)有誘導(dǎo)劑存在時(shí)檢測(cè)到綠色熒光,無(wú)誘導(dǎo)劑存在時(shí)無(wú)綠色熒光;利用葡萄糖醛酸酶作為報(bào)告基因分析該誘導(dǎo)系統(tǒng)的工作效率和嚴(yán)謹(jǐn)性,有誘導(dǎo)劑存在時(shí)葡萄糖醛酸酶酶活提高倍數(shù)越多,效率越高。
[0016](8)誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的應(yīng)用:本發(fā)明中涉及的誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)可以應(yīng)用于微生物細(xì)胞中目標(biāo)基因的可控表達(dá),構(gòu)建微生物的反向基因篩選系統(tǒng),以及降低基于二類內(nèi)含子的基因靶向操作技術(shù)的脫靶率,具體步驟參見(jiàn)相應(yīng)的實(shí)施例。
[0017]本發(fā)明的有益效果:
該誘導(dǎo)系統(tǒng)可以有效的調(diào)節(jié)目標(biāo)基因的表達(dá),在阿拉伯糖誘導(dǎo)劑存在的條件下,基因的表達(dá)量最大可提高800倍。利用該系統(tǒng),可以構(gòu)建一個(gè)靈敏的反向基因篩選系統(tǒng)(與mazF.pyrF等毒性基因配合),證明該系統(tǒng)誘導(dǎo)表達(dá)的嚴(yán)謹(jǐn)性。利用該系統(tǒng)對(duì)已知的二類內(nèi)含子工具進(jìn)行改進(jìn),可將脫靶頻率從大于50%降低到0,實(shí)現(xiàn)了目的基因的精確靶向操作。
【附圖說(shuō)明】
[0018]圖1為本發(fā)明誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)及相關(guān)質(zhì)粒圖譜。
[0019]圖2為厭氧熒光蛋白PpFbFPm誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果。利用胞內(nèi)熒光成像檢測(cè)解纖維梭菌H10的pPTK-PpFbFPm(A)或pARA-PpFbFPm(B)轉(zhuǎn)化子中厭氧熒光蛋白PpFbFPm的表達(dá)。1,3,細(xì)胞形態(tài);2,4相關(guān)的熒光成像;1,2未誘導(dǎo)細(xì)胞;3,4誘導(dǎo)細(xì)胞
[0020]圖3為葡萄糖醛酸酶誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果。A.通過(guò)
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