專利名稱：在輕度低溫下能促進(jìn)基因表達(dá)的序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在輕度低溫下促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄或翻譯的輕度低溫應(yīng)答元件。
背景技術(shù)：
利用生物技術(shù)已經(jīng)生產(chǎn)出許多種藥物和分析用試劑，例如單克隆抗體、生長(zhǎng)因子 和凝血因子。一般來說，在10_15°C的低溫下，促進(jìn)了異源重組蛋白正確折疊并抑制了蛋白酶 P華角軍蛋白(Baneyx, F. , In vitro folding of recombinantproteins in Escherichia coli.In Manual of industrial microbiology andbiotechnology,第 2 版，(Demain, A. L. Davis, J. E.，Altas, R. M.，等,編輯)ASM Press, ffashingtonn D. C.，pp. 551-1999)。 因此，當(dāng)利用細(xì)菌生產(chǎn)重組蛋白時(shí)，在低于20°C的低溫而非37°C下進(jìn)行培養(yǎng)。在該情況 下，由于在低溫下蛋白合成通常減少，可能出現(xiàn)期望蛋白產(chǎn)量降低。通過在期望蛋白的表 達(dá)載體中使用冷激蛋白CspA基因啟動(dòng)子和CspA mRNA的5、非翻譯區(qū)(UTR)解決了該難 題(Baneyx, F.禾口 Mujacic, M. , Cold-inducible promoters for heterologous protein expression, Methods in Molecular Biology,205,1-18,2001)。但是，細(xì)菌與哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的翻譯后修飾明顯不同。特別是對(duì)于藥物而言，糖 基化狀態(tài)對(duì)治療效果是很重要的。因此，哺乳動(dòng)物細(xì)胞，特別是中國(guó)倉鼠細(xì)胞系，被用于 制備蛋白質(zhì)藥物。為降低細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)成本，必須要增加蛋白產(chǎn)量。通常在37°C下進(jìn)行 培養(yǎng)，但是其缺點(diǎn)在于，因?yàn)榧?xì)胞在快速生長(zhǎng)后死亡，則細(xì)胞存活并產(chǎn)生期望蛋白所持續(xù) 的時(shí)間就短。因此，通過添加細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑、表達(dá)細(xì)胞周期抑制基因P27、在輕度低溫 (30-32°C )下培養(yǎng)等以實(shí)現(xiàn)抑制細(xì)胞生長(zhǎng)并使細(xì)胞存活更長(zhǎng)時(shí)間的嘗試(參見Schatz SM 等，Biotechnol. Bioeng, 2003，Nov. 433—438)。其中，在輕度低溫下培養(yǎng)具有如下特征1)較在37°C下培養(yǎng)，細(xì)胞存活及產(chǎn)生重組蛋白的時(shí)間更長(zhǎng)；2)蛋白水解酶活性降低以減少期望蛋白降解；3)糖基化和同工蛋白質(zhì)譜(isoprotein pattern)類似于在37°C下培養(yǎng)的那些， 且唾液酸化較在37°C下培養(yǎng)的更好；4)可能改善如細(xì)菌中的期望蛋白的正確折疊(Kaufmann H，MazurX，Marone R， Bailey JE, Fussengger M.，Biotech Bioeng.，2001-3—20，72(6) :592_602 ；Yoon SK, Song JY, Lee GM.，Biotech Bioeng.，2003-5—5，82(3) :289_98)。就重要的重組蛋白產(chǎn)量而論，由于細(xì)胞存活時(shí)間延長(zhǎng)，總產(chǎn)量通常增加。但是，每 單位時(shí)間每細(xì)胞蛋白的單位生產(chǎn)率由于未知的原因而改變，可能取決于細(xì)胞類型、期望蛋 白類型等等。許多情況下單位生產(chǎn)率較在37°C下更低，難以解決(Kaufmann H, Mazur X，Marone R, Bailey JE, Fussenegger M.，Biotech Bioeng. ,2001Mar. 20,72(6) :592_602 ； Yoon SK, Song JY, Lee GM. , Biotech Bioeng. , 2003May. 5,82(3) :289_98)。因?yàn)榛虮磉_(dá) 調(diào)控機(jī)制不同于細(xì)菌，所以細(xì)菌的冷激蛋白CspA啟動(dòng)子和CspA mRNA的5、非翻譯區(qū)(UTR) 不能用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞。本發(fā)明的目的是提供一種在低溫下增加每單位時(shí)間每細(xì)胞的蛋白生產(chǎn)和總產(chǎn)量 的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本申請(qǐng)發(fā)明人之前發(fā)現(xiàn)并報(bào)道了冷激蛋白Cirp (冷誘導(dǎo)的RNA結(jié)合蛋白質(zhì))，其 基因組DNA序列如SEQ ID No 1所示，以及Rbm3 (RNA結(jié)合基序蛋白3) (Fujita J.，Cold shock response in mammalian cells, J. Mol Microbiol. Biotechnol. ,1999 年 11 月， 1(2) 243-55)?，F(xiàn)在，本發(fā)明是在這些蛋白基因啟動(dòng)子的5、端發(fā)現(xiàn)能促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的基因表達(dá)調(diào)控 序列的基礎(chǔ)上做出的。也就是說，本發(fā)明涉及一種輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，包含核苷酸序列XiCcccXgX^g其中，X:是t，g或a ;X6是g，a或c ;X7是c，a，或t ；以及X8是c，a和t，或與該序 列互補(bǔ)的核苷酸序列。在此術(shù)語“輕度低溫”指15_36°C的溫度，優(yōu)選30_34°C的溫度以及最優(yōu)選32°C的 溫度。術(shù)語“輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件”指在輕度低溫下能特異性促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄的核苷酸序 列。本發(fā)明的輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件在基因轉(zhuǎn)錄中起輕度低溫特異性增強(qiáng)子的作用。本發(fā)明的輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件在單獨(dú)使用時(shí)能起作用。但是，優(yōu)選使用連接的 2-50個(gè)，優(yōu)選2-10個(gè)相同或不同的元件。當(dāng)元件連接使用時(shí)，相同或不同的元件可直接連 接，或通過任何數(shù)量和類型的核苷酸連接。在本說明書中連接的輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件稱 為“輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控增強(qiáng)子”。本發(fā)明的輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件和輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控增強(qiáng) 子并不涉及與啟動(dòng)子的距離。本發(fā)明涉及一種包含上述輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件或輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控增強(qiáng)子的 載體。本發(fā)明涉及上述載體所轉(zhuǎn)化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。本發(fā)明涉及一種篩選輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的方法，包括1)提供在輕度低溫下，特別優(yōu)選在32°C的培養(yǎng)溫度下，能促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的基因；2)克隆基因的一部分，從該基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)5’的1. 5kb到第一外顯子3、末端；3)將所克隆的核苷酸序列和合適的啟動(dòng)子插入表達(dá)報(bào)道基因的載體中；4)用所述載體轉(zhuǎn)化哺乳動(dòng)物細(xì)胞；5)在輕度低溫或37°C下培養(yǎng)細(xì)胞以表達(dá)報(bào)道基因，來鑒定能在輕度低溫下促進(jìn) 報(bào)道基因轉(zhuǎn)錄的核苷酸序列；和6)對(duì)于能促進(jìn)報(bào)道基因轉(zhuǎn)錄的核苷酸序列，截短要被插入載體的核苷酸序列，以 鑒定對(duì)于在輕度低溫下促進(jìn)報(bào)道基因轉(zhuǎn)錄必需的核苷酸序列。本發(fā)明涉及一種改良輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的方法，包括
1)合成突變的核苷酸序列，其中用其他核苷酸取代輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件中的一 個(gè)或兩個(gè)核苷酸；2)將突變的核苷酸序列與合適的啟動(dòng)子整合入表達(dá)報(bào)道基因的載體中；3)用所述載體轉(zhuǎn)化哺乳動(dòng)物細(xì)胞；4)在輕度低溫或37°C下培養(yǎng)細(xì)胞以表達(dá)報(bào)道基因，來鑒定在輕度低溫下能促進(jìn) 報(bào)道基因轉(zhuǎn)錄的核苷酸序列。發(fā)明人在Cirp基因mRNA的非翻譯區(qū)(UTR)中還發(fā)現(xiàn)了能在輕度低溫下促進(jìn) 翻譯的基因表達(dá)調(diào)控序列。更確切地說，本發(fā)明涉及一種輕度低溫翻譯調(diào)控元件，包含核苷酸序列actcg cgcct tagga agctt gggtg tgtgt ggcgc gctgt cttcc cgctcgcgtc aggga cctgc ccgac tcagc ggctg cc (SEQ ID NO :23)，置于編碼序列的5、端和啟動(dòng)子的3、端。在此術(shù)語“輕度低溫翻譯調(diào)控元件”指在輕度低溫下特異性促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的mRNA翻譯 的元件。當(dāng)輕度低溫翻譯調(diào)控元件轉(zhuǎn)錄時(shí)，其形成mRNA的5、非翻譯區(qū)(UTR)。在此術(shù)語“輕度低溫應(yīng)答元件”指的是輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件和/或輕度低溫翻 譯調(diào)控元件。發(fā)明效果本發(fā)明在輕度低溫下可促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄和翻譯。


圖1是pCAT3基礎(chǔ)載體示意圖。MCS是多克隆位點(diǎn)。CAT是氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶的 編碼序列。PA是來自SV40病毒的多腺苷酸化信號(hào)。Amp1^是氨芐青霉素抗性基因。圖2是pCAT3啟動(dòng)子載體示意圖。MCS是多克隆位點(diǎn)。SV40啟動(dòng)子是來自SV40 病毒的啟動(dòng)子。CAT是氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶的編碼序列。PA是來自SV40病毒的多腺苷酸化 信號(hào)。Amf是氨芐青霉素抗性基因。圖3是pcDNA 3. 1⑴載體(Invitrogen)示意圖。MCS是多克隆位點(diǎn)。熒火蟲熒 光素酶編碼序列被插入到多克隆位點(diǎn)的EcoRV和Xbal之間。Cirp mRNA的5、非翻譯區(qū) (UTR)的互補(bǔ)DNA(cDNA)被插入到多克隆位點(diǎn)的Kpnl和BamHI之間。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的例子包括，但不限于，tcccc gcc (SEQ ID NO: 2)，gcccc gcc (SEQ ID NO 9),acccc gcc (SEQ IDN0 10),tcccc gtc(SEQ ID NO 11),tcccc get(SEQ ID NO: 12)，tcccc gaa(SEQ ID NO :21)，ggegg gga(SEQ ID NO :22)，和 ggggg gga(SEQ ID NO 7)(i)制備輕度低溫應(yīng)答元件可制備本發(fā)明的輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件、輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控增強(qiáng)子和輕度 低溫翻譯調(diào)控元件，例如，通過氨基磷酸鹽(phosphoroamidide)法的固相合成法或 膦酸氫鹽法的固相合成法，使用四種帶有保護(hù)基團(tuán)的脫氧核糖核苷酸(參見，例如， OligonucleotideSynthesis :A practical Approach, IRL Press,35-81,83-115 (1984)； J. Org. Chem. ,49,2139(1984) ；Tetrahedron Lett.，27，469(1986) ；TetrahedronLett. ,22,1859-1862 ；Tetrahedron Lett.，21，719—722 J.Am. Chem. Soc.，103,3185—3191(1981)。) 現(xiàn)今可容易地用可商購的DNA合成儀(例如，Applied Biosystem制造的)合成它們。(ii)要使用的啟動(dòng)子原核啟動(dòng)子、真核啟動(dòng)子和病毒啟動(dòng)子可用作為啟動(dòng)子。優(yōu)選哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子和 病毒啟動(dòng)子。優(yōu)選的啟動(dòng)子的例子包括小鼠胸腺嘧啶脫氧核苷激酶(TK)啟動(dòng)子，巨細(xì)胞病 毒(CMV)啟動(dòng)子和SV40啟動(dòng)子。(iii)編碼序列要表達(dá)的基因沒有限制，編碼任何蛋白的核苷酸序列都可使用。(iv)要使用的載體將本發(fā)明的輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件或輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控增強(qiáng)子，啟動(dòng)子和編碼所 要表達(dá)的蛋白的編碼序列連接在一起并插入載體中?？梢允褂迷思?xì)胞和真核細(xì)胞表達(dá)載 體。優(yōu)選的載體的例子包括，但不限于，pCMV(Invitrogen)、pCAT3啟動(dòng)子載體(Promega) 和pSV2-neo載體。(v)要使用的宿主細(xì)胞用載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞。優(yōu)選使用哺乳動(dòng)物細(xì)胞作為宿主細(xì)胞。優(yōu)選的哺乳動(dòng)物細(xì) 胞的例子是人細(xì)胞系，例如293，293T，U-20S，Huh-7, Hela細(xì)胞；猴細(xì)胞系，例如C0S-7和 Vero細(xì)胞；小鼠細(xì)胞系，例如NIH/3T3, Balb/3T3, B_6，Hepal-6和中國(guó)倉鼠細(xì)胞系，例如 CH0。轉(zhuǎn)染的方法包括磷酸鈣法，脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法和電穿孔法。例如，在磷酸鈣法中，將含有 DNA (載體)的氯化鈣溶液逐滴加到攪拌的磷酸溶液中。形成含有DNA-磷酸鈣的精制沉淀 物。當(dāng)該溶液添加到宿主細(xì)胞時(shí)，DNA-磷酸鈣沉淀物通過吞噬作用進(jìn)入宿主細(xì)胞使得DNA 轉(zhuǎn)染入細(xì)胞。(vi)培養(yǎng)條件宿主細(xì)胞在輕度低溫下培養(yǎng)。無需使用專用培養(yǎng)基作為培養(yǎng)基?？墒褂貌溉閯?dòng)物 細(xì)胞培養(yǎng)的常用培養(yǎng)基。培養(yǎng)基的代表例子是補(bǔ)充有10%胎牛血清(FCS) (Invitrogen)的 Dulbecco 改良的 Eagle 培養(yǎng)基(D-MEM)。本發(fā)明涉及一種篩選輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的方法，包括1)提供在輕度低溫下，特別是優(yōu)選在32°C的培養(yǎng)溫度下，能促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的基因；2)克隆基因的一部分，從距該基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)5’的1. 5kb到第一外顯子3、末 端；3)將所克隆的核苷酸序列和合適的啟動(dòng)子插入表達(dá)報(bào)道基因的載體中；4)用所述載體轉(zhuǎn)化哺乳動(dòng)物細(xì)胞；5)在輕度低溫或37°C下培養(yǎng)細(xì)胞以表達(dá)報(bào)道基因，來鑒定能在輕度低溫下促進(jìn) 報(bào)道基因轉(zhuǎn)錄的核苷酸序列；和6)對(duì)于能促進(jìn)報(bào)道基因轉(zhuǎn)錄的核苷酸序列，截短要被插入載體的核苷酸序列以鑒 定對(duì)于在輕度低溫下促進(jìn)報(bào)道基因轉(zhuǎn)錄必需的核苷酸序列。通過在37 °C和輕度低溫下，優(yōu)選在32°C下，培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞并應(yīng)用DNA芯片 (微陣列)或cDNA扣除法(參見，例如，Moody，D. E.，Genomic techniques :An overview of methods for study of geneexpression, J. Anim. Sci. ,79(E. Suppl.) :E128_E135. 2001)于從其中抽提的RNA，可獲得在輕度低溫下能促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的基因。原核啟動(dòng)子、真核啟動(dòng)子和病毒啟動(dòng)子可用作為啟動(dòng)子。優(yōu)選哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子和 病毒啟動(dòng)子。優(yōu)選的啟動(dòng)子的例子包括，但不限于，小鼠胸腺嘧啶脫氧核苷激酶(TK)啟動(dòng) 子，巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子和SV40啟動(dòng)子。報(bào)道基因是編碼能容易地被檢測(cè)的蛋白的基因，包括但不限于，熒光素酶基因和 氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因?？墒褂迷思?xì)胞和真核細(xì)胞載體。優(yōu)選的載體的例子包括，但不 限于，pCMV(Invitrogen)，pCAT3 啟動(dòng)子載體(Promega)和 pSV2_neo 載體。用載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞。優(yōu)選使用哺乳動(dòng)物細(xì)胞作為宿主細(xì)胞。優(yōu)選的哺乳動(dòng)物細(xì) 胞的例子是人細(xì)胞系，例如293，293T，U-20S，Huh-7, Hela細(xì)胞；猴細(xì)胞系，例如C0S-7和 Vero細(xì)胞；小鼠細(xì)胞系，例如NIH/3T3, Balb/3T3, B_6，Hepal-6和中國(guó)倉鼠細(xì)胞系，例如 CH0。轉(zhuǎn)染的方法包括磷酸鈣法，脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法和電穿孔法。例如，在磷酸鈣法中，將含有 DNA (載體)的氯化鈣溶液逐滴加到攪拌的磷酸溶液中。形成含有DNA-磷酸鈣的精制沉淀 物。當(dāng)該溶液添加到宿主細(xì)胞時(shí)，DNA-磷酸鈣沉淀物通過吞噬作用進(jìn)入宿主細(xì)胞使得DNA 轉(zhuǎn)染入細(xì)胞。無需使用專用培養(yǎng)基作為培養(yǎng)基?？墒褂貌溉閯?dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的常用培養(yǎng)基。培養(yǎng) 基的代表例子是補(bǔ)充有10%胎牛血清(FCS) (Invitrogen)的Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng) 基(D-MEM)。如果報(bào)道基因產(chǎn)物在輕度低溫下，優(yōu)選在32°C下的表達(dá)量，與37°C下的表達(dá)量的 比率大于1，則核苷酸序列可以是在輕度低溫下能特異性促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄的增強(qiáng)子。截短在輕 度低溫下能促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄的核苷酸序列以獲得本發(fā)明的輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件?？赏ㄟ^確 認(rèn)與該輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件互補(bǔ)的核苷酸序列在輕度低溫下也可促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄來確認(rèn) 它是增強(qiáng)子。本發(fā)明涉及一種改良輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的方法，包括1)合成突變的核苷酸序列，其中用其他核苷酸取代輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件中的一 個(gè)或兩個(gè)核苷酸；2)將突變的核苷酸序列與合適的啟動(dòng)子整合入表達(dá)報(bào)道基因的載體中；3)用所述載體轉(zhuǎn)化哺乳動(dòng)物細(xì)胞；4)在輕度低溫或37°C下培養(yǎng)細(xì)胞以表達(dá)報(bào)道基因，來鑒定在輕度低溫下能促進(jìn) 報(bào)道基因轉(zhuǎn)錄的核苷酸序列。輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件中的一個(gè)或兩個(gè)核苷酸為其他核苷酸所取代的突變的核 苷酸可通過上述方法合成。原核啟動(dòng)子、真核啟動(dòng)子和病毒啟動(dòng)子可用作為啟動(dòng)子。優(yōu)選哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子和 病毒啟動(dòng)子。優(yōu)選的啟動(dòng)子的例子包括，但不限于，小鼠胸腺嘧啶脫氧核苷激酶(TK)啟動(dòng) 子，巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子和SV40啟動(dòng)子。報(bào)道基因是編碼能容易地被檢測(cè)的蛋白的基因，包括熒光素酶基因和氯霉素乙 酰轉(zhuǎn)移酶基因?？墒褂迷思?xì)胞和真核細(xì)胞載體。優(yōu)選的載體的例子包括，但不限于， pCMV(Invitrogen)，pCAT3 啟動(dòng)子載體(Promega)和 pSV2_neo 載體。用載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞。優(yōu)選使用哺乳動(dòng)物細(xì)胞作為宿主細(xì)胞。優(yōu)選的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的例子是人細(xì)胞系，例如293，293T，U-20S，Huh-7, Hela細(xì)胞；猴細(xì)胞系，例如C0S-7和 Vero細(xì)胞；小鼠細(xì)胞系，例如NIH/3T3, Balb/3T3, B_6，Hepal-6和中國(guó)倉鼠細(xì)胞系，例如 CH0。轉(zhuǎn)染的方法包括磷酸鈣法，脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法和電穿孔法。例如，在磷酸鈣法中，將含有 DNA (載體)的氯化鈣溶液逐滴加到攪拌的磷酸溶液中。形成含有DNA-磷酸鈣的精制沉淀 物。當(dāng)該溶液添加到宿主細(xì)胞時(shí)，DNA-磷酸鈣沉淀物通過吞噬作用進(jìn)入宿主細(xì)胞使得DNA 轉(zhuǎn)染入細(xì)胞。無需使用專用培養(yǎng)基作為培養(yǎng)基?？墒褂貌溉閯?dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的常用培養(yǎng)基。培 養(yǎng)基的代表例子是補(bǔ)充有10%胎牛血清(FCS)的Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(D-MEM) (Invitrogen)。如果報(bào)道基因產(chǎn)物在輕度低溫下，優(yōu)選在32°C下的表達(dá)量，與37°C下的表達(dá)量的 比率大于1，則該核苷酸序列可以是在輕度低溫下能特異性促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄的增強(qiáng)子。可通過 確認(rèn)與該輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件互補(bǔ)的核苷酸序列在輕度低溫下也可促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄來確 認(rèn)它是增強(qiáng)子。本發(fā)明也涉及一種輕度低溫翻譯調(diào)控元件，包含核苷酸序列aCtCgCgCCt taggaagctt gggtgtgtgt ggcgcgctgt cttcccgctcgcgtcaggga cctgcccgac tcagcggctg cc (SEQ ID NO :23)，置于編碼序列的5、端和啟動(dòng)子的3、端。原核啟動(dòng)子，真核啟動(dòng)子和病毒啟動(dòng)子可用作為啟動(dòng)子。優(yōu)選哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子和 病毒啟動(dòng)子。優(yōu)選的啟動(dòng)子的例子包括小鼠胸腺嘧啶脫氧核苷激酶(TK)啟動(dòng)子，巨細(xì)胞病 毒(CMV)啟動(dòng)子和SV40啟動(dòng)子。本發(fā)明的輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件或輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控增 強(qiáng)子，以及啟動(dòng)子可與本發(fā)明的輕度低溫翻譯調(diào)控元件一起使用?？墒褂迷思?xì)胞和真核細(xì)胞載體。優(yōu)選的載體的例子包括，但不限于， pCMV(Invitrogen)，pCAT3 啟動(dòng)子載體(Promega)和 pSV2_neo 載體。用載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞。優(yōu)選使用哺乳動(dòng)物細(xì)胞作為宿主細(xì)胞。優(yōu)選的哺乳動(dòng)物細(xì) 胞的例子是人細(xì)胞系，例如293，293T，U-20S，Huh-7, Hela細(xì)胞；猴細(xì)胞系，例如C0S-7和 Vero細(xì)胞；小鼠細(xì)胞系，例如NIH/3T3, Balb/3T3, B_6，Hepal-6和中國(guó)倉鼠細(xì)胞系，例如 CH0。轉(zhuǎn)染的方法包括磷酸鈣法，脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法和電穿孔法。例如，在磷酸鈣法中，將含有 DNA (載體)的氯化鈣溶液逐滴加到攪拌的磷酸溶液中。形成含有DNA-磷酸鈣的精制沉淀 物。當(dāng)該溶液添加到宿主細(xì)胞時(shí)，DNA-磷酸鈣沉淀物通過吞噬作用進(jìn)入宿主細(xì)胞使得DNA 轉(zhuǎn)染入細(xì)胞。無需使用專用培養(yǎng)基作為培養(yǎng)基?？墒褂貌溉閯?dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的常用培養(yǎng)基。培 養(yǎng)基的代表例子是補(bǔ)充有10%胎牛血清(FCS)的Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(D-MEM) (Invitrogen)。實(shí)施例實(shí)施例1假定Cirp基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的“actcgc... ”的“a”為+1，跨越了核苷酸-970 (轉(zhuǎn) 錄起始位點(diǎn)5’的970個(gè)核苷酸)至+56(在第一外顯子內(nèi))的Cirp基因，及其5、端缺失 的片段(見表1)被插入PCAT3-基礎(chǔ)載體(Promega)的多克隆位點(diǎn)中。該載體帶有氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)基因作為報(bào)道基因。接著將2. 5-5. 0 u g/35-mm培養(yǎng)皿的質(zhì)粒與0. 5-1. 0 u g/35-mm培養(yǎng)皿的 CDM8-LacZ (其為0 -半乳糖苷酶表達(dá)載體并用于校正轉(zhuǎn)染效率)共轉(zhuǎn)染入人細(xì)胞系293。將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞分成兩組。一組在32°C下培養(yǎng)，另外一組在37°C下培養(yǎng)。培養(yǎng)基是 補(bǔ)充有10% FCS的D-MEM。36小時(shí)后，離心回收細(xì)胞并制備全細(xì)胞裂解物。使用CAT ELISA試劑盒(Roche Diagnostic)測(cè)定每一溫度下所產(chǎn)生的氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)蛋白的量，使用半乳糖 苷酶分析試劑盒(Stratagene)測(cè)定半乳糖苷酶活性。每一片段的轉(zhuǎn)錄促進(jìn)活性如表 1所示。將CAT蛋白質(zhì)量除以半乳糖苷酶活性計(jì)算轉(zhuǎn)錄促進(jìn)活性。表1Cirp基因組5、端片段的轉(zhuǎn)錄促進(jìn)活性 轉(zhuǎn)染后24小時(shí)的數(shù)據(jù)類似于該結(jié)果。從這些數(shù)據(jù)中，可以看到基因轉(zhuǎn)錄的基礎(chǔ)啟動(dòng)子可能存在于基因組基因的-220 到0，響應(yīng)于32°C促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的增強(qiáng)子可能存在于-340到-220。實(shí)施例2除使用人細(xì)胞系293T，U-20S或Huh-7，猴細(xì)胞系C0S-7或小鼠細(xì)胞系NIH/3T3， Balb/3T3,B-6或Ifepal-6代替人細(xì)胞系293作為宿主細(xì)胞外，重復(fù)實(shí)施例1，獲得類似的結(jié)果.實(shí)施例3制備多種來自Cirp基因-340到-240核苷酸的缺失突變體并插入到pCAT3啟動(dòng) 子載體(Promega)的多克隆位點(diǎn)中(圖2)。該載體帶有SV40啟動(dòng)子。如實(shí)施例1所述，在 用磷酸鈣法使用人293細(xì)胞轉(zhuǎn)染DNA的基因轉(zhuǎn)移后，在32°C下測(cè)定轉(zhuǎn)錄促進(jìn)活性。不含有 插入片段的PCAT 3啟動(dòng)子載體作為陰性對(duì)照(模擬物)。所示的是轉(zhuǎn)染后36個(gè)小時(shí)的數(shù)據(jù)。將CAT蛋白質(zhì)量除以半乳糖苷酶活性計(jì) 算轉(zhuǎn)錄促進(jìn)活性(表2)。MJlCirp基因組5、端片段的轉(zhuǎn)錄促進(jìn)活性 從這些結(jié)果中可以看到在2個(gè)基因組片段-310到-290和-260到-220中存在增 強(qiáng)子，其在32°C應(yīng)答中促進(jìn)轉(zhuǎn)錄。比較了這兩個(gè)片段中的核苷酸序列，發(fā)現(xiàn)tcccc gcc(SEQ ID NO 2)的共有序列。實(shí)施例4將含有上述發(fā)現(xiàn)的tcccc gcc的10個(gè)核苷酸的三個(gè)分子串聯(lián)形成序列ttccc cgccg ttccc cgccg ttccc cgccg(SEQ ID NO :3)。如實(shí)施例 3 所述，將該序列插入pCAT3 啟 動(dòng)子載體的多克隆位點(diǎn)中。作為陰性對(duì)照，使用不含有插入片段的PCAT 3啟動(dòng)子載體(模 擬物)。作為陽性對(duì)照，使用含有Cirp基因組的-340到-220位作為增強(qiáng)子的pCAT3啟動(dòng) 子載體和含有SV40增強(qiáng)子的pCAT3啟動(dòng)子載體。轉(zhuǎn)染入293細(xì)胞后24小時(shí)獲得的結(jié)果示 于表3中。表3 實(shí)施例5如果一個(gè)序列是增強(qiáng)子，則反向序列也應(yīng)當(dāng)是有效的。將含有cggcg gggaa(SEQ ID NO 4)的10個(gè)核苷酸的三個(gè)分子串聯(lián)形成序列cggcg gggaa cggcg gggaa cggcg gggaa(SEQ ID NO :5)，所述cggcggggaa序列是包含tcccc gcc的序列的反向序列。將該序 列插入到PCAT3啟動(dòng)子載體的多克隆位點(diǎn)中，進(jìn)行與實(shí)施例4類似的試驗(yàn)。在這種情況下，32°C /37°C的比是3. 83，證實(shí)了該序列為輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控增強(qiáng) 子。實(shí)施例6
通過將在小鼠Cirp基因組中發(fā)現(xiàn)的8個(gè)核苷酸t(yī)cccc gcc (SEQ IDN0 2)的兩個(gè) 分子串聯(lián)所獲得的序列tcccc gcctc cccgc c(SEQ IDNO 6)插入到pCAT3啟動(dòng)子載體的多 克隆位點(diǎn)中，進(jìn)行與實(shí)施例4類似的試驗(yàn)。在這種情況下，32°C /37°C的比是2. 51，證實(shí)了 該序列為輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控增強(qiáng)子。實(shí)施例7將發(fā)現(xiàn)位于人RBM基因組(GenBank NT_011568)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)5、端約260核苷 處的8個(gè)核苷酸ggggg gga(SEQ ID NO 7)的三個(gè)分子串聯(lián)形成序列g(shù)gggg ggagg ggggg agggg ggga(SEQ ID NO :8)。將該序列插入到pCAT3啟動(dòng)子載體的多克隆位點(diǎn)中，進(jìn)行與實(shí) 施例4類似的試驗(yàn)。在這種情況下，32°C /37°C的比是2. 52，證實(shí)了該序列為輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控增強(qiáng)子。實(shí)施例8將含有在上述發(fā)現(xiàn)的序列tcccc gcc (SEQ ID NO :2)中的一個(gè)或兩個(gè)堿基取代 (見下表)的10個(gè)核苷酸的3個(gè)分子串聯(lián)形成序列。將該序列插入到與實(shí)施例4相同的載 體中，并用該載體轉(zhuǎn)染293細(xì)胞。24小時(shí)后，測(cè)定CAT/LacZ，各突變體的輕度低溫轉(zhuǎn)錄促進(jìn) (增強(qiáng))活性示于下表中，當(dāng)使用不含有插入片段的PCAT3啟動(dòng)子載體時(shí)，規(guī)定32°C /37°C 的比為1。M4帶有一個(gè)堿基取代的突變體的低溫轉(zhuǎn)錄促進(jìn)(增強(qiáng))活性 魁帶有2個(gè)堿基取代的突變體的低溫轉(zhuǎn)錄促進(jìn)(增強(qiáng))活性 第一位堿基被G或A取代的，第七位堿基被T取代的，以及第八位堿基被T取代的 突變體與野生型序列相比具有類似的轉(zhuǎn)錄促進(jìn)活性。盡管與野生型序列相比，第六位堿基 被A或C取代降低了活性，但它們也顯示了明顯的活性。第七和第八位堿基被AA取代的突 變體78具有與野生型相同程度的轉(zhuǎn)錄促進(jìn)活性。因此，序列tcccc gcc是顯示轉(zhuǎn)錄促進(jìn)活性的序列，且序列t (或g或a)CCCCg(或 a或c) c (或a或t) c (或a或t)可具有轉(zhuǎn)錄促進(jìn)活性。因?yàn)樗鼈兪窃鰪?qiáng)子，所以與它們互補(bǔ)的序列，例如與tcccc gcc(SEQID NO 2)互補(bǔ) 的 ggcgg gga(SEQ ID NO 22)也可以使用。實(shí)施例9將從pGL3_基礎(chǔ)質(zhì)粒(Promega)上切除下的螢火蟲熒光素酶cDNA插入到帶有巨 細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子的pcDNA3. 1(+)載體(Invitrogen)的多克隆位點(diǎn)(EcoR和Xbal 之間)中。然后，將相應(yīng)于Cirp mRNA+1到+82核苷酸的cDNA片段(小鼠Cirp轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 (mRNA) "act…，，的"a，，假定為+1), actcgcgcct taggaagctt gggtgtgtgt ggcgcgctgt cttcccgctcgcgtcaggga cctgcccgac tcagcggctg cc (SEQ ID NO :23)插入到 pcDNA3. 1 (+) 載體(Invitrogen)的多克隆位點(diǎn)(Kpnl和BamHI之間)中。在Kpnl和BamHI之間無插入 片段的質(zhì)粒作為對(duì)照。接著將2. 5-5. 0 u g/35-mm培養(yǎng)皿的這些質(zhì)粒與0. 5-1. 0 y g/35-mm培養(yǎng)皿的 pRLTK質(zhì)粒(其為renila熒光素酶表達(dá)載體，用于修正每一轉(zhuǎn)染的效率)共轉(zhuǎn)染入已培養(yǎng) 一天的人細(xì)胞系293。將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞分成兩組。一組在32°C下培養(yǎng)，另外一組在37°C下培 養(yǎng)。培養(yǎng)基為補(bǔ)充有10% FCS的D-MEM。36小時(shí)后，離心回收細(xì)胞，制備全細(xì)胞裂解物。使用雙重?zé)晒馑孛笀?bào)告試劑盒 (Promega)測(cè)定螢火蟲和renila熒光素酶活性。每一片段的翻譯促進(jìn)活性示于表6中。將螢火蟲熒光素酶活性除以renila熒光素酶活性來計(jì)算翻譯促進(jìn)活性。戲Cirp mRNA的5、非翻譯區(qū)(UTR)的翻譯促進(jìn)活性 上述結(jié)果表明當(dāng)Cirp mRNA的5—UTR存在于載體中時(shí)，與不存在其的載體相比， 在32°C下所產(chǎn)生的蛋白的量增加到1. 7倍，該量與在37°C下用不含Cirp mRNA的5—UTR的 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞所產(chǎn)生的量相當(dāng)。
權(quán)利要求
一種輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，由選自以下的核苷酸序列組成gcccc gcc(SEQ ID NO9)，acccc gcc(SEQ ID NO10)，tcccc gtc(SEQ ID NO11)，tcccc gct(SEQ ID NO12)，tcccc gaa(SEQ ID NO21)，和tcccc ccc(SEQ ID NO14)，或與該核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列，其中所述輕度低溫是30-34℃的溫度。
2.一種輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控增強(qiáng)子，其中相同或不同的權(quán)利要求1的輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控 元件被連接。
3.一種輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控增強(qiáng)子，其中相同或不同的權(quán)利要求1的輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控 元件通過其他核苷酸被連接。
4.一種載體，包含權(quán)利要求1的輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件或權(quán)利要求2或3的輕度低溫 轉(zhuǎn)錄調(diào)控增強(qiáng)子。
5.一種用權(quán)利要求4的載體轉(zhuǎn)化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
6.一種篩選權(quán)利要求1所示的輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的方法，包括1)提供在輕度低溫下，能促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的基因；2)克隆從位于該基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)5、上游的1.5kb到該基因第一外顯子的范圍；3)將所克隆的核苷酸序列和合適的啟動(dòng)子插入表達(dá)氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)作為報(bào) 道基因的載體中；4)用所述載體轉(zhuǎn)化哺乳動(dòng)物細(xì)胞；5)在輕度低溫和37°C下分別培養(yǎng)細(xì)胞以表達(dá)報(bào)道基因，來獲得能在輕度低溫下促進(jìn) 報(bào)道基因轉(zhuǎn)錄的核苷酸序列；和6)截短要被整合入載體的該核苷酸序列以鑒定對(duì)于在輕度低溫下促進(jìn)報(bào)道基因轉(zhuǎn)錄 必需的核苷酸序列；其中所述輕度低溫是30-34°C的溫度。
7.權(quán)利要求6的方法，其中步驟1)中所述的輕度低溫為32°C的培養(yǎng)溫度。
8.一種改良權(quán)利要求1所示的輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的方法，包括1)合成突變的核苷酸序列，其中用其他核苷酸取代輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件中的一個(gè)或 兩個(gè)核苷酸；2)將突變的核苷酸序列與合適的啟動(dòng)子整合入表達(dá)氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)作為報(bào) 道基因的載體中；3)用所述載體轉(zhuǎn)化哺乳動(dòng)物細(xì)胞；4)在輕度低溫和37°C下分別培養(yǎng)細(xì)胞以表達(dá)報(bào)道基因，來鑒定在輕度低溫下促進(jìn)報(bào) 道基因轉(zhuǎn)錄所必需的核苷酸序列；其中所述輕度低溫是30-34°C的溫度。
9.一種在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中促進(jìn)靶基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯的方法，包括下述步驟用包含輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件或輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控增強(qiáng)子的載體轉(zhuǎn)化哺乳動(dòng)物細(xì)胞;和培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其中所述輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件由選自以下的核苷酸序列組成gcccc gcc(SEQ ID NO 9)，acccc gcc(SEQ ID NO 10)，tcccc gtc (SEQ ID NO :11)，tcccc get(SEQ ID NO 12)，tcccc gaa(SEQ ID NO :21)，和tcccc ccc(SEQ ID NO 14)，或與該核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列，其中所述輕度低溫是30-34°C的溫度，且其中相同或不同的所述輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件在所述輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控增強(qiáng)子中 直接或通過其他核苷酸被連接。
全文摘要
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種在使用哺乳動(dòng)物細(xì)胞的重組DNA方法中增加蛋白產(chǎn)量的方法。當(dāng)輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，其包含至少一個(gè)核苷酸序列X1ccccX6X7X8，其中，X1是t，g，或a；X6是g，a或c；X7是c，a，或t；以及X8是c，a和t，或與該核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列，用作為增強(qiáng)子及在輕度低溫下培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞時(shí)，促進(jìn)了期望蛋白的轉(zhuǎn)錄。當(dāng)將SEQ ID NO23的輕度低溫翻譯調(diào)控元件置于編碼序列的5`端和啟動(dòng)子的3`端及在輕度低溫下培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞時(shí)，促進(jìn)了期望蛋白的翻譯。
文檔編號(hào)C12N15/113GK101857864SQ201010170098
公開日2010年10月13日 申請(qǐng)日期2005年3月1日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月23日
發(fā)明者藤田潤(rùn) 申請(qǐng)人:藤田潤(rùn)