一種應(yīng)用小rna調(diào)節(jié)線粒體基因表達(dá)的方法及應(yīng)用
【專利說明】一種應(yīng)用小RNA調(diào)節(jié)線粒體基因表達(dá)的方法及應(yīng)用
[0001]
技術(shù)領(lǐng)域
[0002]本技術(shù)涉及分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)以及生物化學(xué)，具體涉及一種應(yīng)用小RNA調(diào)節(jié)線粒體基因表達(dá)的方法及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0003]真核生物的線粒體是一種半自主細(xì)胞器，它具有自己獨(dú)特的遺傳系統(tǒng)，即線粒體雙鏈閉合環(huán)狀DNA，以及DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)翻譯系統(tǒng)。關(guān)于線粒體基因的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯的研究已經(jīng)進(jìn)行了 35年之久，盡管領(lǐng)域內(nèi)已經(jīng)取得了一些進(jìn)展，但是對(duì)于線粒體的遺傳和基因表達(dá)的了解只是冰山一角。
[0004]另外，了解線粒體中特定基因的功能是相當(dāng)困難的，原因在于線粒體是具有雙層膜結(jié)構(gòu)的細(xì)胞器，線粒體的外膜和內(nèi)膜對(duì)細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞器內(nèi)的分子交換有很強(qiáng)的選擇性，領(lǐng)域內(nèi)現(xiàn)在的瓶頸是既不可能對(duì)線粒體基因進(jìn)行過表達(dá)，也不可能對(duì)某個(gè)特定的線粒體基因進(jìn)行基因敲除。目前對(duì)于線粒體基因組的研究主要集中于了解疾病導(dǎo)致的線粒體基因突變對(duì)線粒體遺傳的影響以及線粒體基因組的突變對(duì)于整個(gè)細(xì)胞活動(dòng)的影響。
[0005]盡管miRNA和SiRNA的應(yīng)用已經(jīng)非常廣泛，尤其是siRNA被用于基因沉默的應(yīng)用已經(jīng)長(zhǎng)達(dá)10年之久。miRNA和siRNA在線粒體中的功能從來沒有被報(bào)道過，因?yàn)榫€粒體是一種具有雙層膜的具有自身遺傳體系的細(xì)胞器，盡管有報(bào)道發(fā)現(xiàn)miRNA在線粒體中存在，但是領(lǐng)域內(nèi)普遍認(rèn)為miRNA不可能在線粒體中存在,更不可能在線粒體中調(diào)節(jié)線粒體基因的表達(dá)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，提供一種應(yīng)用小RNA調(diào)節(jié)線粒體基因表達(dá)的方法，通過該方法可以研究線粒體基因的功能及調(diào)控線粒體功能。
[0007]本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
小RNA轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)調(diào)節(jié)線粒體基因的表達(dá)。所述的小RNA包括siRNA或miRNA。
[0008]本發(fā)明針對(duì)小鼠線粒體NDl基因設(shè)計(jì)了 siRNA:
NDl siRNA:UUCCUAUGGAUCCGAGCAUCTT, GAUGCUCGGAUCCAUAGGAATT。
[0009]將NDl siRNA轉(zhuǎn)染到小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)中進(jìn)行培養(yǎng)，提取轉(zhuǎn)染siRNA的MEF的RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄定量PCR和免疫印跡反應(yīng)發(fā)現(xiàn)NDl siRNA能降低NDl mRNA的水平和蛋白水平。進(jìn)一步提取細(xì)胞的線粒體，裂解線粒體，通過膠內(nèi)活性反應(yīng)或光譜測(cè)定法分析線粒體裂解液對(duì)復(fù)合體活性進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)NDl siRNA能夠下調(diào)NDl所在的復(fù)合體I的活性。通過轉(zhuǎn)染siRNA可以調(diào)節(jié)特定線粒體基因的表達(dá)。
[0010]本發(fā)明還將miR-1 (UGGAAUGUAAAGAAGUAUGUAU)轉(zhuǎn)染到人子宮頸癌細(xì)胞(HeLa)中進(jìn)行培養(yǎng)，通過行免疫印跡反應(yīng)發(fā)現(xiàn)miR-1能夠增強(qiáng)NDl基因的表達(dá)。進(jìn)一步檢測(cè)細(xì)胞的ATP水平發(fā)現(xiàn)miR-1可以顯著上調(diào)細(xì)胞內(nèi)ATP的水平。表明miR-1不僅可以轉(zhuǎn)運(yùn)到線粒體中，而且可以增強(qiáng)線粒體中靶基因的表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)線粒體的功能。
[0011]上述結(jié)果說明應(yīng)用小RNA調(diào)節(jié)線粒體基因表達(dá)的方法可應(yīng)用于調(diào)控線粒體的功能中；也可應(yīng)用于研究線粒體特定基因的功能中，可以對(duì)線粒體基因更加深入的研究，甚至可以將該方法拓展到線粒體遺傳疾病的分子治療。
[0012]本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果:
(I)本發(fā)明發(fā)現(xiàn)SiRNA可以有效的降低線粒體中mRNA的豐度(在一些特定基因上沉默效果可以達(dá)到85%)，蛋白水平亦有所下降，但是因?yàn)榫€粒體自身編碼蛋白均處于電子傳遞鏈的復(fù)合體中，蛋白半衰期很長(zhǎng)，siRNA下調(diào)蛋白水平并不如mRNA的效果明顯。
[0013](2)同時(shí)發(fā)現(xiàn)miRNA可以在不改變線粒體中靶基因mRNA水平的情況下增強(qiáng)靶基因的表達(dá)翻譯水平，進(jìn)而上調(diào)線粒體的功能。本發(fā)明提供了一種調(diào)節(jié)線粒體特定基因的新方法，對(duì)線粒體基因更加深入的研究。
[0014]本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了小RNA對(duì)線粒體基因的調(diào)節(jié)作用，為研究線粒體基因功能提供了新的方向。
【附圖說明】
[0015]圖1是實(shí)施例1逆轉(zhuǎn)錄定量PCR結(jié)果圖，圖中縱坐標(biāo)ND1/18S是指NDl的mRNA水平相對(duì)于內(nèi)參基因18SrRNA的豐度；轉(zhuǎn)染NDl siRNA引起線粒體中NDl基因mRNA水平的下調(diào)。
[0016]圖2是實(shí)施例1免疫印跡反應(yīng)結(jié)果圖，圖中NC為對(duì)照RNA，siNDl為NDl siRNA ;轉(zhuǎn)染NDl siRNA引起NDl蛋白水平的下調(diào)。
[0017]圖3是實(shí)施例2中逆轉(zhuǎn)錄定量PCR結(jié)果圖，圖中縱坐標(biāo)ND1/GAPDH是指NDl的mRNA水平相對(duì)于內(nèi)參基因GAPDH mRNA的豐度；轉(zhuǎn)染miR-1并沒有引起線粒體中NDl基因mRNA水平的改變。
[0018]圖4是實(shí)施例2免疫印跡反應(yīng)結(jié)果圖，圖中Mock是空白對(duì)照，即沒有轉(zhuǎn)染任何核酸；HeLa細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-1之后，NDl的蛋白水平有明顯的上升。
[0019]圖5是實(shí)施例2檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的ATP水平結(jié)果圖；miR-l轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞之后，細(xì)胞內(nèi)ATP水平升高。
【具體實(shí)施方式】
[0020]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)的描述。應(yīng)理解，下面的實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本技術(shù)的范圍。
[0021]下述實(shí)施例中所有細(xì)胞培養(yǎng)之后的操作均應(yīng)在低溫下進(jìn)行，即盡量在冰上進(jìn)行。
[0022]實(shí)施例1
針對(duì)小鼠線粒體NDl基因設(shè)計(jì)siRNA。
[0023]NDl siRNA:UUCCUAUGGAUCCGAGCAUCTT，GAUGCUCGGAUCCAUAGGAATT。
[0024](I)培養(yǎng)IX 16小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF) (25平方厘米的生長(zhǎng)面積)，待其生長(zhǎng)到95%密度。
[0025](2)按照lipofectamin RNAimax (脂質(zhì)體)的說明書配制NDl siRNA和對(duì)照RNA(Ctl RNA)(上海吉瑪對(duì)照RNA)轉(zhuǎn)染混合物，混勻后靜置20分鐘。
[0026](3)用胰酶消化MEF細(xì)胞，按照30%的密度將消化的細(xì)胞鋪到24孔板，加入步驟(2)的轉(zhuǎn)染混合物。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞放置在37°C二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)。
[0027](4)用 PBS (pH 7.4)清洗細(xì)胞兩次,之后用 Trizol (Life Technologies)試劑處理細(xì)胞5分鐘，提取RNA，實(shí)施逆轉(zhuǎn)錄定量PCR。
[0028]逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為逆轉(zhuǎn)錄標(biāo)準(zhǔn)化流程，引物為隨機(jī)引物。
[0029]定量PCR為標(biāo)準(zhǔn)SyBr Green流程，PCR引物如下:
NDl F:TTACCAGAACTCTACTCAACT, NDl R:ATCGTAACGGAAGCGTGGATA ；
18SF:GTAACCCGTTGAACCCCATT,18S R:CCATCCAATCGGTAGTAGCG。
[0030]結(jié)果見圖1，轉(zhuǎn)染NDl siRNA的細(xì)胞跟轉(zhuǎn)染對(duì)照RNA的細(xì)胞相比，NDl siRNA顯著下降了 NDl mRNA的水平。
[0031](5)用PBS (pH 7.4)清洗細(xì)胞兩次，再用SDS-PAGE上樣緩沖液處理細(xì)胞5分鐘，收集細(xì)胞裂解液沸水煮15分鐘，之后對(duì)細(xì)胞裂解液進(jìn)行免疫印跡反應(yīng)分析。細(xì)胞裂解液用12%的SDS變形聚丙烯酰胺膠分離，將膠塊上的蛋白通過轉(zhuǎn)膜的方式轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，分別對(duì)轉(zhuǎn)印膜進(jìn)行目的蛋白NDl和內(nèi)參蛋白TUBB3的雜交。結(jié)果見圖2，跟對(duì)照RNA相比，NDlsiRNA的轉(zhuǎn)染降低了轉(zhuǎn)染細(xì)胞中線粒體蛋白NDl的蛋白水平，TUBB3作為內(nèi)參蛋白并沒有受到siRNA的影響。針對(duì)線粒體自身編碼基因設(shè)計(jì)的siRNA會(huì)下調(diào)線粒體中靶基因的蛋白水平。線粒體自身編碼的蛋白均處于線粒體中的蛋白復(fù)合體中，相對(duì)很穩(wěn)定，所以siRNA引起的蛋白水平較之mRNA水平的下降要小。
[0032](6)siRNA轉(zhuǎn)染之后的細(xì)胞，提取細(xì)胞中的線粒體之后，對(duì)線粒體進(jìn)行裂解，之后通過膠內(nèi)活性反應(yīng)或光譜測(cè)定法分析線粒體裂解液對(duì)復(fù)合體活性進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)NDl siRNA會(huì)下調(diào)NDl所在的復(fù)合體I的活性。
[0033]實(shí)施例2
miR-1 (UGGAAUGUAAAGAAGUAUGUAU)在人子宮頸癌細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染對(duì)線粒體基因的影響
(I)培養(yǎng)IX 16人子宮頸癌細(xì)胞(HeLa) (25平方厘米的生長(zhǎng)面積)，待其生長(zhǎng)到100%
山/又O
[0034](2)按照lipofectamin 2000 (脂質(zhì)體)的說明書配制miR-1 (miR-1的序列如上所示在takara公司合成并純化)或?qū)φ誖NA (Ctl RNA)轉(zhuǎn)染混合物，混勻后靜置20分鐘。
[0035](3)用胰酶消化HeLa細(xì)胞，按照30%的密度將消化的細(xì)胞鋪到24孔板，加入步驟
(2)的轉(zhuǎn)染混合物，轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞放置在37°C二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)。
[0036](4)用 PBS (pH 7.4)清洗細(xì)胞兩次，之后用 Trizol (Life Technologies)試劑處理細(xì)胞5分鐘，提取RNA，實(shí)施逆轉(zhuǎn)錄定量PCR。
[0037]逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為逆轉(zhuǎn)錄表轉(zhuǎn)標(biāo)準(zhǔn)化流程，引物為隨機(jī)引物。
[0038]定量PCR為標(biāo)準(zhǔn)SyBr Green流程，PCR引物如下:
NDl F:TTACCAGAACTCTACTCAACT, NDl R:ATCGTAACGGAAGCGTGGATA ；
GAPDH F: TTGCCATCAATGACCCCTTCA, GAPDH R:CGCCCCACTTGATTTTGGA。
[0039]結(jié)果見圖3，轉(zhuǎn)染miR-1的細(xì)胞跟轉(zhuǎn)染對(duì)照RNA的細(xì)胞相比，NDl基因mRNA水平的沒有顯著差異。
[0040](5)用PBS (pH 7.4)清洗細(xì)胞兩次，再用SDS-PAGE上樣緩沖液處理細(xì)胞5分鐘，收集細(xì)胞裂解液沸水煮15分鐘，之后對(duì)細(xì)胞裂解液進(jìn)行免疫印跡反應(yīng)分析(說明同上)。結(jié)果見圖4，轉(zhuǎn)染miR-1的細(xì)胞跟空白對(duì)照和轉(zhuǎn)染對(duì)照RNA的細(xì)胞相比線粒體基因NDl的表達(dá)被上調(diào)，Actin (肌動(dòng)蛋白)作為內(nèi)參并沒有變化。miR-1在不改變線粒體中NDl基因mRNA水平的情況下增強(qiáng)了其表達(dá)翻譯水平。
[0041](6)用冰冷的PBS清洗細(xì)胞兩次，之后用碧云天公司的ATP檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的ATP水平，結(jié)果見圖4，跟對(duì)照RNA相比miR-1可以顯著上調(diào)細(xì)胞內(nèi)ATP的水平。
[0042]上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種應(yīng)用小RNA調(diào)節(jié)線粒體基因表達(dá)的方法，其特征在于:將小RNA轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)調(diào)節(jié)線粒體基因的表達(dá)。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用小RNA調(diào)節(jié)線粒體基因表達(dá)的方法，其特征在于:所述的小RNA包括siRNA或miRNA。3.權(quán)利要求1或2所述的方法在研究線粒體基因功能中的應(yīng)用。4.權(quán)利要求1或2所述的方法在調(diào)控線粒體功能中的應(yīng)用。5.一種調(diào)控線粒體NDl基因表達(dá)的siRNA，其特征在于序列為: UUCCUAUGGAUCCGAGCAUCTT, GAUGCUCGGAUCCAUAGGAATT。6.權(quán)利要求5所述的siRNA在研究小鼠線粒體NDl基因功能中的應(yīng)用。7.miR-1在調(diào)節(jié)線粒體NDl基因表達(dá)中的應(yīng)用。8.miR-1在調(diào)控線粒體功能中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種小RNA調(diào)節(jié)線粒體基因表達(dá)的方法及應(yīng)用。通過將siRNA或miRNA轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中就可實(shí)現(xiàn)調(diào)節(jié)線粒體基因的表達(dá)。通過該方法可以研究線粒體基因的功能及調(diào)控線粒體功能。將線粒體靶基因的siRNA轉(zhuǎn)入細(xì)胞中可以有效的降低線粒體中靶基因mRNA的豐度，也會(huì)降低蛋白水平的表達(dá)。miRNA可以在不改變線粒體中靶基因mRNA水平的情況下增強(qiáng)靶基因的表達(dá)翻譯水平，調(diào)節(jié)線粒體的功能。本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了小RNA對(duì)線粒體基因的調(diào)節(jié)作用，為研究線粒體基因功能提供了新的方向。
【IPC分類】C12N5/10, C12N15/113
【公開號(hào)】CN105200056
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410297969
【發(fā)明人】張曉榮, 付向東
【申請(qǐng)人】武漢大學(xué)
【公開日】2015年12月30日
【申請(qǐng)日】2014年6月27日