專利名稱：醋酸菌生長促進相關(guān)基因及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種耐醋酸微生物，更具體地說，涉及一種編碼來自微生物的具有生長促進功能蛋白質(zhì)的基因，一種其中上述基因多個拷貝被擴增的微生物，以及使用上述微生物制造食醋的方法。
背景技術(shù)：
醋酸菌是廣泛應(yīng)用于食醋制造的微生物。特別是屬于醋酸桿菌(Acetobacter)屬和葡糖酸醋酸桿菌(Gluconacetobacter)屬的醋酸菌用于工業(yè)醋酸發(fā)酵。
在醋酸發(fā)酵中，培養(yǎng)基中所含乙醇被醋酸菌氧化并轉(zhuǎn)化為醋酸。結(jié)果醋酸蓄積在培養(yǎng)基中。醋酸對醋酸菌也有抑制作用。醋酸蓄積量增加導(dǎo)致培養(yǎng)基中醋酸濃度增高，則醋酸菌的生長能力和發(fā)酵能力逐漸下降。
特別是，生長誘導(dǎo)周期，即從醋酸菌實際上開始生長直到可以證實醋酸蓄積的周期，當醋酸濃度增高時趨于延長。
因此，在醋酸發(fā)酵中，即使在更高的醋酸濃度下，還是希望能進一步縮短生長誘導(dǎo)周期。作為達到該目的的一個手段，業(yè)已披露了一種方法，包括添加PQQ(4，5-二氫-4，5-二氧-1H-吡咯并[2，3-f]喹啉-2，7，9-三羧酸)到發(fā)酵液中促進生長，使得所謂的生長誘導(dǎo)周期縮短(如，參見日本專利公開(Kokai)號61-58584 A(1986))。
但是，很難大量獲得PQQ，并且PQQ很昂貴。因此，在工業(yè)規(guī)模上實施上述方法是不經(jīng)濟的。于是，業(yè)已嘗試在高濃度醋酸存在下，克隆編碼具有能縮短所謂生長誘導(dǎo)周期功能蛋白質(zhì)的基因(生長促進相關(guān)基因)，并使用生長促進相關(guān)基因通過促進醋酸菌生長(對醋酸耐性)對醋酸菌進行育種和改良。
然而，迄今為止尚未分離到醋酸菌生長促進相關(guān)基因。在這樣的情況下，希望分離到一種具有生長促進功能并編碼下述蛋白質(zhì)的基因，所述蛋白質(zhì)在高醋酸濃度存在下具有促進在應(yīng)用水平上的醋酸菌生長(耐醋酸)和縮短生長誘導(dǎo)周期的功能，并使用該生長促進相關(guān)基因產(chǎn)生具有更強生長功能的醋酸菌。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于分離一種具有生長促進功能并編碼蛋白質(zhì)的新基因，該蛋白質(zhì)在高醋酸濃度存在下能在應(yīng)用水平上改良生長功能(耐醋酸)并能縮短所謂的生長誘導(dǎo)周期，以便使用具有上述基因生長促進功能的基因培育出一種具有更佳生長促進功能的醋酸菌，并提供一種使用該醋酸菌高效制造具有高濃度醋酸的食醋的方法。
我們提出了一種假說，即在醋酸存在下能生長和發(fā)酵的醋酸菌存在編碼具有生長促進功能蛋白質(zhì)的特定基因，該蛋白質(zhì)可存在于該醋酸菌中而在其他微生物中不存在。接著我們嘗試分離這樣的基因，并成功地分離出上述新基因。此外，我們發(fā)現(xiàn)使用上述編碼具有生長促進功能蛋白質(zhì)的基因能改良生長促進功能和微生物對醋酸的耐性，并能高效制造含高濃度醋酸的新的食醋。因此，由此完成了本發(fā)明。
本發(fā)明如下列(1)至(8)所述。
(1)下列(A)或(B)的蛋白質(zhì)(A)含有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)；或(B)含有由SEQ ID NO2所示氨基酸序列通過置換、缺失、插入、添加或倒位1個或幾個氨基酸得到的氨基酸序列，并具有生長促進功能的蛋白質(zhì)。
(2)編碼下列蛋白質(zhì)(A)或(B)的DNA(A)含有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)；或(B)含有由SEQ ID NO2所示氨基酸序列通過置換、缺失、插入、添加或倒位1個或幾個氨基酸得到的氨基酸序列，并具有生長促進功能的蛋白質(zhì)。
(3)下列(A)、(B)或(C)的DNA(A)含有SEQ ID NO1所示核苷酸序列中第180-1376位的核苷酸序列的DNA；(B)與由與SEQ ID NO1所示核苷酸序列中第180-1376位的核苷酸序列互補的序列組成的DNA在嚴格條件下雜交，并編碼具有生長促進功能蛋白質(zhì)的DNA；或(C)與由產(chǎn)生自SEQ IN NO1所示核苷酸序列中第180-1376位的核苷酸序列的一部分的核苷酸序列組成的、具有引物或探針功能的DNA在嚴格條件下雜交，并編碼具有生長促進功能蛋白質(zhì)的DNA。
(4)含有上述(2)或(3)的DNA的重組載體。
(5)用上述(4)的重組載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化體。
(6)具有增強的生長促進功能的微生物，其中在細胞中上述(2)或(3)的DNA的多個拷貝被擴增。
上述微生物的例子包括屬于醋桿菌屬或葡糖酸醋酸桿菌屬的醋酸菌。
(7)一種制造食醋的方法，包括在含有乙醇的培養(yǎng)基中培養(yǎng)上述(6)的微生物，使該微生物在該培養(yǎng)基中生成并蓄積醋酸。
(8)通過上述(7)的方法獲得的含高濃度醋酸的食醋。
附圖簡述

圖1是來自Gluconacetobacter entanii基因片段(含有pS10和ompA)的酶切圖譜的示意圖。
圖2顯示了在含有醋酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體的過程，該轉(zhuǎn)化體具有來自Gluconacetobacter entanii并與生長促進功能相關(guān)的擴增的多拷貝基因。
圖3顯示了由來自Gluconacetobacter entanii的基因所編碼、并與生長促進功能相關(guān)的蛋白質(zhì)的氨基酸序列(SEQ ID NO2)。
圖4顯示了pGI18的構(gòu)建示意圖和酶切圖譜。
實現(xiàn)本發(fā)明的最佳方式本發(fā)明如下所詳述。該申請要求了2003年6月26日提交的日本專利申請?zhí)?003-183047的優(yōu)先權(quán)，其說明書和/或附圖中描述的內(nèi)容在此并入。
1、分離編碼具有生長促進功能蛋白質(zhì)的基因我們開發(fā)了一種用于從醋酸菌中分離具有生長促進功能基因的方法，并嘗試分離具有這樣功能的基因。根據(jù)該分離方法，通過構(gòu)建醋酸菌染色體DNA文庫、用該染色體DNA文庫轉(zhuǎn)化醋酸菌、然后篩選在存在1％醋酸的瓊脂培養(yǎng)基上3天內(nèi)能生長的醋酸菌株獲得分離得到具有生長促進功能的基因，在相同的培養(yǎng)基上醋酸菌通常需要4天才生長。
通過將該方法應(yīng)用于實際用于食醋制造的屬于葡糖酸醋酸桿菌屬的醋酸菌中，我們首次成功地克隆出一種具有生長促進功能的新基因。該新基因通過在高醋酸濃度存在下增強在應(yīng)用水平上的生長功能(耐醋酸)并縮短生長誘導(dǎo)周期，可改良生長促進功能。
因此，作為DDBJ/EMBL/Genbank和SWISS-PROT/PIR同源性搜索的結(jié)果，所獲得的醋酸耐性基因在一定程度上類似于在大腸桿菌(Escherichia coli)和新月柄桿菌(Caulobacter crescentus)等中業(yè)已發(fā)現(xiàn)的ompA基因所產(chǎn)生的一組蛋白質(zhì)。認為該基因是來自醋酸菌的ompA基因。
此外，本發(fā)明的ompA基因在氨基酸序列水平上與來自大腸桿菌的ompA基因具有36％同源性，與來自新月柄桿菌的ompA基因具有30％同源性。由于如此低的同源性水平，因此證實了本發(fā)明的ompA基因與來自其他微生物的ompA基因稍微類似，而是一種編碼特異于醋酸菌的新蛋白質(zhì)(在下文中，也稱為蛋白質(zhì)OMPA)的新基因(在下文中，也稱為ompA基因)。
在本發(fā)明中，通過將ompA基因連接到質(zhì)粒載體上、然后用該載體轉(zhuǎn)化醋酸菌生成具有擴增的多拷貝ompA基因的轉(zhuǎn)化體。在這樣的轉(zhuǎn)化體中，醋酸耐性明顯增強(參見實施例3)。此外，當在乙醇存在下通風培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體時，其發(fā)酵醋酸的能力，特別是其生長促進功能明顯增強。在高醋酸濃度存在下生長促進功能(耐醋酸)也得到增強。因此，縮短了生長誘導(dǎo)周期，提高了生長速度，證實了能在增加的醋酸濃度等條件下生長(參見實施例2和4)。因此，可以證實ompA基因的確編碼具有生長促進功能的蛋白質(zhì)，而且為了發(fā)揮該蛋白質(zhì)的功能該基因得到表達。因此，我們預(yù)計使用其中擴增了多拷貝ompA基因的微生物，能高效制造具有高醋酸濃度的食醋。
2、本發(fā)明的DNA和蛋白質(zhì)本發(fā)明的DNA編碼來自醋酸菌的ompA基因和該基因的調(diào)控序列。此外，認為該DNA編碼具有改良醋酸耐性功能和生長促進功能的蛋白質(zhì)(SEQ ID NO2)。
本發(fā)明的DNA可獲得自如下所述的Gluconacetobacter entanii的染色體DNA。
首先，制備Gluconacetobacter entanii的染色體DNA文庫，例如Acetobacter altoacetigenes MH-24株(以登記號FERM BP-491于1984年2月23日(原始保藏)保藏于國際專利生物保藏中心(Tsukuba Central6，1-1-1 Higashi Tsukuba，Ibaraki，Japan)，國立高級工業(yè)科學和技術(shù)研究所(AIST))的染色體DNA文庫。可通過常規(guī)方法獲得該染色體DNA(如，參見日本專利公開(Kokai)號60-9489A(1985))。
其次，為分離ompA基因，自上述獲得的染色體DNA構(gòu)建染色體DNA文庫。首先，用合適的限制酶部分消化該染色體DNA文庫以獲得各種片段的混合物。通過調(diào)節(jié)酶切反應(yīng)時間等調(diào)節(jié)酶切程度，可使用多種不同類型的限制酶。例如，在30℃或更高溫度下，優(yōu)選在37℃下，對于不同的反應(yīng)時間(1分鐘至2小時)在1-10單位/毫升的酶濃度范圍內(nèi)通過將Sau3A I應(yīng)用于DNA可以消化該染色體DNA。
再次，將這樣切割得到的染色體DNA片段連接到在醋酸菌中能自主復(fù)制的載體DNA上，從而構(gòu)建得到重組載體。特別是，該載體DNA在30℃溫度、在1-100單位/毫升酶濃度范圍內(nèi)的條件下與限制酶(如，BamH I，其產(chǎn)生的末端核苷酸序列與用于切割該染色體DNA的限制酶Sau3A I的互補)反應(yīng)1或更多小時，從而完全消化并切割該載體DNA。
又次，將上述獲得的染色體DNA片段混合物與該切割得到的載體DNA混合，接著添加T4DNA連接酶并在4℃-16℃溫度范圍內(nèi)、在1-100單位/毫升酶濃度范圍內(nèi)的條件下反應(yīng)1或更多小時(優(yōu)選6-24小時)，從而獲得重組載體。
用于由染色體DNA構(gòu)建染色體DNA文庫的方法為本領(lǐng)域公知(如，鳥槍法)，并不限于上述方法。
在存在1％醋酸濃度的瓊脂培養(yǎng)基中，醋酸菌通常需要4天才生長，例如使用如此獲得的重組載體轉(zhuǎn)化的醋化醋桿菌(Acetobacter aceti)No.1023株(以登記號FERM BP-2287于1983年6月27日(原始保藏)保藏于國際專利生物保藏中心(Tsukuba Central 6，1-1-1 HigashiTsukuba，Ibaraki，Japan)，國立高級工業(yè)科學和技術(shù)研究所)。隨后，在含1％醋酸瓊脂培養(yǎng)基上涂布該菌株，培養(yǎng)3天。在液體培養(yǎng)基中接種并培養(yǎng)所生成的克隆。從如此所獲得的細菌收集質(zhì)粒，以便能獲得含有ompA基因的DNA片段。
本發(fā)明DNA的一個特定例子是一種具有SEQ ID NO1所示核苷酸序列的DNA。在這樣的DNA中，SEQ ID NO1中第180-1376位的核苷酸序列是編碼區(qū)，其編碼的蛋白質(zhì)如SEQ ID NO2所示。
作為DDBJ/EMBL/Genbank和SWISS-PROT/PIR同源性搜索的結(jié)果，SEQ ID NO1所示核苷酸序列或SEQ ID NO2所示氨基酸序列(相應(yīng)于圖3的SEQ ID NO1中第180-1376位核苷酸)在氨基酸水平上與來自大腸桿菌的ompA基因具有36％同源性，與來自新月柄桿菌的ompA基因具有30％同源性。因此，認為該相應(yīng)基因編碼蛋白質(zhì)OMPA。但是，因為這兩個同源性都低于40％或更低，顯然該基因是不同于這些基因的新基因。
關(guān)于本發(fā)明的DNA，為該DNA所編碼的ompA基因的核苷酸序列業(yè)已闡明于此。因此，該DNA可使用醋酸菌Gluconacetobacter entanii的基因組DNA作為模板、以及基于作為引物的核苷酸序列合成的寡核苷酸通過聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR反應(yīng))獲得，或例如通過使用基于作為探針的核苷酸序列合成的寡核苷酸雜交獲得。具有作為引物或探針功能并、由ompA基因部分序列制備的上述DNA也包括在本發(fā)明的DNA中。具體地說，在本發(fā)明中由SEQ ID NO3或4所示的序列組成的DNA可用作為引物，但本發(fā)明的DNA并不限制于此。在此，“具有作為引物或探針功能”指具有能用作為引物或探針的核苷酸序列的長度和核苷酸組成。上述能作為引物或探針的DNA的設(shè)計為本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知。
DNA(寡核苷酸)可根據(jù)常規(guī)方法合成，例如使用多種商業(yè)上可獲得的DNA合成儀。此外，根據(jù)常規(guī)方法進行PCR反應(yīng)，使用Taq DNA聚合酶(TAKARA BIO INC.生產(chǎn))、KOD-Plus-(TOYOBO CO.，LTD.生產(chǎn))等，還使用了Applied Biosystems生產(chǎn)的熱循環(huán)基因擴增PCR系統(tǒng)9700。
此外，本發(fā)明的OPMA蛋白質(zhì)為上述DNA所編碼，具體地說含有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。只要蛋白質(zhì)含有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列就保留有生長促進功能，其氨基酸序列在多個氨基酸中，優(yōu)選在1個或幾個氨基酸中，可包含諸如置換、缺失、插入、添加或倒位的突變。
例如，本發(fā)明的蛋白質(zhì)也包括含有來自SEQ ID NO2所示的氨基酸序列通過缺失1-10個氨基酸，優(yōu)選1-5個氨基酸，添加1-10個氨基酸，優(yōu)選1-5個氨基酸，或用其他氨基酸置換1-10個氨基酸，以及優(yōu)選1-5個氨基酸得到的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。編碼含有如上所述突變的氨基酸序列并具有生長促進功能的上述蛋白質(zhì)的DNA也可通過位點定向誘變方法獲得；特別是通過，例如在特定位點缺失、置換、插入、添加或倒位氨基酸來改變核苷酸序列獲得。此外，如上所述改變的DNA也可通過引起突變的常規(guī)公知處理獲得。
此外，編碼具有生長促進功能蛋白質(zhì)的本發(fā)明DNA變體也可通過位點定向誘變方法或類似方法合成得到。另外，向作為基因的DNA中導(dǎo)入突變，可使用諸如Kunkel方法和缺口雙鏈體方法或根據(jù)其的改良方法的公知技術(shù)進行。例如，使用導(dǎo)入突變的試劑盒導(dǎo)入突變，其使用了位點定向突變方法(如，Mutan-K(TAKARA BIO INC.生產(chǎn))或Mutan-G(TAKARA BIO INC.生產(chǎn)))等。此外，突變可導(dǎo)入基因，或嵌合基因也可通過諸如易錯PCR、DNA改組等技術(shù)構(gòu)建。該易錯PCR技術(shù)和DNA改組技術(shù)為本技術(shù)領(lǐng)域所公知。例如，關(guān)于易錯PCR，參見Chen K和Arnold FH.1993，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，905618-5622，以及關(guān)于DNA改組，參見Stemmer W.P.1994，Nature，370389-391和Stemmer W.P.，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，9110747-10751。
在此，“生長促進功能”在本發(fā)明中指在醋酸存在下促進微生物生長的功能。更具體地說，該術(shù)語指在醋酸存在下細菌的高生長速度或大量生長。此外，該術(shù)語也指更高上限的醋酸濃度，在該濃度下生長或醋酸發(fā)酵是可能的。上述“生長促進功能”也可指增強醋酸耐性的功能。無論編碼具有上述生長促進功能蛋白質(zhì)的基因其中是否導(dǎo)入上述突變，其可通過在含有醋酸的培養(yǎng)基中測定存在或不存在生長得到證實，如實施例中所示。
此外，通常已知在不同種、株、變體和變種之間，蛋白質(zhì)的氨基酸序列和編碼該蛋白質(zhì)的核苷酸序列稍有不同。編碼基本上同一的蛋白質(zhì)的DNAs可獲得自所有的醋酸菌，特別是那些屬于醋桿菌屬或葡糖酸醋酸桿菌屬的種和株，以及它們的變體和變種。
具體地說，例如，在SEQ ID NO1所示的核苷酸序列中，在嚴格條件下與由與由核苷酸編號180-1376組成的核苷酸序列互補的核苷酸序列的一部分組成的DNA雜交，或與由可作為探針的制備自核苷酸編號180-1376的DNA一部分的核苷酸序列組成的DNA雜交，以及編碼具有生長促進功能蛋白質(zhì)的DNA，可分離自屬于醋桿菌屬或葡糖酸醋酸桿菌屬的醋酸菌、屬于醋桿菌屬或葡糖酸醋酸桿菌屬的突變的醋酸菌、或它們的天然突變株或變種。這樣，編碼基本上同一于上述蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)，即保留生長促進功能的蛋白質(zhì)的DNA也可獲得。在此使用的術(shù)語“嚴格條件”指所謂特定的雜合物能形成，而非特異的雜合物不能形成的條件。對該條件明確進行數(shù)值化是困難的。舉例來說，同源性高的核酸之間，例如具有70％或更高同源性的核酸之間進行雜交，而比他們同源性低的核酸之間不進行雜交的條件。其他這樣的例子包括通常的用于雜交的洗滌條件，例如在1x SSC下用相當于0.1％SDS的鹽濃度在60℃下進行洗滌的條件。
3、本發(fā)明的醋酸耐性微生物(具有增強的生長促進功能的微生物)本發(fā)明的DNA編碼具有生長促進功能的蛋白質(zhì)OMPA。通過使用本發(fā)明的DNA，可得到生產(chǎn)在醋酸存在下具有增強的生長促進功能的微生物，也就是說，對醋酸具有提高抗性的微生物。
微生物的生長促進功能可被增強，例如通過將ompA基因連接到重組載體上并用該載體轉(zhuǎn)化微生物，使得在細胞內(nèi)擴增多拷貝的該基因，或通過將該基因的結(jié)構(gòu)基因部分和在微生物中能高效作用的啟動子序列連接到重組載體上，并用該載體轉(zhuǎn)化微生物，使得擴增多拷貝的該基因并增強該基因的表達。
本發(fā)明的重組載體可通過將編碼如上節(jié)“2、本發(fā)明的DNA和蛋白質(zhì)”所述的OMPA蛋白質(zhì)的DNA連接到合適的載體上而獲得。轉(zhuǎn)化體可通過使用上述本發(fā)明的重組載體轉(zhuǎn)化宿主而獲得，以便ompA基因能得到表達。
作為重組載體，可使用在宿主中自發(fā)復(fù)制的噬菌體或質(zhì)粒。質(zhì)粒DNA的例子包括來自大腸桿菌(如pBR322、pBR325、pUC118、pET16b等等)、枯草桿菌(Bacillus subtilis)(如pUB110、pTP5等等)和酵母(如YEp13、Ycp50等等)的質(zhì)粒。噬菌體DNA的例子包括λ噬菌體(如λgt10、λZAP等等)。此外，也可使用諸如逆轉(zhuǎn)錄病毒或牛痘病毒的動物病毒載體、諸如桿狀病毒的昆蟲病毒載體、細菌人工染色體(BAC)、酵母人工染色體(YAC)等制備轉(zhuǎn)化體。
此外，使用多拷貝載體、轉(zhuǎn)座子等也可將靶DNA導(dǎo)入到宿主中。在本發(fā)明中，上述多拷貝載體或轉(zhuǎn)座子也包括在本發(fā)明的重組載體中。這樣的多拷貝載體包括pUF106(如，參見Fujiwara，M等，Cellulose，1989，153-158)、pMV24(如，參見Fukaya，M等，Appl.Environ.Microbiol.，1989，55171-176)、pGI18(如，參見日本專利申請2003-350265的說明書；實施例3)、pTA5001(A)和pTA5001(B)(如，參見日本專利公開(Kokai)號60-9488A(1985))。也可使用染色體整合型載體pMVL1(如，參見Okumura，H等，Agric.Biol.Chem.，1988，523125-3129)。此外，上述轉(zhuǎn)座子的例子包括Mu和IS1452。
為了將本發(fā)明的DNA插入到載體中，例如使用一種方法，包括用合適的限制酶切割純化的DNA，然后將產(chǎn)物插入到合適的載體DNA的限制酶位點或多克隆位點中，使得其與該載體連接。
本發(fā)明的DNA應(yīng)當整合入載體中，以發(fā)揮為該DNA所編碼的基因的功能。因此，除啟動子和本發(fā)明的DNA之外，如果需要，可將順式元件連接到本發(fā)明的重組載體上，例如增強子、剪接信號、加polyA信號、選擇標記、核糖體結(jié)合序列(SD序列)等。此外，上述選擇標記的例子包括二氫葉酸還原酶基因、卡那霉素抗性基因、四環(huán)素抗性基因、氨芐青霉素抗性基因和新霉素抗性基因等。
此外，用其他在屬于醋桿菌屬或葡糖酸醋酸桿菌屬的醋酸菌中能高效作用的啟動子序列替代染色體DNA上ompA基因的啟動子序列，構(gòu)建用于同源重組的載體，然后使用該載體在微生物染色體中進行同源重組。上述啟動子序列的例子包括來自非醋酸菌微生物的那些，例如大腸桿菌質(zhì)粒pBR322(TAKARA BIO INC.生產(chǎn))氨芐青霉素抗性基因、質(zhì)粒pHSG298(TAKARA BIO INC.生產(chǎn))卡那霉素抗性基因、質(zhì)粒pHSG396(TAKARA BIO INC.生產(chǎn))氯霉素抗性基因和β-半乳糖苷酶基因等的啟動子序列。用于同源重組載體的構(gòu)建為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知。如上所述，通過在強啟動子控制下排列微生物中的內(nèi)源性ompA基因，擴增得到多拷貝的ompA基因，因此增強了表達。
用于轉(zhuǎn)化的微生物沒有特別限制，只要它們能表達導(dǎo)入的DNA即可。上述微生物的例子包括細菌(如，大腸桿菌、枯草桿菌和乳酸菌)、酵母和諸如那些屬于曲霉(Aspergillus)屬的真菌。在本發(fā)明中，優(yōu)選使用醋酸菌作為在此使用的微生物，因為其目的在于增強生長促進功能。在醋酸菌中，屬于醋桿菌屬和葡糖酸醋酸桿菌屬的細菌是優(yōu)選的。
屬于醋桿菌屬的細菌的例子是醋化醋桿菌。具體地說，例如可使用醋化醋桿菌No.1023株(FERM BP-2287)、醋化醋桿菌木糖亞種(Acetobacter aceti subsp.xylinum)IFO3288株和醋化醋桿菌IFO3283株。
此外，屬于葡糖酸醋酸桿菌的細菌的例子包括Gluconacetobactereuropaeus DSM6160株和Gluconacetobacter entanii。具體地說，例如可使用Acetobacter altoacetigenes MH-24株(FERM BP-491)。
用于將重組載體導(dǎo)入包括醋酸菌的細菌中的方法沒有特別限制，只要它們適合于將DNA導(dǎo)入細菌即可。上述方法的例子包括使用鈣離子的方法(如，參見Fuyaka，M等，Agric.Biol.Chem.，1985，492091-2097)和電穿孔方法(如，參見Wong，H等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，1990，878130-8134)等。
當酵母用作為宿主時，可使用例如釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和粟酒裂殖酵母(Shizosaccharomyces pombe)。用于將重組載體導(dǎo)入酵母中的方法沒有特別限制，只要它們適合于將DNA導(dǎo)入酵母中既可。上述方法的例子包括電穿孔方法、原生質(zhì)球法和醋酸鋰法。
利用被導(dǎo)入載體上標記基因的特性可對轉(zhuǎn)化體進行選擇。例如，當使用新霉素抗性基因時，選擇對G418藥物具有抗性的微生物。
在本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方案中，可通過轉(zhuǎn)化含有核酸的重組載體而獲得轉(zhuǎn)化體，該核酸具有至少SEQ ID NO1所示的核苷酸序列，例如，通過轉(zhuǎn)移重組載體pOMPA1，其中所述核酸已插入到醋酸菌-大腸桿菌穿梭載體(多拷貝載體)pUF106、醋化醋桿菌No.1023(FERMBP-2287)株中；或通過導(dǎo)入重組載體pOMPA2，其中所述核酸已插入到醋酸菌-大腸桿菌穿梭載體(多拷貝載體)pGI18、醋化醋桿菌木糖亞種IFO 3288株中。
當如上所述在具有氧化乙醇能力的屬于醋桿菌屬或葡糖酸醋酸桿菌屬的醋酸菌中生長促進功能得到增強時，醋酸的產(chǎn)量和產(chǎn)率可得到增加。
4、食醋制造方法如上節(jié)“3、本發(fā)明的醋酸耐性微生物”所述，制備具有選擇性增強生長促進功能(作為具有上述生長促進功能的基因多拷貝擴增的結(jié)果)和氧化乙醇能力的微生物(醋酸菌)。上述微生物可用于制造食醋，因為它們能在醋酸存在下生長并產(chǎn)生醋酸。因此，將具有擴增的多拷貝ompA基因的微生物在含有乙醇的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后使之在培養(yǎng)基中產(chǎn)生并蓄積醋酸，以便高效制造含有高濃度醋酸的食醋。
本發(fā)明制造方法中的醋酸發(fā)酵可以類似于使用醋酸菌進行常規(guī)發(fā)酵的食醋制造方法的方法進行，且用于發(fā)酵的方法并沒有特別限制。用于醋酸發(fā)酵的培養(yǎng)基可以是合成或天然培養(yǎng)基，只要其含有碳源、氮源、無機物和乙醇，如有必要還可含有合適量的所使用的微生物菌株生長需要的營養(yǎng)源即可。
碳源的例子包括各種碳水化合物，例如葡萄糖和蔗糖以及各種有機酸。作為氮源，可使用諸如蛋白胨或微生物發(fā)酵裂解物的天然氮源。
此外，培養(yǎng)可在需氧條件下進行，例如那些靜置培養(yǎng)方法、振蕩培養(yǎng)方法或通風和攪拌培養(yǎng)方法。培養(yǎng)通常在30℃下進行。培養(yǎng)基的pH通常在2.5-7范圍內(nèi)，且優(yōu)選在2.7-6.5范圍內(nèi)。也可使用各種酸、各種堿、緩沖液等來調(diào)節(jié)pH。培養(yǎng)通常進行1-21天。
通過培養(yǎng)具有擴增的多拷貝ompA基因的微生物，高濃度醋酸蓄積在培養(yǎng)基中。此外，上述微生物的生長速度提高了，使得醋酸產(chǎn)率也提高。
根據(jù)本發(fā)明，可賦予微生物生長促進功能以便增強其生長。此外，在具有氧化乙醇能力的微生物中，特別在醋酸菌中，在高醋酸濃度存在下生長功能(耐醋酸)增強了，且生長誘導(dǎo)周期明顯縮短。因此，在培養(yǎng)基中高效蓄積高濃度醋酸的能力可賦予上述微生物和細菌。這樣所產(chǎn)生的微生物(醋酸菌)可用于制造含有高濃度醋酸的食醋。
實施例具體地說，通過所提及的實施例對本發(fā)明進行進一步描述。但是，本發(fā)明的技術(shù)范圍并不為這些實施例所限制。
克隆來自Gluconacetobacter entanii具有生長促進功能的基因并測定其核苷酸序列和氨基酸序列(1)構(gòu)建染色體DNA文庫在補充有6％醋酸和4％乙醇的YPG培養(yǎng)基(3％葡萄糖，0.5％酵母抽提物和0.2％聚胨)中于30℃下振蕩培養(yǎng)Acetobacter altoacetigenesMH-24株(FERM BP-491)，其為Gluconacetobacter entanii的一株。在培養(yǎng)后，離心培養(yǎng)基(7,500xg，10分鐘)，由此獲得細菌細胞。從這樣獲得的細菌細胞中，根據(jù)染色體DNA制備方法(如，參見日本專利公開(Kokai)號60-9489A(1985))制備染色體DNA。
用限制酶Sau3A I(來自TAKARA BIO INC.)部分消化以上述方法獲得的染色體DNA。用限制酶BamH I完全消化并切割大腸桿菌-醋酸菌穿梭載體pUF106?；旌线m當量的這些DNAs并接著用連接試劑盒(TaKaRa DNA連接試劑盒Ver.2，來自TAKARA BIO INC.)連接，由此構(gòu)建Gluconacetobacter entanii的染色體DNA文庫。
(2)克隆具有生長促進功能的基因?qū)⑸鲜霁@得的Gluconacetobacter entanii染色體DNA文庫轉(zhuǎn)化入醋化醋桿菌No.1023株(FERM BP-2287)中，已知該菌株通常需要4天才在含1％醋酸的瓊脂培養(yǎng)基上生長。接著在含1％醋酸和100μg/ml氨芐青霉素的YAG瓊脂培養(yǎng)基上于30℃下培養(yǎng)3天。在含100μg/ml氨芐青霉素的YAG培養(yǎng)基上接種并培養(yǎng)這3天內(nèi)產(chǎn)生的克隆，然后從所收獲的細菌細胞中收集質(zhì)粒。一約2.3-kbp Sau3AI片段得到克隆，如圖1所示，該質(zhì)粒命名為pS10。
如上所述，所獲得具有生長促進功能的基因片段能使醋化醋桿菌No.1023株在含1％醋酸的瓊脂培養(yǎng)基上在3天內(nèi)生長，雖然該菌株在上述含1％醋酸的瓊脂培養(yǎng)基上通常需要4天才生長。
(3)測定克隆的DNA片段的核苷酸序列將以上克隆的Sau3A I片段插入到pUC19的BamH I位點中，然后使用Sanger氏雙脫氧鏈終止法測定該片段的核苷酸序列。結(jié)果，測定了SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。對具有所有彼此重疊的切割位點的兩條DNA鏈的全部區(qū)域進行測序。將如此所獲得的基因命名為ompA。
在SEQ ID NO1所示的核苷酸序列中，證實了所存在的編碼如SEQ ID NO2(圖3)所示的399個氨基酸的開放閱讀框在核苷酸編號180-1376范圍內(nèi)。
在來自Gluconacetobacter entanii的具有生長促進功能基因的轉(zhuǎn)化體中縮短生長誘導(dǎo)周期的效果(1)轉(zhuǎn)化入醋化醋桿菌使用KOD-Plus(來自TOYOBOCO.，LTD)通過PCR方法擴增來自Acetobacter altoacetigenes MH-24株(FERM BP-491)的根據(jù)實施例1克隆得到的上述ompA基因。將如此擴增的DNA片段插入到醋酸菌-大腸桿菌穿梭載體pUF16(如，參見Fujiwara，M等，CELLULOSE，1989，153-158)的限制酶Sma I切割位點，以制備質(zhì)粒pOMPA1。插入pOMPA1的擴增片段如圖1所示。圖1顯示了使用Sau3A I克隆的來自Gluconacetobacter entanii基因片段(pS10)的酶切圖譜，具有生長促進功能基因的位置，以及插入到pOMPA1中的片段。
PCR方法如下進行。具體地說，PCR在如下PCR條件下進行，即使用Acetobacter altoacetigenes MH-24株的基因組DNA作為模板，引物1(5’-GTTTCCCGGAATTCCCGTTTCAGCTCCTTC-3’SEQ IDNO3)，引物2(5’-ATATCTTTCAGGGCATTTGGAGGTATTCCG-3’SEQ ID NO4)，和KOD-Plus-(來自TOYOBO CO.，LTD)。
具體地說，該PCR方法進行30個循環(huán)，每個循環(huán)包括在94℃15秒，在60℃30秒，以及在68℃1分鐘。
使用電穿孔方法(如，參見Wong，HC等.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，1990，878130-8134)將pOMPA1轉(zhuǎn)化到醋化醋桿菌No.1023株中。使用補充有100μg/ml氨芐青霉素和1％醋酸的YPG瓊脂培養(yǎng)基選擇轉(zhuǎn)化體。
從在該選擇培養(yǎng)基上3天內(nèi)已生長的氨芐青霉素抗性轉(zhuǎn)化體中抽提質(zhì)粒，然后根據(jù)常規(guī)方法進行分析。這樣，證實了持有該質(zhì)粒的菌株具有生長促進功能的基因。
(2)使用轉(zhuǎn)化體進行醋酸發(fā)酵試驗比較具有質(zhì)粒pOMA1的如上所述獲得的氨芐青霉素抗性轉(zhuǎn)化體和僅具有穿梭載體pUF106的原始醋化醋桿菌No.1023株的醋酸發(fā)酵能力。
具體地說，使用5L小型發(fā)酵罐(來自Misuwa Scientific Crop.，KMJ-5A)，在含1％醋酸、4％乙醇和100μg/ml氨芐青霉素的2.5L YPG培養(yǎng)基中于30℃、400rpm和0.20vvm下進行通風和攪拌培養(yǎng)。該菌株可以發(fā)酵產(chǎn)生3％濃度的醋酸。隨后，倒掉一些培養(yǎng)基，在小型發(fā)酵罐中留下700mL的培養(yǎng)基。將含醋酸、乙醇和100μg/ml氨芐青霉素的1.8L YPG培養(yǎng)基添加到所剩余的700mL培養(yǎng)基中，使醋酸濃度達到3％，乙醇濃度達到4％。再次啟動醋酸發(fā)酵。當添加乙醇時持續(xù)進行通風和攪拌培養(yǎng)，以便在培養(yǎng)基中保持1％的乙醇濃度。比較該轉(zhuǎn)化體和原始菌株的醋酸發(fā)酵能力。結(jié)果概述于表1中。
表1

基于表1的結(jié)果，可以證實就轉(zhuǎn)化體而言，特定的生長速度明顯更高，生長誘導(dǎo)周期明顯縮短，且該轉(zhuǎn)化體能高效進行醋酸發(fā)酵。
來自Gluconacetobacter entanii的具有生長促進功能基因的轉(zhuǎn)化體醋酸耐性的增強(1)構(gòu)建醋酸菌-大腸桿菌穿梭載體pGI18使用來自Acetobacter altoacetigenes MH-24株(FERM BP-491)的約3.1-kb的質(zhì)粒pGI1和pUC18構(gòu)建pGI18。
具體地說，自Acetobacter altoacetigenes MH-24株(FERM BP-491)的培養(yǎng)基收集細菌細胞，使用氫氧化鈉或十二烷基硫酸鈉裂解，用苯酚處理，接著用乙醇處理，由此純化質(zhì)粒DNA。
如此獲得的質(zhì)粒是一種具有3個Hinc II識別位點和1個Sfi I識別位點的環(huán)狀雙鏈DNA質(zhì)粒。該質(zhì)粒全長約為3100個堿基對(bp)。此外，該質(zhì)粒沒有EcoR I、Sac I、Kpn I、Sma I、BamH I、Xba I、Sal I、PstI、Sph I或Hind III的識別位點。該質(zhì)粒命名為pGI1，并用于構(gòu)建載體pGI18。
使用KOD-Plus-(來自TOYOBO CO.，LTD)通過PCR方法擴增上述獲得的質(zhì)粒pGI1。用Aat II切割該擴增產(chǎn)物。將片段插入到pUC18的限制酶AatII切割位點中，由此制備得到質(zhì)粒pGI18(圖4)。
PCR方法如下詳述進行。具體地說，PCR在如下PCR條件下進行，使用質(zhì)粒pGI1作為模板，以及引物A(SEQ ID NO6)和引物B(SEQ ID NO7)，這些引物具有限制酶Aat II識別位點。
具體地說，該PCR方法進行30個循環(huán)，每個循環(huán)包括在94℃30秒，在60℃30秒，以及在68℃3分鐘。
如圖4所示，如此獲得的質(zhì)粒pGI18含有pUC18和pGI1，其全部長度約為5800個堿基對(5.8kbp)。
質(zhì)粒pGI18的核苷酸序列如SEQ ID NO5所示。
(2)轉(zhuǎn)化入醋化醋桿菌木糖亞種中使用KOD-Plus-(TOYOBO CO.，LTD.)通過PCR方法將實施例1獲得的來自Acetobacter altoacetigenes MH-24株(FERM BP-491)的具有生長促進功能的基因進行擴增。用限制酶Sma I切割(1)中構(gòu)建的醋酸菌-大腸桿菌穿梭載體pGI18。然后，將所擴增的DNA片段插入到該穿梭載體的限制酶Sma I切割位點中，以制備質(zhì)粒pOMPA2。插入pOMPA2的擴增片段如圖1所示。圖1顯示了使用Sau3A I克隆的來自Gluconacetobacter entanii基因片段(pS10)的酶切圖譜，具有生長促進功能基因的位置，以及插入到pOMPA2中的片段。
PCR方法如下詳述進行。具體地說，PCR在如下PCR條件下進行，使用KOD-Plus-(來自TOYOBO CO.，LTD)以Acetobacteraltoacetigenes MH-24株的基因組DNA作為模板，引物1(5’-GTTTCCCGGAATTCCCGTTTCAGCTCCTTC-3’SEQ ID NO3)，引物2(5’-ATATCTTTCAGGGCATTTGGAGGTATTCCG-3’SEQ ID NO4)。
具體地說，該PCR方法進行30個循環(huán)，每個循環(huán)包括在94℃15秒，在60℃30秒，以及在68℃1分鐘。
使用電穿孔方法(如，參見Wong，HC等.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，1990，878130-8134)將pOMPA2轉(zhuǎn)化到醋化醋桿菌木糖亞種中。使用補充有100μg/ml氨芐青霉素和1％醋酸的YPG瓊脂培養(yǎng)基選擇轉(zhuǎn)化體。
從在該選擇培養(yǎng)基上業(yè)已生長的氨芐青霉素抗性轉(zhuǎn)化體中抽提質(zhì)粒，然后根據(jù)常規(guī)方法進行分析。這樣，證實了持有具有生長促進功能基因的質(zhì)粒。
(3)轉(zhuǎn)化體對醋酸的耐性在補充有醋酸的YPG培養(yǎng)基中，比較如上獲得自(2)的具有質(zhì)粒pOMPA2的氨芐青霉素抗性轉(zhuǎn)化體和僅具有穿梭載體pGI18導(dǎo)入其中的原始醋化醋桿菌木糖亞種IFO3288株的生長。
具體地說，于30℃下在100ml含3％醋酸和100μg/ml氨芐青霉素的YPG培養(yǎng)基中進行振蕩培養(yǎng)(150rpm)。通過測定660nm下的細菌濃度比較轉(zhuǎn)化體和原始菌株在添加了醋酸的培養(yǎng)基中的生長情況。
結(jié)果，如圖2所示，在補充有3％醋酸的培養(yǎng)基中，可以證實轉(zhuǎn)化體(用空心圓表示)能生長，而原始醋化醋桿菌木糖亞種IFO3288株(用實心圓表示)不能生長。因此，可以證實具有生長促進功能的該基因增強醋酸耐性的功能。
用具有來自Gluconacetobacter entanii的生長促進功能基因的轉(zhuǎn)化體進行醋酸發(fā)酵試驗比較實施例3中獲得的具有質(zhì)粒pOMPA2的氨芐青霉素抗性轉(zhuǎn)化體和僅具有穿梭載體pGI18導(dǎo)入其中的原始醋化醋桿菌木糖亞種IFO3288株的發(fā)酵醋酸能力。
具體地說，將具有1％醋酸濃度和4％乙醇濃度的YPG培養(yǎng)基裝入5L小型發(fā)酵罐(來自Misuwa Scientific Crop.，KMJ-5A)。將轉(zhuǎn)化體或原始菌株以0.4％在培養(yǎng)基上接種。然后于32℃的發(fā)酵溫度、500rpm和0.20vvm下進行通風和攪拌培養(yǎng)。當發(fā)酵進行到醋酸濃度增加到4％時，添加原料培養(yǎng)基(乙醇濃度7.8％以及醋酸濃度0.26％)繼續(xù)發(fā)酵，該原料培養(yǎng)基是通過混合17.9％糖化米溶液、3.2％醋酸發(fā)酵液、7.8％乙醇和71.1％水制備得到的。進一步繼續(xù)發(fā)酵直到醋酸濃度增加到7.2％。
當醋酸濃度增加到7.2％時，繼續(xù)發(fā)酵，調(diào)節(jié)原料培養(yǎng)基的添加速度以便能保持醋酸濃度。
就原料培養(yǎng)基的添加速率，即添加速度(與產(chǎn)率的比例)比較轉(zhuǎn)化體和原始菌株。結(jié)果如表2所示。
此外，當在7.2％醋酸濃度下持續(xù)發(fā)酵，轉(zhuǎn)化體的添加速度調(diào)節(jié)到與原始菌株幾乎相等時，也比較該轉(zhuǎn)化體和原始菌株的醋酸發(fā)酵能力。結(jié)果如表3所示。
表2

表3

基于表2的結(jié)果，也表明在持續(xù)醋酸發(fā)酵情況下，轉(zhuǎn)化體較原始菌株生產(chǎn)率(原料培養(yǎng)基的添加速度)更高更好。
此外，基于表3結(jié)果，揭示了當在固定生產(chǎn)率(原料培養(yǎng)基的添加速度)下進行持續(xù)醋酸發(fā)酵時，與原始菌株比較轉(zhuǎn)化體能持續(xù)進行醋酸發(fā)酵，具有更高醋酸濃度并具有更好的醋酸耐性。
工業(yè)實用性本發(fā)明提供了一種具有生長促進功能的新基因。通過使用該基因獲得的菌株，在高醋酸濃度下具有增強生長功能(耐醋酸)、縮短的生長誘導(dǎo)周期和改良的醋酸耐性。上述菌株可用于高效制造具有高醋酸濃度的食醋。因此，本發(fā)明在高效制造具有高醋酸濃度的食醋中是有用的。
所有在此引用的出版物、專利和專利申請其全文并入作為參考。
序列表自由文本SEQ ID NOS3、4、6和7合成的寡核苷酸序列表<110>Mitsukan Group Corporation<120>醋酸菌增殖功能相關(guān)基因及其用途<130>PH-2195PCT<150>JP 2003-183047<151>2003-06-26<160>7<210>1<211>2352<212>DNA<213>Gluconacetobacter entanii(Acetobacter altoacetigenes MH-24)<400>1gatccagcca tggacaggtg cgggcaggtt tcccggcatt cccgtttcag ctccttcccg 60ctggcattgc gataatggcc tcaggccaac tgtatcaaca tgcatcaggc cagtgtggaa 120catgccccca tctccacaaa caagaaggcg tctgatcaag tatctttaag gacgggaata 180tgcgtcttcg catggtatta ctggcgactg cacttggcgc agcgccattc gccaccgcaa 240tggccacgac gattacaggg ccatatgtcg atatcggtgg cgggtatgac ctgacccaga 300cccagcatgc ccatggcttt gacaagaacc agtacgaaaa caacgcaaat acggccgggt 360atcttgatgc aacggacaac gcccgcctgc tgaaggaagc ccattcacgc gaacgcatgg 420aacatggcga tggctggacc ggcttcgcca cgttcggctg ggggttcggc aacggcctgc 480gcgcggaaat cgagggggat tacaactggt ccgccctgac cggctacaac tcggtttccg 540gttccgccta tggcaacaat catcagagcg gcaagtccag cggcagcgac cggtcctatg 600gcggattcgt caacgtcctg tatgacatcg acctcaagcg cctgtttaac attgacgtgc 660ccgtgacacc attcgtcggc gttggcgccg gttacctgtg gcagaacgtg gatgccagca 720catccgtgac ccgctacctg aacgtgcgcc agaacggcac gaatggcagc ttcgcctatc 780agggcatggt cggcgcggcc tatgacatcc ccggtgtgcc cggcctgcag atgaccaccg 840aataccgcat gatcggacag gtggaatcct tcgccatggg caatatcagc cagactggcg 900gcggtgaccg cacgctgagc tacgaccatc gcttcaacca tcagttcatc gtcggcgtcc 960gctacgcctt caaccacgcg ccaccgccgc cgccgcccgc gcccgccgtg gcgccccctg1020cccccagcgc ggcccgtacc tatctcgtat tctttgactg ggatggcgcg gtcctgaccg1080atcgcgcgcg cgggatcgtg gcggaagcgg cgcaggcttc cacgcatgtc cagacgaccc1140gtatcgaagt caacggctat accgacaaca cctcggccca ccccggacca cgtggggaga1200agtataacct tggcctgtcc atgcggcgcg cagacagcgt gaaggctgaa ctgatccgtg1260acggcgtacc cgctggcggc atcgacatcc actggtatgg cgaagcccat ccgctggtgg1320tcacccagcc cgatacgcgt gagccgcaga accgtcgcgt cgaaatcatc ctgcactgac1380gacacatact gcaataaatt gataaatagg cttttttaca aaggggcgca caggatgcgc1440ccctttccat atcgaatcgt tccgatgcat cacaggccat gaatcagccc ttccgtttcc1500
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<223>人工序列描述合成的寡核苷酸<400>3gtttcccgga attcccgttt cagctccttc 30<210>4<211>30<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述合成的寡核苷酸<400>4atatctttca gggcatttgg aggtattccg 30<210>5<211>5734<212>DNA<213>Gluconacetobacter entanii(Acetobacter altoacetigenes MH-24)<400>5catggggcgt cacccccagc ggccagcttg gctacctgat ggacagggcg ggccttctgc 60aagccctcgg ccactgccat ctgccgggat atgaggccaa atacgaaccg aaggaaaagc 120gcaccttctg ctaccccacc cagaacgcca gcggctgggc tgtgcagcca tgatcgccaa 180cccctccctc ttcctgagca attcggaaga gcgatttccg ccgactgaac acgtcgaaaa 240tggcagtttt ccaccgaaaa aaggaaagga ccataggaaa ggattaatat cttattttta 300tctaggggtt tgccgatccg cgattttcgc tgggaaaccg ccaaaaatgg cttgccatta 360ggtcgcacca catgcgacca taaagtcgca cagtgtgcga cctattcggc ccatatacag 420aggttcccca catgcggaat gtcacccgtc tcaagacccg caaagaccgg ctccgcgagg 480accaagccga cctgttgaag caagcccttc tgcccttcgc agaggacgat ggaccgatgc 540gggatgcggt cggacggctc tacgtccaga tcaagaacct caccacccca gaccccggaa 600ccacggagcc gttcgtcatg atccgtcccg cccagaatcg cgccgtcacc ctctggctgc 660tgaagaacag taagcggccc atgaaggccg tggacgtatg gacgctgctg ttcgaccacc 720tgtttcccca taccggccag atcatgctga cccgtgagga aatcgcggaa aaagtcggta 780tccgggtcaa cgaagttaca gccgtcatga acgagctggt gagcttcggc gcgattttct 840ccgagcgcga gaaggtggcc ggaatgcgcg ggccgggcct cgcccgctac tacatgaacc 900ggcatgtggc cgaggtcggc agccgcgcca cgcaggaaga acttgcccta atcccacgcc 960ccggcgccaa gctggcagtc gtgcagggtg gcaaggctta acccatgaag gtttcggaac1020tggacgtgtt cgacagcgcc aaggcggcac aagacccgtt ggtgcgggaa gaactgctgc1080aagcagcgca ggcggacggc cacggccccg ccctcgctca tgcccgttcc gtcatagcca1140aggcgcgggc cgggcaggac gccaaggctt aacggccccg ccctctcccg cctcgatccc1200ggcgggcctg tagcatctcc tgatgctcct tggcgttttt ggcccgctgc tcggcccgct1260ctttctcggc cgctgcggct cttaggcgct cttcggccag ccgcatccgc tcgtccatct1320gacgtttccg atctgcctcg gcatccttgg cggctcctgc cttcagccct ttgctgaaag1380ccatccactt attggcggtt ttctcggctt tctgctgtat cggcggggtc agccggtcaa1440atgcctgggc caccctctcg aagccctcac gcatggcgtt gacggcctgc gccagtttag1500ccagggcgaa atctatcacc tcggcccgct gggcgttctc ggcccggata cgccggttgt1560ggttgccggt cggggtctgg tggcccttcc gttccagagc caccacattc ggccccatgt1620gccgctctgg aacgcggtct agcccctgct ccgcattgct ccggtgatct atccgggcct1680cttgcccagc ccgctctagc gcggcattgg caaggcccgc ccatagctgc cggatttcct1740tcacctcgtc ggcggccttc cccagtccca tgccctgccg cttcttgtcg gacagttcga1800tggttgattt gtctccaaag gacagcttgc catcggcccc ccgctccacc gtgcgggtgg1860
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<223>人工序列描述合成的寡核苷酸<400>6cgctgacgtc gtgggccgtg ccagaggccc 30<210>7<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述合成的寡核苷酸<400>7ggccaagacg tctgcagcat ggggcgtcac 30
權(quán)利要求
1.一種下列(A)或(B)的蛋白質(zhì)(A)含有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)；或(B)含有由SEQ ID NO2所示氨基酸序列通過置換、缺失、插入、添加或倒位1個或幾個氨基酸得到的氨基酸序列，并具有生長促進功能的蛋白質(zhì)。
2.一種DNA，其編碼下列蛋白質(zhì)(A)或(B)(A)含有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)；或(B)含有由SEQ ID NO2所示氨基酸序列通過置換、缺失、插入、添加或倒位1個或幾個氨基酸得到的氨基酸序列，并具有生長促進功能的蛋白質(zhì)。
3.一種下列(A)、(B)或(C)的DNA(A)含有SEQ ID NO1所示核苷酸序列中第180-1376位的核苷酸序列的DNA；(B)與由與SEQ ID NO1所示核苷酸序列中第180-1376位的核苷酸序列互補的序列組成的DNA在嚴格條件下雜交，并編碼具有生長促進功能蛋白質(zhì)的DNA；或(C)與由產(chǎn)生自SEQ IN NO1所示核苷酸序列中第180-1376位的核苷酸序列的一部分的核苷酸序列組成的、具有引物或探針功能的DNA在嚴格條件下雜交，并編碼具有生長促進功能蛋白質(zhì)的DNA。
4.一種重組載體，其含有根據(jù)權(quán)利要求2或3的DNA。
5.一種轉(zhuǎn)化體，其用根據(jù)權(quán)利要求4的重組載體轉(zhuǎn)化。
6.一種具有增強的生長促進功能的微生物，其中在細胞中根據(jù)權(quán)利要求2或3的DNA的多個拷貝被擴增。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的微生物，其是屬于醋桿菌屬(Acetobacter)或葡糖酸醋酸桿菌屬(Gluconacetobacter)的醋酸菌。
8.一種制造食醋的方法，其包括在含乙醇的培養(yǎng)基中培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求6或7的微生物，并使該微生物在該培養(yǎng)基中生成并蓄積醋酸。
9.含高濃度醋酸的食醋，其通過根據(jù)權(quán)利要求8的方法獲得。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種醋酸菌生長促進相關(guān)的新基因；一種促進微生物生長的方法，特別是，一種含有該基因的醋酸菌；以及一種使用具有改良的生長促進功能的醋酸菌在短時間內(nèi)高效制造含高濃度醋酸的食醋的方法。
文檔編號C12J1/00GK1842595SQ20048002446
公開日2006年10月4日 申請日期2004年6月16日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月26日
發(fā)明者中野繁 申請人:株式會社味滋集團公司