本發(fā)明屬于基因工程領域，涉及一種大豆低溫誘導啟動子sp5及其在轉(zhuǎn)基因植物中的應用。

背景技術(shù)：

要想實現(xiàn)對基因表達的精細調(diào)控，包括特異性的組織表達、特定時期的表達和誘導性的表達等，就要靠對基因的精確設計來實現(xiàn)，也就是如何使用“分子開關”啟動子來調(diào)控單一基因或多個基因針對特異的環(huán)境、生理和化學誘導來表達。最有效的，也是最具應用前景的，就是利用植物人工合成啟動子來實現(xiàn)。

人工合成啟動子對基因的精細調(diào)控已經(jīng)在植物生長發(fā)育、組織特性、生物及非生物抗性中獲得了成功。mullerandsheen為了獲得一個廣譜性的細胞分裂素報告基因，對細胞分裂素雙組分產(chǎn)物傳感器（two-component-outputsensor，tcs）基因的啟動子進行人工設計，直接將tcs中的核心元件重復6次（tcs::luc），以經(jīng)過核心元件突變的tcs*::luc作為陰性對照。用不同的激素tz（反式玉米素，細胞分裂素的一種）、生長素（naa）、aba和赤霉素處理轉(zhuǎn)化的擬南芥原生質(zhì)體，tcs::luc只對tz處理有響應，為對照的18倍左右，而atgh3.3::luc（脫落酸誘導型）和rd29a::luc（赤霉素誘導型）也對特異的激素才有反應。用不同種類的細胞分裂素處理（ad是腺嘌呤處理，作為陰性對照）轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體，tcs::luc都有作用，表明該啟動子對不同的細胞分裂素具有廣譜響應性。

為了獲得強誘導型啟動子，hou等將脅迫誘導型啟動子（rd29a,erd1,cor15a,kin1）的調(diào)控元件重新組合，以gus作為報告基因，設計合成了3個人工合成啟動子。在各轉(zhuǎn)基因株系中，誘導情況下，人工合成啟動子的gus表達水平要強于對照株系rd29a::gus株系。在不同脅迫情況下，人工合成啟動子比rd29a啟動子的調(diào)控活性要好很多，但不如組成型啟動子camv35s。

acharya等利用花椰菜花葉病毒（mirabilismosaicvirus）全長轉(zhuǎn)錄本的上游激活區(qū)（muas,?297to?38）和花椰菜花葉病毒亞基因組的5’端序列（mscp,?306to?125）構(gòu)建了一個高效的人工嵌合強啟動子。這個啟動子可以啟動gus基因在轉(zhuǎn)基因煙草和擬南芥原生質(zhì)體中高效表達，啟動活性強于camv35s啟動子，是它的兩倍多。在轉(zhuǎn)基因擬南芥中鑒定muasmscp嵌合啟動子的活性，種子萌發(fā)過程中，muasmscp啟動gus表達的活性高于其它類型的轉(zhuǎn)基因株系，在21天大小的轉(zhuǎn)基因擬南芥中，muasmscp啟動gus基因在整株表達且活性較高。

這些研究結(jié)果表明，通過組合不同的調(diào)控元件合成人工啟動子可以有目的的調(diào)控基因的表達，即實現(xiàn)基因精細調(diào)控。

技術(shù)實現(xiàn)要素：
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本發(fā)明的目的是提供了一種大豆低溫誘導啟動子sp5。

一種大豆誘導啟動子sp5，其堿基序列如seqidno.1所示。

一種表達載體，它是在植物表達載體中插入了如seqidno.1所示的堿基序列；

所述的表達載體為pbi121。

一種含有其堿其序列如seqidno.1的互補或反向序列。

一種大豆誘導啟動子sp5在用于以低溫或鹽堿為壓力作為選擇標記的用途。

一種大豆誘導啟動子sp5在培育耐低溫或抗鹽堿轉(zhuǎn)基因植物的應用；

所述的的植物為單子葉植物或雙子葉植物。

本發(fā)明公開了一種大豆低溫誘導啟動子sp5，它是以大豆中的glyma18g03930基因啟動子區(qū)179bp、glyma09g29840基因啟動子區(qū)382bp、以及35s核心啟動子corecamv35s連接構(gòu)建而成，命名為syntheticpromoter5，簡稱為sp5。在轉(zhuǎn)基因煙草中鑒定sp5啟動子驅(qū)動報告基因gus的表達情況表明，sp5啟動子可以受干旱、鹽、鹽堿、aba以及低溫脅迫所誘導，對低溫尤其敏感。本發(fā)明構(gòu)建了一種大豆人工合成啟動子sp5，其對低溫脅迫尤其敏感，可直接應用于農(nóng)作物轉(zhuǎn)基因抗逆育種。

附圖說明

圖1為sp5與gus融合表達載體圖；

圖2為轉(zhuǎn)sp5基因煙草在不同脅迫條件下gus蛋白的染色情況；

圖3為轉(zhuǎn)sp5基因煙草在不同脅迫條件下gus蛋白的活性。

具體實施方式：

實施例1大豆人工合成啟動子sp5的設計

通過分析大豆glyma18g03930與glyma09g29840基因啟動子區(qū)域發(fā)現(xiàn)，在我們選定的兩個區(qū)域內(nèi)含有多個與逆境響應的元件，比如tca-element、tcrichrepeat、ltr元件等，將glyma18g03930啟動子區(qū)179bp、glyma09g29840啟動子區(qū)382bp、以及35s核心啟動子corecamv35s串聯(lián)構(gòu)建而成syntheticpromoter5，簡稱為sp5，其核苷酸序列為seqidno.1序列。

實施例2啟動子sp5表達載體的構(gòu)建

通過人工合成方法將sp5（seqidno.1）序列合成到載體puc57上，并在序列兩端添加酶切位點bamhl和hindiii。將puc57-sp2載體和pbi121質(zhì)粒（可直接從生物公司購買），分別用bamhl和hindiii進行雙酶切，分別回收酶切產(chǎn)物后，經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化、鑒定，獲得表達載體pbi121-sp2（圖1）。將載體pbi121-sp2轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌eha105中，用于浸染煙草。

實施例3轉(zhuǎn)sp5基因煙草的獲得

按照葉盤轉(zhuǎn)化法（horschetal.1988）進行。農(nóng)桿菌菌液用滅菌水稀釋至106-107cells/ml（一般稀釋30倍左右）。取無菌煙草葉片，去掉主脈將葉片切成四方形狀，然后將其浸入到稀釋后的菌液中，侵染8-10分鐘。

(1)共培養(yǎng)

取出葉片外植體后在滅菌濾紙上吸干菌液，將其葉表面向下倒置于ms培養(yǎng)基的表面，24°c-25°c暗培養(yǎng)2天。

(2)選擇培養(yǎng)

將共培養(yǎng)葉片轉(zhuǎn)移到選擇分化培養(yǎng)基（含250mg/l頭孢；100mg/l卡那霉素）上，28°c，每日光照16小時，15-20天換一次培養(yǎng)基。

(3)生根培養(yǎng)

當分化的抗性芽長到1cm左右，切下（最好不帶任何愈傷組織）轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上，28°c，每日光照16小時。

(4)土壤培養(yǎng)

當根長出約1-3cm長，且密度較大時，去除封口膜，室溫環(huán)境中進行煉苗2-3天，取出植株徹底洗凈培養(yǎng)基，同時注意盡量減少根的損傷，移入溫室土壤中培養(yǎng)。前2-3天需要遮陰培養(yǎng)。

(5)煙草的繁種

將轉(zhuǎn)基因煙草播種與人工氣候室中，繁種至t2代后，收取種子用于gus染色分析。

實施例4gus組織化學染色

將轉(zhuǎn)sp5基因煙草種植于ms固體培養(yǎng)基中，待長至4片葉時將小苗移至液體培養(yǎng)基中，生長2天后進行鹽、鹽堿、干旱、低溫及aba處理，干旱處理1天，其他處理均處理6小時。將處理好的煙草幼苗置于固定液（1%甲醛，50mm磷酸鈉緩沖液ph7.0，0.05%tritonx-100）中，室溫靜置固定45-60min；然后用50mm，ph7.0的磷酸鈉緩沖液漂洗2-3次，每次10-15min；加入x-gluc染色液浸沒材料，蓋上管蓋，37℃避光保溫過夜。棄去染色液，50mm，ph7.0磷酸鈉緩沖液漂洗沖洗后，加入25%、50%、75%、90%、100%的梯度濃度乙醇分別浸泡1h進行脫色，體視顯微鏡下觀察并拍照記錄gus的表達情況。結(jié)果顯示（圖2）：sp5啟動子驅(qū)動的gus基因在轉(zhuǎn)基因煙草各組織中均有表達，且在鹽、鹽堿、干旱、aba以及低溫處理下表達增強，其中低溫脅迫下gus染色較深。這些結(jié)果說明sp5啟動子為組成型啟動子，且可以受鹽、鹽堿、干旱、低溫以及aba處理誘導，尤其受低溫脅迫誘導顯著，適合作為利用植物基因工程手段培育抗逆作物新品種的候選啟動子。

實施例4gus組織化學染色及活性測定

（1）gus酶提取

1)將0.1g的轉(zhuǎn)基因煙草材料置于研缽中，加入液氮研磨成粉末；

2)加入600μl的酶提取緩沖液，研磨成勻漿；

3)4℃，12000rpm離心10min，取上清，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（2）bradford法測定gus提取液的蛋白含量

1）制作標準曲線：配置濃度0-100μg/ml的bsa梯度液（表1），與考馬斯亮藍g250按照1：5混勻，室溫靜置5min，595nm測量吸收值，以吸收值作縱坐標，蛋白濃度為橫坐標做回歸方程；

2)提取液蛋白含量的測定：取gus提取液20μl，加水至4ml，取出1ml，加入5ml考馬斯亮藍溶液混勻，595nm測量吸收值，根據(jù)回歸方程計算樣品中蛋白含量。

（3）熒光測定

1）制作標準曲線：配制10μm4-mu母液，用反應終止液將其稀釋成依次為：62.5nmol/l，125nmol/l，250nmol/l，500nmol/l，1000nmol/l的濃度，用熒光分光光度計在激發(fā)光365nm，發(fā)射光455nm，狹縫10nm條件下測定各管熒光強度，制作一條標準曲線；

2）取6支1.5ml的離心管，各加入900μl的反應終止液，并編號；

3）取1支1.5ml的離心管，加入37℃預熱的檢測液2mmol/lmug1ml，根據(jù)測定蛋白的濃度加入適量的gus提取液，迅速充分混合，立即取出100μl加入1號管中，此時反應為0，嚴格計時；

4）反應管放入37℃水浴中進行酶反應，分別于5、10、15、30、60min時各取出100μl加入到900μl反應終止液，依次加入到2-6號管中混勻，分別為酶反應5、10、15、30、60min時的樣品，在激發(fā)光365nm，發(fā)射光455nm，狹縫10nm條件下測定各管熒光強度，并從標準曲線上讀取2-6號管中4-mu的含量。

（4）gus酶活性計算

l)酶活力單位定義：每分鐘水解4-mug生成1nmol或1mg、1μg、1ng4-mu的酶量為一個活力單位，根據(jù)定義求出各樣品的酶活力；

2)gus基因表達活性：以每毫克蛋白的酶活力來計算，每毫克蛋白每分鐘催化生成1pmol4-mu作為gus的一個活力單位。

gus熒光檢測的gus活性用獲得的熒光值除以蛋白濃度和時間得到相對活性。熒光測定結(jié)果（圖3）顯示，未處理的轉(zhuǎn)sp5基因煙草熒光值與aba脅迫處理相近，都較低；在鹽、鹽堿、干旱及低溫處理下，轉(zhuǎn)基因煙草的gus熒光值均有所提高，其中低溫脅迫下提高的尤為顯著。這就表明，sp5啟動子是組成型啟動子，并且能夠在脅迫條件下驅(qū)動gus基因高表達而使對應的熒光值提高。

<110>吉林農(nóng)業(yè)大學

<120>大豆低溫誘導人工合成啟動子sp5及應用

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<212>dna

<213>人工

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