專利名稱：抑制人Akt2基因表達(dá)的siRNA序列及其融合表達(dá)載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體是一段能抑制人Akt2基因表達(dá)的 s iRNA序列及其融合表達(dá)載體。
背景技術(shù)：
RM干擾(RNAi )是多數(shù)真核細(xì)胞本身固有的一種自我保護(hù)現(xiàn)象，既 能對(duì)抗如病毒基因或人工轉(zhuǎn)基因所表達(dá)的mRNA等外源基因的侵害，又能 降解自身異?；虍a(chǎn)生的mRNA。以基因轉(zhuǎn)錄后沉默的方式或誘導(dǎo)DNA曱 基化的方式對(duì)含有其同源序列的基因表達(dá)進(jìn)行干涉。
近年來，人們利用這一現(xiàn)象針對(duì)要研究的基因表達(dá)進(jìn)行阻斷，從而 產(chǎn)生相應(yīng)的功能缺失表型，形成RNAi技術(shù)。新近的RNAi技術(shù)，是利用 DNA表達(dá)載體直接在體內(nèi)表達(dá)短發(fā)夾狀RNA(shRNA)，特異性封閉相應(yīng)的 靶基因mRNA，抑制mRNA的翻譯。與早期的RNA干擾技術(shù)相比，該方法的
特異性和干擾效率均有較大提高，已廣泛應(yīng)用于多種研究領(lǐng)域。
蛋白激酶B(Akt)是一種絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶，包含Aktl、Akt2、Akt3 三種亞型，其中Akt2在多種肺瘤中均有表達(dá)。Akt最早發(fā)現(xiàn)于引起鼠白血 病的逆轉(zhuǎn)錄病毒癌基因v-Akt編碼的融合蛋白中，至今在哺乳動(dòng)物體內(nèi)還 沒有發(fā)現(xiàn)Akt基因的突變體。研究證明，Akt是胰島素樣生長因子l受體(IGF 一1R)、表皮生長因子受體HER^/neu、血管內(nèi)皮生長因子受體(VEGF—R)、 血小板源性生長因子受體(PDGF—R)等受體酪氨酸激酶或G.蛋白偶聯(lián)受體 等參與的細(xì)胞外信號(hào)通路上游的重要會(huì)聚點(diǎn)，同時(shí)Akt也是磷酯酰肌醇3 激酶(PI3K)信號(hào)傳導(dǎo)通路的中心環(huán)節(jié)。其功能除了涉及細(xì)胞周期調(diào)控，凋 亡啟動(dòng)等細(xì)胞生存調(diào)節(jié)外，還參與血管生成、端粒酶活性和細(xì)胞侵襲,f生等 諸多重要的生理及病理過程。目前的研究發(fā)現(xiàn)，Akt是腫瘤發(fā)生的重要信 號(hào)分子，其亞型Akt2是由481個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，當(dāng)其第308位的絲氨 酸和473位的蘇氨酸磷酸化時(shí)，激酶活性增高，發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞增殖和抑制 細(xì)^^凋亡的作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是為了進(jìn)一步研究Akt2在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用提供一個(gè)有 效的工具，也為腫瘤的基因治療提供了一個(gè)新的技術(shù)手段，而提供一段抑 制人Ak 12基因表達(dá)的s i RN A序列及其融合表達(dá)載體。
本發(fā)明通過基因敲除技術(shù)，即siRNA的方法抑制Akt2的表達(dá)。利用 RNAi技術(shù)特異地抑制癌基因、癌相關(guān)基因或突變基因的過度表達(dá)，使這 些基因保持在沉默或休眠狀態(tài)，從而使腫瘤細(xì)胞增殖速度減慢，凋亡加快，顯示了 RNAi技術(shù)用于腫瘤基因治療的可行性和有效性。RNAi過程中， 由雙鏈RNA分子加工而成的19-23個(gè)核芬酸的RNAs就稱為siRNA，是誘 導(dǎo)基因沉默的第一步，它與-RNAi特異性酶結(jié)合，形成沉默復(fù)合物，特異 降解與s iRNA同源的靶mRNA。
抑制人Akt2基因表達(dá)的siRNA序列，該序列與Akt2 mRNA互補(bǔ)；具 有抑制人Akt2基因表達(dá)的功能，其作用位點(diǎn)Akt2 mRNA ( NM—001626 CDS: 263-1708) 1570-1588，
其核酸序列如下5 ，-TTCATCATCGAAGTACCTT- 3 ，。
一種抑制人Akt2基因表達(dá)的siRNA序列的融合表達(dá)載體，其融合表 達(dá)載體由合成的抑制人Akt2基因表達(dá)的siRNA序列模板與 pRNAT-U6. 1/Hygro載體相連接而成，將其轉(zhuǎn)染人乳腺癌細(xì)胞后能夠特異 降解與siRNA同源的Akt2的mRNA，抑制人Akt2基因表達(dá)；
其中合成抑制人Aia2基因表達(dá)的siRNA序列模板為兩端帶有酶切 位點(diǎn)，3'端為HindIII， 5'端為BamH I ，合成抑制人Akt2基因表達(dá)的siRNA 序列模板的核酸序列如下
5，-GGATCCCAATTCATCATCGAAGTACCTTTTCAAGAGAAAGGTACTTCGATGATGAA TTTTTTTTCCAAAAGCTT-3，。
本發(fā)明通過脂質(zhì)體將融合載體轉(zhuǎn)入MDA-MB-231人乳腺癌細(xì)胞系中， 以contro卜siRNA作為對(duì)照，通過潮霉素壓力篩選得到穩(wěn)定細(xì)胞抹，用 RT-PCR、 Western Blot方法檢測(cè)細(xì)胞的Akt2表達(dá)水平。結(jié)果表明表達(dá) Akt2-siRNA作用的細(xì)胞其Akt2的合成明顯降低，與對(duì)照組相比具有顯著 差異(P〈0. 05)。
本發(fā)明設(shè)計(jì)的靶向Akt2的siRNA的序列及融合表達(dá)載體能夠在人乳 腺癌細(xì)胞中表達(dá)特定的siRNA，并能夠有效地抑制Akt2的基因表達(dá)，為 進(jìn)一步研究Akt2基因在腫瘤中的生物學(xué)功能提供了可行的手段。
這樣設(shè)計(jì)的本發(fā)明能夠?yàn)檫M(jìn)一步研究Akt2在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用 提供了一個(gè)有效的工具，也為腫瘤的基因治療提供了一個(gè)新的技術(shù)手段。


附圖是Akt2的mRNA和蛋白表達(dá)量。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的說明。 一。實(shí)驗(yàn)材料來源
人乳&，癌MDA-231細(xì)月包由美國國家癌癥研究所Dr. Joost J. Oppenheim贈(zèng)送；pRNAT-U6. 1/Hygro質(zhì)粒購自GenScript公司； Hygromysin來自Invitrogen。鼠抗人Akt2單克隆抗體購自Santa Cruz公司。
二.實(shí)施方法
1. Akt2-siRNA的設(shè)計(jì)與合成
依據(jù)Ambion公司在網(wǎng)上提供的設(shè)計(jì)軟件 (www。 ambion. com/techl ib/misc/ siRNA finder, html )合成以下 Akt2特異的si隨:
5，-GGATCCCAATTCATCATCGAAGTACCTTTTCAAGAGAAAGGTACTTCGATGATGA ATTTTTTTTCCAAAAGCTT-3，
siRNA作用位點(diǎn)
Akt2 mRNA ( NM—001626 CDS: 263-1708)的1570-1588位點(diǎn),siRNA 由GenScript公司合成。
2. Akt2-siRNA融合表達(dá)載體構(gòu)建
表達(dá)載體pRNAT-U6. 1/Hygro其結(jié)構(gòu)為線性，兩端分別為BamHI和 HindIII酶切位點(diǎn)的粘性末端。將合成的Akt2-siRNA模板退火，連入 pRNAT-U6. 1/Hygro質(zhì)粒載體中，轉(zhuǎn)染感受態(tài)大腸桿菌DH5 ot ，鋪平板過 夜培養(yǎng)。挑取轉(zhuǎn)化菌擴(kuò)增培養(yǎng)提取質(zhì)粒，酶切測(cè)序驗(yàn)證插入序列。
陰性對(duì)照Control-siRNA載體由試劑盒提供，含有一段與人類已知 基因均不同源的siRNA。
3. 表達(dá)載體轉(zhuǎn)染及穩(wěn)定細(xì)胞抹篩選
應(yīng)用EndoFree Plasmid Maxi試劑盒提取純化質(zhì)粒，用800 u 1低滲 液將20iag重組質(zhì)粒與lxl(T細(xì)胞混合，采用1 OOOv電壓電轉(zhuǎn)lOOix s, 靜置5min，傳入96孔板，5。/。C02溫箱孵育24h。添加0. 8mg/ml Hygromycin B壓力篩選至非轉(zhuǎn)染對(duì)照組細(xì)胞完全死亡，約20 d，將表達(dá)GFP的單克 隆挑出擴(kuò)大培養(yǎng)。
結(jié)果表明得到4個(gè)穩(wěn)定克隆，其編號(hào)分別為44、 98、 97、 102。
4. 檢測(cè)細(xì)胞中Akt2的表達(dá)水平 ①.實(shí)驗(yàn)方法
將對(duì)照細(xì)胞和Akt2-siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(44、 98、 97、 102)，用Trizol 試劑提取細(xì)胞的總RNA,電泳;險(xiǎn)測(cè)質(zhì)量，紫外分光定量。以相同量RNA作 為起始才莫板，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA。 用QuantiTect SYBR Green PCR試 劑盒在定量PCR儀GeneAmp 5700上進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR，反應(yīng)體系為95°C 預(yù)變性15min, 94。C變性15s， 5(TC退火30s， 72。C延伸30s，循環(huán)40次。 用SDS Software及瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果。
用免疫印跡的方法檢測(cè)細(xì)胞中蛋白的表達(dá)水平是生物實(shí)驗(yàn)中一個(gè)傳 統(tǒng)的方法。將對(duì)照細(xì)月包和Akt2-siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)月包(44、 98、 97、 102)預(yù)留足夠數(shù)量至離心管中，離心后裂解細(xì)胞，煮樣，超聲，再離心。制
得樣品后，使用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白濃度的測(cè)定。根據(jù)樣品的濃度，取 相同的蛋白總量進(jìn)行SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)束后，將膠上蛋白電轉(zhuǎn)到PVDF 膜上，室溫牛奶封閉2小時(shí)。簡(jiǎn)單洗滌后， 一抗(鼠抗人Akt2單克隆抗 體)室溫孵育2小時(shí)。然后用抗鼠的二抗室溫孵育1小時(shí)。最后用化學(xué) 發(fā)光試劑盒檢測(cè)。根據(jù)曝光后條帶的寬窄和深淺判斷蛋白的表達(dá)量。每 個(gè)克隆至少通過3次免疫印跡進(jìn)行;險(xiǎn)測(cè)。
②.實(shí)^r結(jié)果見圖1，與對(duì)照細(xì)^^目比，克隆44、 98、 97、 102中 的Akt2的mRNA和蛋白表達(dá)量均有明顯降低。
從以上工作的結(jié)果中得出本發(fā)明設(shè)計(jì)的靶向Akt2的siRNA的序列 及融合表達(dá)載體能夠在人乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)特定的siRNA,并能夠有效地 抑制Akt2的基因表達(dá)，為進(jìn)一步研究Akt2基因在紳瘤中的生物學(xué)功能 提供了可行的手段。SEQUENCE LISTING
<110>天津醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院
<120>抑制人Akt2基因表達(dá)的siRNA序列及其融合表達(dá)載體 <130> 人 <160> 1
<170> Patentln version 3,1 <210> 1 <211> 74 <212> DNA
<213> 人 <220>
<221> siRNA <222> (1)..(74) <223> <400> 1
ggatcccaat tc3tcatcg3 3gt3cctttt c33g3g333g gt3cttcg3t g3tg33tttt 60 ttttccaaaa gctt 7權(quán)利要求
1. 抑制人Akt2基因表達(dá)的siRNA序列，其特征在于該序列與Akt2mRNA互補(bǔ)；具有抑制人Akt2基因表達(dá)的功能，其作用位點(diǎn)Akt2 mRNA(NM_001626 CDS263-1708)1570-1588，其核酸序列如下5’-TTCATCATCGAAGTACCTT-3’。
2. —種抑制人Akt2基因表達(dá)的siRNA序列的融合表達(dá)載體，其特征 在于該融合表達(dá)載體由合成的抑制人Akt2基因表達(dá)的siRNA序列模板 與pRNAT-U6. 1/Hygro載體相連接而成，將其轉(zhuǎn)染人乳腺癌細(xì)胞后能夠特 異降解與siRNA同源的Akt2的mRNA,抑制人Akt2基因表達(dá)；其中合成抑制人Akt2基因表達(dá)的siRNA序列模板為兩端帶有酶切 位點(diǎn)，3'端為HindIII， 5，端為BamH I ，合成抑制人Akt2基因表達(dá)的siRNA 序列模板的核酸序列如下5 ，-GGATCCCAATTCATCATCGAAGTACCTTTTCAAGAGAAAGGTACTTCGATGATGAA TTTTTTTTCCAAAAGCTT-3'。
全文摘要
本發(fā)明公開了一段抑制人Akt2基因表達(dá)的siRNA序列及其融合表達(dá)載體，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。該序列與Akt2 mRNA互補(bǔ)；具有抑制人Akt2基因表達(dá)的功能，其核酸序列為5’-TTCATCATCGAAGTACCTT-3’；其融合表達(dá)載體由合成的抑制人Akt2基因表達(dá)的siRNA序列模板與pRNAT-U6.1/Hygro載體相連接而成，將其轉(zhuǎn)染人乳腺癌細(xì)胞后能夠特異降解與siRNA同源的Akt2的mRNA，抑制人Akt2基因表達(dá)；在人乳腺癌細(xì)胞中能夠沉默Akt2的表達(dá)，可以有效地抑制人乳腺癌細(xì)胞Akt2蛋白合成，為進(jìn)一步研究Akt2基因在腫瘤中的生物學(xué)功能提供了可行的手段。
文檔編號(hào)A61P35/00GK101434629SQ20071015020
公開日2009年5月20日 申請(qǐng)日期2007年11月16日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月16日
發(fā)明者寧 張, 王靜娜 申請(qǐng)人:天津醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院