一種降低人POKEMON基因表達的siRNA及其相關(guān)應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說涉及RNA干擾技術(shù)，更具體地涉及一種降低 人POKEMON基因表達的小分子干擾核糖核酸（siRNA)。
【背景技術(shù)】
[0002] RNA干擾技術(shù)是一種新興的基因治療技術(shù)，又稱為基因敲低（knock-down)或基因 沉默（gene silencing)，其中siRNA (small interfering RNA)是最關(guān)鍵的效應(yīng)分子，其具 有21-23nt堿基的短片段雙鏈RNA分子，能夠以序列特異性地結(jié)合靶mRNA并使mRNA降解。 能有效、特異地抑制細胞內(nèi)基因的表達。由于RNA干擾具有高效、特異性，siRNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄 后基因沉默是針對靶向基因的外顯子序列，對其啟動子或內(nèi)含子序列卻沒有效應(yīng)，是一種 轉(zhuǎn)錄后基因表達調(diào)控機制，且不誘導(dǎo)非特異性的干擾素激活途徑，因而成為繼反義核普酸、 核酶技術(shù)之后一種新的分析功能缺失表型的工具，為基因功能研宄和基因治療開辟了新的 道路，目前已廣泛用于抑制特定基因的表達研宄，特別是靶向惡性腫瘤中高度表達基因的 研宄。
[0003] POKEMON是POK轉(zhuǎn)錄抑制因子家族成員之一，它包括一個氨基末端Ρ0Ζ/ΒΤΒ結(jié)構(gòu) 域和羧基端Krilppel型鋅手指結(jié)構(gòu)域，是T淋巴細胞、B淋巴細胞和紅細胞系發(fā)育和成熟的 重要因子。研宄結(jié)果顯示，POKEMON的作用位于許多腫瘤抑制基因和原癌基因的上游，通過 ARF_HDM2_p53和Rb_E2F路徑對腫瘤發(fā)生發(fā)展進行調(diào)節(jié)，可使癌細胞獲得抗老化和死亡的 能力，因此被稱為癌癥的"總開關(guān)"。因此，將其作為靶基因?qū)⒂兄谀[瘤的根治。POKEMON 基因在乳腺癌、肝癌和淋巴瘤等腫瘤的異常表達在癌基因轉(zhuǎn)化和腫瘤的發(fā)生過程中發(fā)揮著 重要的作用。重點是細胞內(nèi)POKEMON基因的缺失不會對細胞的正常生長造成影響，這為設(shè) 計低副作用的特異性抗癌藥物提供了可能。目前盡管早期癌癥患者進行了根治性切除和輔 助治療，但仍具有很大的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的風險?？傮w而言，約50% -60%的患者將最終發(fā)展為 轉(zhuǎn)移性或晚期疾病，5年生存率小于5%。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供4對針對人POKEMON基因 DNA片段的SiRNA，能高效的抑制 人POKEMON基因表達的小干擾核糖核酸。
[0005] 本發(fā)明首先提供了一種降低POKEMON基因表達的小分子干擾RNA(SiRNA)，包括正 義鏈和反義鏈，序列如下：
[0006] siRNAl 正義鏈：5' -CCCACCACAAACGUAGAAUUU-3'
[0007] 反義鏈：3' -UUGGGUGGUGUUUGCAUCUUA-5，
[0008] siRNA2 正義鏈：5' -GACCUUAAAUGAUUUCU⑶UU-3'
[0009] 反義鏈：3' -UUCUGGAAUUUACUAAAGACA-5'
[0010] siRNA3 正義鏈：5' -CUGAC⑶GAAGAG⑶CUUAUU-3'
[0011] 反義鏈：3 ' -UUGACUGCACUUCUCCAGAAU-5 '
[0012] siRNA4 正義鏈：5' -CUCUGUGACACACACAUCUUU-3'
[0013] 反義鏈：3' -UUGAGACACUGUGUGUGUAGA-5，
[0014] 本發(fā)明所述小分子干擾RNA(siRNA)針對的POKEMON基因的靶序列如SEQ ID No. 1-4 所示。
[0015] SEQ ID No. I ：AA CCCACCACAAACGTAGAAT CC
[0016] SEQ ID No. 2 ：AA GACCTTAAATGATTTCTGT CT
[0017] SEQ ID No. 3 ：TT CTGACGTGAAGAGGTCTTA GC
[0018] SEQ ID No. 4 ：ΤΤ CTCTGTGACACACACATCT TC
[0019] 本發(fā)明提供了一種小分子干擾核糖核酸（siRNA)，其包含正義RNA片段和反義RNA 片段，所述正義RNA片段和所述反義RNA片段能形成雙鏈RNA，該雙鏈RNA能抑制人POKEMON 基因的表達。對于上述小分子干擾核糖核酸來說，所述正義RNA片段和反義RNA片段可以 存在于兩條不同的RNA鏈上，也可以存在于同一條RNA鏈上。當正義RNA片段和反義RNA 片段存在于同一條RNA鏈上時，所述核糖核酸優(yōu)選為發(fā)夾型單鏈RNA分子，其中正義RNA片 段和反義RNA片段之間的互補區(qū)域形成雙鏈RNA區(qū)域。對于上述任一項所述的小分子干擾 核糖核酸，其中正義RNA片段和反義RNA片段的長度為21個核苷酸。對于任一項所述的小 分子干擾核糖核酸，其中雙鏈RNA的互補區(qū)域至少有19個堿基對。本發(fā)明的所述抑制人 POKEMON基因表達的siRNA，通過人工合成形成，其生產(chǎn)和制備屬于現(xiàn)有技術(shù)。
[0020] 本發(fā)明提供的SiRNA能特異性抑制POKEMON基因的表達，MTT分析實驗結(jié)果表明 本siRNA能抑制癌細胞的增殖。該siRNA能夠高效、特異地抑制人POKEMON基因的表達，同 時具有較低的毒副作用。
【具體實施方式】
[0021] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚，下面將結(jié)合表格對本發(fā)明作進 一步的詳細描述。
[0022] 實施例1抑制人POKEMON基因表達的siRNA序列的合成
[0023] 從 Genebank 調(diào)取POKEMON基因（ΝΜ_015898)信息，用 http://sirna. wi. mit. edu/ home, php的在線設(shè)計軟件設(shè)計針對POKEMON基因可能有效的siRNA靶點。再通過BLAST分 析，將候選siRNA靶位點同人類基因序列進行同源性比對，排除同POKEMON基因以外的其它 人類基因序列具有較高序列同源性（16個以上堿基）的序列，以確保候選SiRNA靶位點不 會對其它人類基因發(fā)生抑制作用，而僅對POKEMON基因具有特異的抑制作用。分析設(shè)計總 共得到20對siRNA。
[0024] 實施例2RT-PCR法檢測siRNA對POKEMON基因的沉默效率
[0025] 使用Invitrogen的lipofectamine2000脂質(zhì)體進行轉(zhuǎn)染，所有操作均嚴格遵守 Invitrogen提供的操作規(guī)程。將處于對數(shù)生長期的HepG2細胞進行胰酶消化，制成細 胞懸液（細胞數(shù)約為5X IOVml)接種于6孔板中，培養(yǎng)至細胞融合度達到約40%即可用 于轉(zhuǎn)染。將siRNA干粉溶解于無 RNA酶的無菌水中，配置終濃度為20pmol/L的siRNA溶 液。轉(zhuǎn)染時，分別取10 μ L的上述一種siRNA溶液和5 μ L的lipofectamine2000分別稀釋 于250 μ L無血清培養(yǎng)液（Opti-MEM)中，并在室溫下孵育5min，然后將上述siRNA溶液和 lipofectamine2000溶液混合，復(fù)合物與室溫下靜置20min后，把500 μ L的siRNA-脂質(zhì)體 復(fù)合物與I. 5mL無血清DMEM培養(yǎng)基混合后，加到細胞培養(yǎng)板中，6h后換為10 % FBS-DMEM培 養(yǎng)基，于48h后收集細胞進行RT-PCR檢測。根據(jù)Invitrogen公司的Trizol操作說明書，抽 提總RNA。根據(jù)Promega公司的M-MLV操作說明書，將總RNA逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。（逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 體系為：4. OyL 5XRT buffer、2.0yL IOmM dNTPs、0. 5 yL RNasiruLOyL M-MLV-RTase、 3· 5 yL DEPC H2CMLOyL Total，42。。反應(yīng)lh，然后在70。。水浴鍋中水浴IOmin使逆轉(zhuǎn)錄 酶失活）。使用PCR儀（Biorad)進行擴增反應(yīng)。PCR反應(yīng)以β -actin為內(nèi)參照，Ρ0ΚΕΜ0Ν上 游引物：5' -TTGTGCTCTACCTCCAC-3 '，Ρ0ΚΕΜ0Ν 下游引物：5' -AATGCTTTCTCCGCTCTG-3 ' 擴增片段長度 418bp ; β -actin 上游引物：5' -CTATTGGCAACGAGCGGTTC-3'，β -actin 下 游引物：5 ' -CTTAGGAGTGGGGGTGGCTT-3 ^，擴增片段長度776bp。根據(jù)PCR試劑盒與擴增 儀說明，采用5(^1^反應(yīng)體系：。0嫩5 4 1^，2\?〇?1&18七6125 4 1^，25臟〇1/1]\%(：122 4 1^， Ρ0ΚΕΜ0Ν上游引物（10 ymol/L)2 yL，P0KEM0N下游引物（10 ymol/L)2 yL，β -actin上游引 物（1〇4!11〇1/1)2 4 1^0-&(^11下游引物（1(^111〇1/1)2 4 1^(1(1!12〇1(^1^反應(yīng)條件：預(yù)變 性94°C 5min ;94°C lmin，56°C 50s，72°C Imin共 30 個循環(huán)；72°C延伸 10min，4°C保溫30min。 擴增后的產(chǎn)物取3yL進行1%濃度的瓊脂糖凝膠電泳，然后在KODAK IMAGE STATI0N2000R 成像儀上進行拍照，利用SensiAnsys圖像分析軟件分析電泳條帶的灰度值。mRNA表達的相 對強度=目的條帶的灰度值/ β -actin條帶的灰度值
[0026] 對設(shè)計的20對siRNA進行上述實驗，結(jié)果顯示，其中僅有4對siRNA顯示了較好 的干擾效果，其余16對siRNA則無感染效果或明顯低于10%的抑制率。
[0027] 最終篩選得出的4對siRNA的靶點序列為SEQ ID NO : 1-4所示，該4對siRNA的 序列如下所示：
[0028] siRNAl 正義鏈：5' -CCCACCACAAACGUAGAAUUU-3'
[0029] 反義鏈：3' -UUGGGUGGUGUUUGCAUCUUA-5，
[0030] siRNA2 正義鏈：5' -GACCUUAAAUGAUUUC腳UU-3'
[0031] 反義鏈：3' -UUCUGGAAUUUACUAAAGACA-5，
[0032] siRNA3 正義鏈：5' -CUGACGUGAAGAGGUCUUAUU-3'
[0033] 反義鏈：3' -UUGACUGCACUUCUCCAGAAU-5'
[0034] siRNA4 正義鏈：5' -CUCUGUGACACACACAUCUUU-3'
[0035] 反義鏈：3' -UUGAGACACUGUGUGUGUAGA-5，
[0036] 選取與基因組中的任何序列都沒有連續(xù)16個堿基的同源性的靶序列作為陰性對 照NC，具體序列如下：
[0037] 正義鏈序列：5' -UUCUCCGAAGCUGUCACGUTT-3'
[0038] 反義鏈序列：5' -ACGUGACAGCUUCGGAGAATT-3'
[0039] 所述siRNA 1-4和NC序列中的A、G、C、U分別表示腺嘌呤核糖核苷酸、鳥嘌呤核 糖核苷酸、胞嘧啶核糖核苷酸和尿嘧啶核糖核苷酸，T表示胸腺嘧啶脫氧核苷酸。
[0040] 結(jié)果如表1所示，與轉(zhuǎn)染了陰性對照siRNA(NC-siRNA)的細胞比較，實驗組中人 HepG2細胞的Ρ0ΚΕΜ0Ν mRNA表達水平下降，4組均差異顯著（P < 0. 05)。
[0041] 表I :siRNA對人HepG2細胞的Ρ0ΚΕΜ0Ν mRNA表達水平的影響
[0042] 實驗組 ImRNA表達的相對強度|P值 _
【主權(quán)項】
1. 一種人POKEMON基因小分子干擾核糖核酸（siRNA)序列，其特征在于，所述siRNA序 列包含如下序列： siRNAl 正義鏈：5' -CCCACCACAAACGUAGAAUUU-3' 反義鏈：3' -UUGGGUGGUGUUUGCAUCUUA-5， siRNA2 正義鏈：5' -GACCUUAAAUGAUUUCUGUUU-3， 反義鏈：3' -UUCUGGAAUUUACUAAAGACA-5' siRNA3 正義鏈：5' -CUGACGUGAAGAGGUCUUAUU-3， 反義鏈：3' -UUGACUGCACUUCUCCAGAAU-5， siRNA4 正義鏈：5' -CUCUGUGACACACACAUCUUU-3' 反義鏈：3' -UUGAGACACUGUGUGUGUAGA-5'。
2. 權(quán)利要求1所述的人POKEMON基因小分子干擾核糖核酸（siRNA)序列在用于制備治 療癌癥的藥物中的用途。
3. 權(quán)利要求2所述的用途，其特征在于，所述的癌癥為乳腺癌、肝癌和淋巴瘤。
4. 一種用于治療癌癥的藥物，其特征在于：所述藥物含有如下所示的siRNA中的至少 一種： siRNAl 正義鏈：5' -CCCACCACAAACGUAGAAUUU-3' 反義鏈：3' -UUGGGUGGUGUUUGCAUCUUA-5， siRNA2 正義鏈：5' -GACCUUAAAUGAUUUCUGUUU-3， 反義鏈：3' -UUCUGGAAUUUACUAAAGACA-5' siRNA3 正義鏈：5' -CUGACGUGAAGAGGUCUUAUU-3， 反義鏈：3' -UUGACUGCACUUCUCCAGAAU-5， siRNA4 正義鏈：5' -CUCUGUGACACACACAUCUUU-3' 反義鏈：3' -UUGAGACACUGUGUGUGUAGA-5，
5. 權(quán)利要求4所述的藥物，其特征在于：所述藥物含有siRNAl與siRNA2的組合或 siRNA3與siRNA4的組合中的至少一種組合。
6. 權(quán)利要求4所述的藥物，其特征在于：所述的癌癥為肝癌。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種針對POKEMON基因的siRNA。通過自行設(shè)計得到4對針對POKEMON基因的siRNA，并將該4對siRNA進行兩兩組合試驗，并通過試驗證實，所述siRNA能取得良好的基因沉默效率、蛋白表達抑制率和腫瘤生長抑制效果，其中組合1(siRNA1與siRNA2)的腫瘤抑制效果最佳，其腫瘤抑制率為54.95％。
【IPC分類】A61P35-00, A61K31-713, C12N15-113
【公開號】CN104611333
【申請?zhí)枴緾N201410814045
【發(fā)明人】孔晶, 柳曉平
【申請人】淮陰工學(xué)院
【公開日】2015年5月13日
【申請日】2014年12月22日