專利名稱：一種基于固定化方法的脂肪酶固定方法及其在阿魏酸酯化反應(yīng)中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種以離子交換樹脂為載體的脂肪酶固定方法及其在阿魏酸酯化反 應(yīng)中的應(yīng)用，具體說涉及一種采用大孔隙鏊合型苯乙烯系離子交換樹脂D403固定脂肪酶 的方法并用該酶催化酯化反應(yīng)。
背景技術(shù)：
脂肪酶(lipase, EC3. 1. 1. 3)又稱三酰基甘油?；饷福且活愄厥獾孽；?解酶，普遍存在于動、植物和微生物中。它不僅能催化油脂水解，也能在非水相中催化酯合 成反應(yīng)、轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)、酸解反應(yīng)等反應(yīng)，是一種重要的工業(yè)用酶，廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)、紡織 和化工工業(yè)、醫(yī)藥工業(yè)、造紙行業(yè)等。隨著世界范圍內(nèi)能源短缺和環(huán)境保護的需要，生物柴 油(即脂肪酸單酯)的應(yīng)用成為關(guān)注和研究的熱點，其中生物酶法合成生物柴油已成為生 物柴油研究的重要方向，其途徑就是利用動植物及廢棄物油脂，經(jīng)脂肪酶的催化進行?；?轉(zhuǎn)移反應(yīng)。由于脂肪酶的價格昂貴，對環(huán)境變化的耐受力極低，很難重復(fù)利用，難與底產(chǎn)物 分離，因而難以實現(xiàn)生產(chǎn)工藝的連續(xù)化和自動化，限制了其大規(guī)模應(yīng)用。為了降低酶催化法 的成本，將其固定于合適的載體形成固定化脂肪酶，是解決上述不足和進一步提高固定化 脂肪酶穩(wěn)定性的有效途徑。固定化脂肪酶具有可以回收，重復(fù)使用，穩(wěn)定性高，產(chǎn)品質(zhì)量高 等優(yōu)點。許多國家如日本、美國、印度和中國等競相開展了固定化脂肪酶的研究。脂肪酶的 固定化技術(shù)不僅在工業(yè)生產(chǎn)的連續(xù)化和自動化上有重要價值，而且在生物學(xué)的基本理論研 究、在臨床醫(yī)學(xué)和促進其他生化技術(shù)的發(fā)展中都有重大的意義。 脂肪酶的固定化方法大致分為物理法和化學(xué)法。物理法主要有吸附法和包埋法； 化學(xué)法有共價偶聯(lián)法和交聯(lián)法。譚天偉的課題組以紡織物膜如尼龍、棉織物膜、纖維素膜、 PS膜、真絲、聚酯類織物膜作為固定化載體，固定化假絲酵母脂肪酶99-125合成棕櫚酸異 辛酯以及采用廉價的廢油作為原料進行酶促合成FAME (譚天偉等，中國專利，2006 ;陳必強 等，化工學(xué)報，2004 ;高靜等，化工學(xué)報，2005)。 以大孔樹脂為載體采用吸附法固定化脂肪酶，如高紅娟等以AB-8、HZ-841、HZ-802 種大孔樹脂做載體，采用物理吸附法，制備出固定化南極假絲酵母脂肪酶(CALB)，并用其 進行了拆分2-辛醇的研究(精細化工，2008)。吳茜茜等以大孔樹脂DIOI固定化中性脂 肪酶，研究了固定化條件對酶催化活性的影響，得到了最佳固定化條件(食品與發(fā)酵工業(yè)， 2008)。高陽等以不同大孔樹脂NKA-9、 AB_8、 H103、 D4020、 NKA等吸附法固定化假絲酵母 99-125脂肪酶，通過固定化條件的優(yōu)化，比較了不同樹脂的固定化效率和固定化酶的催 化效果，并在微水體系中利用大豆油合成生物柴油，在微水有機相中的應(yīng)用表明非極性樹 脂NKA是最佳的固定化栽體(生物工程學(xué)報，2006)。王衛(wèi)飛等選擇3種大孔樹脂AB-8、 HZ-802、HZ-841吸附固定化Thermomyces la皿ginosus脂肪酶，用AB-8樹脂固定化的脂肪 酶比酶活最高，達到37451U/g(王衛(wèi)飛等，中國油脂，2008)。李潯等采用大孔樹脂D3520作 載體，獲得以載體涂布法固定化脂肪酶的最適固定化條件(李潯等，應(yīng)用化工，2008)。虞英等以D311離子交換樹脂為載體，通過離子交換吸附法對Lipolase 100L脂肪酶進行固定化
(虞英等，食品與生物技術(shù)學(xué)報，2007)。唐良華等采用大孔吸附樹脂AB-8、 D-201、 D_204、
X-5，大孔吸附樹脂HZ801、 HZ802固定化擴展青霉TS414脂肪酶，建立了適于非水相中選擇
性拆分(R， S)-布洛芬的固定化方法(唐良華等，過程工程學(xué)報，2008)。 蔡宏舉等用自制大孔載體固定化脂肪酶，即以甲基丙烯酸縮水甘油酯為單體，二
乙烯基苯為聚合交聯(lián)劑，采用固液聯(lián)合致孔方式，通過本體聚合制備了具有大孔結(jié)構(gòu)的含
環(huán)氧基的多孔載體。載體上的環(huán)氧基團水解成羥基后，以戊二醛為偶聯(lián)劑，用載體偶聯(lián)法 固定化假絲酵母脂肪酶，對固定化條件進行了優(yōu)化，比較了固定化酶與游離酶的酶學(xué)參數(shù) (蔡宏舉等，過程工程學(xué)報，2007)。郭道義等采用甲基三甲氧基硅和四甲氧基硅縮水和水 解反應(yīng)形成的硅膠包埋固定化洋蔥假胞菌G63脂肪酶。研究了酶用量、醇油摩爾比、反應(yīng)溫 度、含水量對合成生物柴油的影響(郭道義等，中國油脂，2008)。豐宗清采用殼聚糖(CS) 負載在(MCM-41)介孔分子篩表面得到有機-無機復(fù)合物(CS-MCM-41)，用于制備固定化 假單胞脂肪酶，研究了磷酸鹽緩沖溶液的pH值、酶量、固定化時間和溫度等條件對固定化 脂肪酶(PSL/CS-MCM-41)催化活性的影響，得到適宜的固定化條件(豐宗清，農(nóng)業(yè)科學(xué)研 究，200S)。以殼聚糖為載體，用物理吸附固定化脂肪酶，對影響固定化過程的各種因素進行 考察，確定最優(yōu)條件，并比較了游離酶和固定化酶的最適溫度、pH、酶的熱穩(wěn)定性以及表觀 Km(李志國等，華東理工大學(xué)學(xué)報，2004)。鄭毅等采用吸附與交聯(lián)相結(jié)合的方法固定化米曲 霉脂肪酶選擇性富集魚油"_3多不飽和脂肪酸甘油酯，載體為硅藻土、交聯(lián)劑為0. 5%戊 二醛(鄭毅等，化工學(xué)報，2006)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種將大孔隙鏊合型苯乙烯系離子交換樹脂D403預(yù)處 理，并以此為載體，用于固定化吸附脂肪酶的固定方法。 本發(fā)明的另一個目的，是將經(jīng)過離子交換樹脂固定后的脂肪酶在阿魏酸酯化反應(yīng) 中的應(yīng)用。 為實現(xiàn)本發(fā)明的目的而采用的技術(shù)方案是
1、樹脂預(yù)處理 將準備裝離子交換柱使用的離子交換樹脂，先用50-6(TC熱水反復(fù)2-3次浸洗，每 隔15分鐘換水一次，浸洗時要不時攪動，換水3次后結(jié)束第一輪浸洗，重復(fù)上述浸洗步驟， 但換水間隔時間改為每隔30分鐘換水一次，總共換水4-5次，結(jié)束第二輪浸洗。
水洗后，用0. 5N NaOH以每小時1. 5倍床層體積緩慢流過樹脂，總用量為樹脂體積 的2-3倍。此后用水沖洗至出水pH值為8. 5-9. 5時，改用3倍樹脂體積、百分比濃度為5% 的NaCl溶液以每小時1. 5倍床層體積流過樹脂。再用0. 5N鹽酸以每小時1. 5倍床層體積 流過樹脂，總用量為樹脂體積的2-3倍。最后先用水沖洗至出水pH為4. 5-5. 5，再用去離子 水沖洗至出水pH值為6. 0-7. 0時，即可得到預(yù)處理的大孔吸附樹脂備用。
2、脂肪酶的固定 將1. 0g-2. 5g脂肪酶粉溶于45mL-70mL 0. lmol/L pH值為7. 5-9. 0的磷酸鹽緩沖 液中，以6000rpm離心15min，棄去沉淀，吸取40mL上清酶液于三角瓶中，加入10g-50g已經(jīng) 預(yù)處理的大孔吸附樹脂，而后將三角瓶置于3(TC恒溫振蕩搖床中平衡吸附8h-10h，搖床轉(zhuǎn)速80rpm ;過濾去除溶液，用磷酸鹽緩沖液淋洗3次，冷凍干燥后即可得大孔吸附樹脂固定 化脂肪酶。 本發(fā)明所述的脂肪酶是指黑曲霉、米曲霉、擴展青霉或洋蔥假單胞菌產(chǎn)生的脂肪 酶。 3、阿魏酸酯化反應(yīng) 阿魏酸酯化反應(yīng)可以采用雙有機試劑異辛烷/ 丁酮或以純離子液1-辛基_3-甲 基咪唑六氟磷酸鹽([Omim]PF6)為溶劑。 當(dāng)以雙有機試劑異辛烷/丁酮(體積比85 : 15)為溶劑時，在具塞三角燒瓶中分 別加入阿魏酸3. 0mg-20. Omg、油醇98mg、異辛烷/ 丁酮10ml (85 : 15， V/V)、分子篩100mg 和大孔吸附樹脂固定化脂肪酶30-300mg進行混合反應(yīng)，反應(yīng)溫度65t:，搖床轉(zhuǎn)速150rpm， 酯化反應(yīng)8天，阿魏酸酯化成阿魏酸酯。 當(dāng)以純離子液[Omim]PF6為溶劑時，在具塞三角燒瓶中分別加入阿魏酸 3. 0-20. Omg、 [Omim]PF6 1. 5mL、油醇45mg、固定化脂肪酶加量為30-200mg，反應(yīng)溫度75°C， 搖床轉(zhuǎn)速為300rpm，酯化反應(yīng)6天，阿魏酸酯化成阿魏酸酯。 采用本發(fā)明所述的方法，吸附樹脂材料易得，工業(yè)化成本低易于推廣，同時，以離 子交換樹脂為載體的脂肪酶在阿魏酸酯化反應(yīng)中，阿魏酸轉(zhuǎn)化為阿魏酸酯的轉(zhuǎn)化率最高可 達93%，具有良好的應(yīng)用前景。
具體實施例方式
下面結(jié)合具體的實施例對本發(fā)明做進一步的說明。 實施例1 1、離子交換樹脂的預(yù)處理 取400g準備裝離子交換柱的大孔隙鏊合型苯乙烯系離子交換樹脂D403，用500mL 55t:熱水浸洗，每隔約15分鐘換水一次，浸洗時要不時攪動，換水3次后，重復(fù)上述浸洗步 驟，但換水間隔時間改為每隔30分鐘換水一次，總共換水4次。水洗后，用750mL 0. 5N NaOH 緩慢流過離子交換樹脂，流速為每小時1. 5倍床層體積。然后用水沖洗，此時出水的pH為 8. 5，再用900mL 5%的NaCl溶液流過樹脂，流速為每小時1. 5倍床層體積流過。用750mL 0. 5N鹽酸流過樹脂，流速為每小時1. 5倍床層體積流過，用水沖洗至出水pH為5. 5左右。 用去離子水沖洗至出水pH值為7. 0時，即可得到預(yù)處理的大孔吸附樹脂備用。
2、脂肪酶固定化 在250mL三角瓶中，將1.0g黑曲霉脂肪酶粉溶于50mL0. lmol/L pH值8. O的磷 酸鹽緩沖液中，以6000rpm離心15min，棄去沉淀，吸取40mL上清酶液于三角瓶中加入25g 預(yù)處理的大孔吸附樹脂，而后將三角瓶置于3(TC恒溫振蕩搖床中平衡吸附10h，搖床轉(zhuǎn)速 80rpm，過濾去除溶液，用磷酸鹽緩沖液淋洗3次，冷凍干燥后即可得大孔吸附樹脂固定化 的黑曲霉脂肪酶。經(jīng)上述固定化后的黑曲霉脂肪酶回收率50X，蛋白吸附量為40mg/g。
3、催化阿魏酸酯化反應(yīng) 以混合雙有機試劑異辛烷/丁酮(體積比85 : 15)為溶齊U，在50mL具塞三角燒 瓶中分別加入阿魏酸4. 8mg、油醇98mg、異辛烷/ 丁酮10ml、4埃分子篩100mg、固定化的黑 曲霉脂肪酶100mg，反應(yīng)溫度65°C ，搖床轉(zhuǎn)速150rpm，反應(yīng)8天阿魏酸酯化成阿魏酸酯，轉(zhuǎn)化
5率為91. 8%。 實施例2 1、離子交換樹脂的預(yù)處理 同實施例1 2、脂肪酶固定化 在250mL三角瓶中，將2. 5g黑曲霉脂肪酶粉溶于70mL 0. lmol/L pH值7. 5的磷 酸鹽緩沖液中，以6000rpm離心15min，棄去沉淀，吸取40mL上清酶液于三角瓶中加入45g 預(yù)處理的大孔吸附樹脂，而后將三角瓶置于3(TC恒溫振蕩搖床中平衡吸附8h，搖床轉(zhuǎn)速 80rpm，過濾去除溶液，用磷酸鹽緩沖液淋洗3次，冷凍干燥后即可得大孔吸附樹脂固定化 的黑曲霉脂肪酶。經(jīng)上述固定化后的黑曲霉脂肪酶回收率48.8X，蛋白吸附量為42mg/g。
3、催化阿魏酸酯化反應(yīng) 以純離子液[Omim]PF6為溶劑，在具塞三角燒瓶中分別加入阿魏酸8. 2mg、 [Omim]
PF6 1. 5mL、油醇45mg、固定化的黑曲霉脂肪酶100mg，反應(yīng)溫度75。C，搖床轉(zhuǎn)速為300rpm，
反應(yīng)6天阿魏酸酯化成阿魏酸酯，轉(zhuǎn)化率達87%。 實施例3 1、離子交換樹脂的預(yù)處理 同實施例1 2、脂肪酶固定化 在250mL三角瓶中，將1.5g擴展青霉脂肪酶粉溶于65mL0. lmol/L pH值9. 0的 磷酸鹽緩沖液中，以6000rpm離心15min，棄去沉淀，吸取40mL上清酶液于三角瓶中加入 10g預(yù)處理的大孔吸附樹脂，而后將三角瓶置于3(TC恒溫振蕩搖床中平衡吸附8. 5h，搖床 轉(zhuǎn)速80rpm，過濾去除溶液，用磷酸鹽緩沖液淋洗3次，冷凍干燥后即可得大孔吸附樹脂固 定化的擴展青霉脂肪酶。經(jīng)上述固定化后的擴展青霉脂肪酶回收率52. 5%，蛋白吸附量為 47mg/g。 3、催化阿魏酸酯化反應(yīng) 以混合雙有機試劑異辛烷/丁酮(體積比85 : 15)為溶齊U，在50mL具塞三角燒
瓶中分別加入阿魏酸20. 0mg、油醇98mg、異辛烷/丁酮10mL、4埃分子篩100mg、固定化的擴
展青霉脂肪酶240mg，反應(yīng)溫度65°C ，搖床轉(zhuǎn)速150rpm，反應(yīng)8天阿魏酸酯化成阿魏酸酯，轉(zhuǎn)
化率為93.4%。 實施例4 1、離子交換樹脂的預(yù)處理 同實施例1 2、脂肪酶固定化 在250mL三角瓶中，將2. Og洋蔥假單胞菌脂肪酶粉溶于60mL0. lmol/L pH值9. 0 的磷酸鹽緩沖液中，以6000rpm離心15min，棄去沉淀，吸取40mL上清酶液于三角瓶中加入 10g預(yù)處理的大孔吸附樹脂，而后將三角瓶置于3(TC恒溫振蕩搖床中平衡吸附10h，搖床轉(zhuǎn) 速80rpm，過濾去除溶液，用磷酸鹽緩沖液淋洗3次，冷凍干燥后即可得大孔吸附樹脂固定 化的洋蔥假單胞菌脂肪酶。經(jīng)上述固定化后的洋蔥假單胞菌脂肪酶回收率50. 5%，蛋白吸 附量為46mg/g。
3、催化阿魏酸酯化反應(yīng) 當(dāng)以純離子液
PF6為溶劑時，在具塞三角燒瓶中分別加入阿魏酸15. Omg、 [Omim]PF6 1. 5mL、油醇45mg、固定化的洋蔥假單胞菌脂肪酶為50mg，反應(yīng)溫度75。C，搖床 轉(zhuǎn)速為300rpm，反應(yīng)6天，阿魏酸酯化阿魏酸酯，轉(zhuǎn)化率達88. 9% 。
權(quán)利要求
一種基于固定化方法的以離子交換樹脂為載體的脂肪酶固定方法，將離子交換樹脂，分別用熱水進行第一輪、第二輪浸洗；水洗后，先后使用NaOH溶液、NaCl溶液、鹽酸緩慢流過樹脂進行預(yù)處理，得到大孔吸附樹脂，其特征是將1.0g-2.5g脂肪酶粉溶于磷酸鹽緩沖液中，離心棄去沉淀后，吸取40mL上清酶液并加入10g-50g大孔吸附樹脂，而后置于30℃恒溫振蕩搖床中平衡吸附；過濾后得大孔吸附樹脂固定化的脂肪酶。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于固定化方法的以離子交換樹脂為載體的脂肪酶固定方法，其特征是脂肪酶的固定過程中，脂肪酶粉溶于磷酸鹽緩沖液時，磷酸鹽緩沖液的使用量為45mL-70mL，摩爾濃度為0. lmol/L， pH值為7. 5_9. 0。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于固定化方法的以離子交換樹脂為載體的脂肪酶固定方法，其特征是脂肪酶的固定過程中恒溫振蕩搖床中平衡吸附時間為8h-10h，搖床轉(zhuǎn)速80rpm ;過濾后去除溶液，用磷酸鹽緩沖液淋洗3次，冷凍干燥。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于固定化方法的以離子交換樹脂為載體的脂肪酶固定方法，其特征是所述的脂肪酶是指黑曲霉、米曲霉、擴展青霉或洋蔥假單胞菌產(chǎn)生的脂肪酶。
5. —種基于固定化方法的以離子交換樹脂為載體的脂肪酶在阿魏酸酯化反應(yīng)中的應(yīng)用，其特征是阿魏酸酯化反應(yīng)采用雙有機試劑異辛烷/ 丁酮或以純離子液1-辛基_3-甲基咪唑六氟磷酸鹽為溶劑。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的基于固定化方法的以離子交換樹脂為載體的脂肪酶在阿魏酸酯化反應(yīng)中的應(yīng)用，其特征是當(dāng)以雙有機試劑異辛烷/ 丁酮為溶劑時，異辛烷/ 丁酮的混合體積比為85 : 15，阿魏酸用量3.0mg-20.0mg，油醇用量98mg，異辛烷/丁酮用量10mL，分子篩100mg，大孔吸附樹脂固定化脂肪酶用量30-300mg，酯化反應(yīng)溫度65。C，搖床轉(zhuǎn)速150rpm，酯化反應(yīng)8天。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的基于固定化方法的以離子交換樹脂為載體的脂肪酶在阿魏酸酯化反應(yīng)中的應(yīng)用，其特征是當(dāng)以純離子液為溶劑時，加入阿魏酸用量3. 0-20. Omg，純離子液用量1. 5mL、油醇用量45mg、固定化脂肪酶用量為30-200mg，酯化反應(yīng)溫度75。C，搖床轉(zhuǎn)速為300rpm，反應(yīng)6天。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種采用大孔隙離子交換樹脂D403固定脂肪酶的方法并用該酶催化酯化反應(yīng)。技術(shù)方案是將離子交換樹脂，用熱水浸洗；水洗后，先后使用NaOH溶液、NaCl溶液、鹽酸預(yù)處理，得到大孔吸附樹脂備用；將脂肪酶粉溶于磷酸鹽緩沖液中，離心棄沉淀后，取上清酶液并加入大孔吸附樹脂，置于恒溫振蕩搖床中平衡吸附；過濾后得大孔吸附樹脂固定化的脂肪酶。阿魏酸酯化反應(yīng)可以采用雙有機試劑異辛烷/丁酮或以純離子液1-辛基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽([Omim]PF6)為溶劑；采用本發(fā)明所述的方法，吸附樹脂材料易得，同時以離子交換樹脂為載體的固定化的脂肪酶在阿魏酸酯化反應(yīng)中，阿魏酸轉(zhuǎn)化為阿魏酸酯的轉(zhuǎn)化率最高可達93％，具有良好的應(yīng)用前景。
文檔編號C12P33/00GK101712951SQ200910112638
公開日2010年5月26日 申請日期2009年10月15日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月15日
發(fā)明者劉煥珍, 王明茲, 鄭麗妃, 陳必鏈, 黃鍵 申請人:福建師范大學(xué)