一種磁性羥基磷灰石固定化脂肪酶的制備方法及在食用油脂加工中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種脂肪酶催化劑，尤其是設(shè)及一種磁性徑基憐灰石固定化脂肪酶的 制備方法，本發(fā)明還設(shè)及所制備的固定化脂肪酶在食用油脂加工中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 脂肪酶作為催化劑，因具有高效性、專一性、反應(yīng)條件溫和、環(huán)境友好等特點(diǎn)而被 廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、香料、油脂、化妝品和農(nóng)藥等行業(yè)。然而，游離脂肪酶操作穩(wěn)定性差、 易失活、不易重復(fù)使用、難W實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)過(guò)程連續(xù)化和自動(dòng)化，而且反應(yīng)后混入產(chǎn)品中，難W 分離。所W，雖然游離脂肪酶催化技術(shù)比較成熟，但真正的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用還是受到了很大的 限制。
[0003] 為了克服游離脂肪酶的缺陷，近十幾年來(lái)有不少關(guān)于生物酶改良方法的報(bào)道，其 中"酶的固定化"受到越來(lái)越多的關(guān)注。將游離酶W各種方法固定在適合的載體上，提高 了酶的穩(wěn)定性，簡(jiǎn)化了催化劑分離工藝，可W制備出能適應(yīng)更多反應(yīng)體系更廣反應(yīng)條件的 非均相生物催化劑。同時(shí)，運(yùn)也為脂肪酶酶類催化劑的重復(fù)利用提供了可能，進(jìn)一步滿足 了工業(yè)生產(chǎn)的需要。載體的選擇是固定化酶制備過(guò)程中的關(guān)鍵，目前用于負(fù)載脂肪酶的 載體有很多種，包含有無(wú)機(jī)化合物和有機(jī)聚合物等。盧英華等在無(wú)水乙醇、去離子水和氨 水的堿性體系中WTE0S為娃源、CTAB溶液為模板劑制備出介孔Si化載體歷SS，歷SS經(jīng) 過(guò)修飾后，用于脂肪酶的交聯(lián)負(fù)載，制得的成品固定化酶活性較好，且耐熱、耐酸堿能力均 遠(yuǎn)強(qiáng)于游離酶(盧英華，何彩云，姚傳義，林旺錦.固定化脂肪酶的制備方法[P].中國(guó)專 利：CN104593278A，2015-05-06)。程海明等W皮膠原為基材，與交聯(lián)劑依次在酸性條件和 中偏堿性條件下進(jìn)行交聯(lián)后，用中性緩沖溶液沖洗除去未反應(yīng)的交聯(lián)劑，所得載體的游 離醒基含量為0. 5-5. 0mmol/g，比表面積為2. 0-20m7g。然后，將脂肪酶與上述修飾載體 交聯(lián)后制得皮膠原固定化酶，該固定化酶活性在放置1個(gè)月后僅損失5%，穩(wěn)定性良好(程 海明，宋德偉，陳敏，李志強(qiáng).脂肪酶固定化載體及其固定脂肪酶的方法[P].中國(guó)專利： CN104293763A，2015-01-21)。然而，當(dāng)此類固定化酶應(yīng)用于高粘度物料體系時(shí)，在反應(yīng)結(jié)束 催化劑分離的過(guò)程中，過(guò)濾速率十分緩慢，在一定程度上制約了生產(chǎn)效率的提高。
[0004] 近年來(lái)，磁性納米粒子在各種固載化催化劑的制備中受到重視，W磁性材料為載 體制備的固體催化劑在完成催化反應(yīng)后均可在外界磁場(chǎng)的參與下快速分離和回收，從而簡(jiǎn) 化了催化劑分離工藝，大幅度提高了工業(yè)化生產(chǎn)效率。此外，利用外部磁場(chǎng)可W控制磁性固 定化酶的運(yùn)動(dòng)方式和方向，替代傳統(tǒng)的機(jī)械攬拌方式，提高了固定化酶的催化效率。劉薇 等用共沉淀法制備了化3〇4粒子，再經(jīng)月桂酸處理后，獲得平均粒徑20nm、具有超順磁性的 疏水磁性載體，將此磁性載體用于脂肪酶固定化時(shí)，固定化脂肪酶成品的穩(wěn)定性顯著提高， 且固定化脂肪酶回收便捷（劉薇，白妹，孫彥.磁性納米粒子的制備及脂肪酶的固定 化[J].過(guò)程工程學(xué)報(bào)，2004，04期：362-366)sReetz等W-系列疏水單體為原料，采 用溶膠-凝膠工藝，制備了氧化鐵多孔磁性凝膠固定化酶，酶的固定化率較高（88% )。與 自由脂肪酶相比，在異辛燒中其催化月桂酸與正辛醇醋化反應(yīng)的活性增加了 1-2倍（Reetz ΜΤ,ZontaA,VijayakrishnanV,etal.Entrapmentoflipasesinhydrophobic m曰gnetite-cont曰iningsol-gelmaterials:magneticseparationofheterogeneous biocatalysts1 [J].JournalofMolecularCatalysisAChemical, 1998, 134:251 -258)。然而，磁性粒子比表面積較小，可負(fù)載的脂肪酶數(shù)量有限。此外，由于彼此之間的磁吸 引力，磁性粒子在參與反應(yīng)時(shí)容易產(chǎn)生磁凝聚效應(yīng)，使其比表面積大幅度下降，降低了物料 與酶活性中屯、接觸的概率，從而制約了酶催化活性的表現(xiàn)。
[0005] 磁性粒子的包覆技術(shù)是一種新興的載體處理手段，將一些化學(xué)惰性較好的材料附 著在磁性粒子表面可W阻礙其發(fā)生磁凝聚，運(yùn)種核-殼型磁性載體很好的克服了"磁性粒 子分散性較差"的問(wèn)題。安紅等使用凝膠包覆法制備的磁性核殼結(jié)構(gòu)化3〇4@mcm-41載體，飽 和磁強(qiáng)度達(dá)46. 65emu/g，很好的保持了磁性納米粒子的磁分離優(yōu)勢(shì)。通過(guò)化學(xué)吸附的方法 可W將約14%的膜蛋白酶固定在化304@MCM-41上，與游離酶相比，固定化膜蛋白酶的熱穩(wěn)定 性、抑值適應(yīng)性明顯改善，且分散性良好(安紅，宋偉明，高樹(shù)剛.膜蛋白酶在磁性核殼 介孔分子篩上的固定化研究[J].食品科學(xué)，2012，23期：266-269)。此類核-殼型磁性 載體通常W致密的二氧化娃作為包覆層，與磁性納米粒子相比，其比表面積有一定增加，但 脂肪酶的負(fù)載量依然較少。此外，脂肪酶作為一種生物物質(zhì)對(duì)此類載體的適應(yīng)性有限，故催 化活性較低。
[0006] 隨著近年來(lái)食品工業(yè)的快速發(fā)展，功能性油脂和特殊使用性能的油脂制品需求量 越來(lái)越大(如人造奶油、起酥油、煎炸油和結(jié)構(gòu)脂等)。油脂醋醋交換和油脂氨化是食用油脂 加工的重要化學(xué)反應(yīng)。然而，由于氨化油脂中的反式脂肪酸會(huì)顯著增加食用者罹患屯、腦血 管疾病的風(fēng)險(xiǎn)，它的使用逐漸受到了限制。油脂醋-醋交換不產(chǎn)生反式脂肪酸，不喪失必需 脂肪酸，而且能改善油脂的食用性能，生產(chǎn)出的油脂制品具有起酥性、可塑性、延展性和風(fēng) 味好的特點(diǎn)。此外，通過(guò)油脂醋-醋交換，結(jié)合新脂肪酸，改變脂肪酸的位置分布，從而賦予 其烙化、消化、吸收和代謝功能，增加了其在食品營(yíng)養(yǎng)和治療方面的功能。油脂醋-醋交換 反應(yīng)中的催化劑發(fā)揮著重要作用，所W研究開(kāi)發(fā)新型油脂醋醋交換固定化酶催化劑，對(duì)于 食用油脂加工具有重要作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)所存在的缺陷，提供一種比表面積大，與產(chǎn) 物分離速度快、催化活性高的磁性徑基憐灰石固定化脂肪酶的制備方法，本發(fā)明還提供所 制備的固定化脂肪酶在食用油脂加工中的應(yīng)用。
[0008] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明可采取下述技術(shù)方案： 本發(fā)明所述的磁性徑基憐灰石固定化脂肪酶的制備方法包括下述步驟： 第一步，磁性徑基憐灰石的制備 將一定量的FeCls·6&0和化2SO4· 7&0放入燒杯中，加入脫氧水，機(jī)械攬拌使 化CI3· 6&0與化2SO4· 7&0完全溶解；然后緩慢滴加25%的畑3 · &0溶液于混合溶液中， 25°C恒溫?cái)埌杈鶆?；然后分別緩慢滴加化(N03)2 ·他2〇溶液和（NH4)2HP04溶液于上述反應(yīng) 體系中，繼續(xù)攬拌均勻后升溫至9(TC，待其充分反應(yīng)后將所得產(chǎn)物冷卻至室溫，陳化過(guò)夜， 對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行磁分離并用去離子水洗至中性，干燥后在200°C條件下般燒化，得到磁性徑基 憐灰石載體； 第二步，載體的功能化修飾 將第一步制備的磁性徑基憐灰石載體放入干燥的圓底燒瓶中與甲苯溶液混合均勻，然 后緩慢滴加3-氨丙基Ξ乙氧基硅烷于該反應(yīng)體系中，在甲苯的回流溫度下充分反應(yīng)；反應(yīng) 結(jié)束后用磁鐵對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行分離，分離出的產(chǎn)品用甲苯洗涂后真空干燥，得到氨基修飾的磁 性徑基憐灰石載體； 第Ξ步，脂肪酶的固定化 取氨基修飾后的磁性徑基憐灰石載體放入干燥的圓底燒瓶中，加入10%的戊二醒溶 液，25~45°C條件下在恒溫振蕩器中振蕩反應(yīng)；反應(yīng)完成后加入0. 025~0. 125mol/L的酶溶 液，繼續(xù)振蕩反應(yīng)6~14小時(shí)；待反應(yīng)結(jié)束后對(duì)固定脂肪酶進(jìn)行磁分離，用抑6. 0~8. 0的憐酸 緩沖溶液洗涂，冷凍干燥后得到磁性徑基憐灰石固定化脂肪酶成品。
[0009] 所述第Ξ步中加入的酶溶液是在抑值6. 0~8. 0、0. 2mol/L的憐酸緩沖溶液中按 0. 025~0. 125g/mL之比例添加AY脂肪酶后混配而成。
[0010] 所述第Ξ步脂肪酶固定化時(shí)的最佳條件為：憐酸緩沖溶液抑為7. 0,添加AY脂肪 酶的比例為0. 1〇肖/1^，振蕩反應(yīng)溫度為30°C，振蕩反應(yīng)時(shí)間lOh。
[0011] 本發(fā)明制備的磁性徑基憐灰石固定化脂肪酶在食用油脂加工中作為醋醋交換催 化劑應(yīng)用。
[0012] 徑基憐灰石是人體骨骼組織的主要無(wú)機(jī)組成成分，由于其具有較大的比表面積、 較好的化學(xué)惰性、無(wú)毒副作用等突出優(yōu)點(diǎn)而受到較多關(guān)注，常常被作為藥物載體廣泛的應(yīng) 用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。
[0013] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于采用徑基憐灰石包覆磁性納米粒子，由于徑基憐灰石具有大量 孔道，孔道內(nèi)壁上有大量徑基，運(yùn)種構(gòu)造便于載體的進(jìn)一步修飾W及活性物質(zhì)的固載，從而 大幅度提高了磁性粒子的比表面積，增加了脂肪酶的負(fù)載量，更好的體現(xiàn)了固定化脂肪酶 的催化作用。同時(shí)，本發(fā)明利用徑基憐灰石所具有良好的生物相容性，更好的發(fā)揮了固定化 脂肪酶的催化活性。
[0014] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)具體體現(xiàn)在： 1、磁性載體采用徑基憐灰石作為包覆層，增加了固載酶的生物相容性，提高了脂肪酶 對(duì)載體的適應(yīng)性。
[0015] 2、制備過(guò)程中，在對(duì)磁性載體進(jìn)行修飾和對(duì)脂肪酶進(jìn)行固載時(shí)，保留了大量介孔 孔道結(jié)構(gòu)和較高的比表面積，提高了催化活性位點(diǎn)的分散度，從而增加了催化效率。
[0016] 3、通過(guò)鍵合交聯(lián)法將脂肪酶束縛在孔道結(jié)構(gòu)中，有效地防止了活性組分流失，提 高了催化劑的穩(wěn)定性。
[0017] 4、在催化反應(yīng)中，可使用變換外界磁場(chǎng)的方法來(lái)增加催化劑與物料的接觸傳質(zhì)速 率與均勻度。
[0018] 5、對(duì)反應(yīng)容器無(wú)腐蝕性，對(duì)環(huán)境無(wú)污染。
[0019] 6、該催化劑可采用外界磁場(chǎng)干預(yù)的方法從反應(yīng)產(chǎn)物中快速的分離，比均相反應(yīng)工 藝有較大優(yōu)勢(shì)，提高了生產(chǎn)效率。與非磁性固定化酶相比，該固定化酶更容易分離，在某些 環(huán)境(如高粘度底物體系）中其優(yōu)勢(shì)更大。
【附圖說(shuō)明】
[0020] 圖1是本發(fā)明磁性徑基憐灰石固定化脂肪酶的制備流程圖。
[002。 圖2是本發(fā)明中磁性徑基憐灰石（HAP-丫-Fe203)的透射電鏡圖。
[0022] 圖3是本發(fā)明磁性徑基憐灰石固定化脂肪酶成品的透射電鏡圖。
[002引圖4是本發(fā)明中磁性徑基憐灰石（HAP-丫-Fe203)的氮?dú)馕胶兔摳角€。
[0024]圖5是本發(fā)明磁性徑基憐灰石固定化脂肪酶成品的氮?dú)馕胶兔摳角€。
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