一種β-半乳糖苷酶的固定化方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及酶的固定化方法，尤其涉及一種β -半乳糖苷酶的固定化方法。
【背景技術(shù)】
[0002]β -半乳糖苷酶，全名為β -D-半乳糖苷半乳糖水解酶，簡稱為乳糖酶，廣泛存在于各種動物、植物及微生物中，β -半乳糖苷酶由β -半乳糖苷酶基因編碼，由4個亞基組成的四聚體，一般可催化乳糖分解為葡萄糖和半乳糖。
[0003]半乳糖苷酶的來源豐富，主要有細(xì)菌、霉菌、酵母等微生物，植物尤其是杏、扁桃和蘋果，哺乳動物，特別是幼小哺乳動物的小腸中。其中微生物發(fā)酵制取半乳糖苷酶的生產(chǎn)成本低、產(chǎn)量高，周期短，所制取的酶源豐富，并且不受季節(jié)、地理位置的限制，在工業(yè)上得到廣泛應(yīng)用。
[0004]游離的β -半乳糖苷酶的制備方法簡單，但是生產(chǎn)成本較高，對耐酸堿穩(wěn)定性較低，從而半乳糖苷酶的應(yīng)用受到限制。酶的固定化是通過物理或者化學(xué)的方法，將酶固定在載體上，形成固定化酶，使其既保持酶的天然活性，又便于與反應(yīng)液分離，可以反復(fù)使用。固定化酶具有較高的酶活性、穩(wěn)定性高，可反復(fù)使用，耐一定強(qiáng)度的酸、堿、熱及有機(jī)溶劑。固定化β-半乳糖苷酶也有明顯的優(yōu)勢，人們對β-半乳糖苷酶的固定化技術(shù)的研究做了大量的工作。
[0005]現(xiàn)有技術(shù)中，β -半乳糖苷酶的固定化方法主要有包埋法、吸附法、載體結(jié)合法和膠聯(lián)法，常用的是單一方法或者兩種或兩種以上的方法結(jié)合使用，目前已報道的半乳糖苷酶固定化技術(shù)有纖維素包埋法，卡拉膠包埋法，聚丙烯酰胺包埋法；以殼聚糖為載體、戊二醛為交聯(lián)劑，以明膠為載體、戊二醛為交聯(lián)劑，以陽離子交換樹脂為載體、戊二醛為交聯(lián)劑相結(jié)合的方法；以凹凸棒吸附與殼聚糖包埋耦合的方法；海藻酸鈉和卡拉膠相結(jié)合的方法。但是固定化載體的機(jī)械強(qiáng)度低，容易破碎或脫落，酶與載體的結(jié)合強(qiáng)度低。并且現(xiàn)有技術(shù)中沒有涉及以細(xì)菌纖維素/海藻酸鈉復(fù)合凝膠為固定化載體制取固定化β-半乳糖苷酶的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

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[0006]本發(fā)明提供一種β -半乳糖苷酶的固定化方法，以細(xì)菌纖維素/海藻酸鈉復(fù)合凝膠為固定化載體，通過交聯(lián)劑交聯(lián)β -半乳糖苷酶與細(xì)菌纖維素/海藻酸鈉復(fù)合凝膠，增強(qiáng)復(fù)合凝膠的機(jī)械強(qiáng)度、親水性和穩(wěn)定性。
[0007]為達(dá)到上述目的，本發(fā)明通過如下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn):
[0008]—種β -半乳糖苷酶的固定化方法，以細(xì)菌纖維素/海藻酸鈉復(fù)合凝膠為固定化載體，包括固定化載體的制備和固定化半乳糖苷酶的制備，其中固定化載體的制備包括種子培養(yǎng)，細(xì)菌纖維素凝膠的制備，細(xì)菌纖維素凝膠的處理、打漿和細(xì)菌纖維素/海藻酸鈉混合液的制備。
[0009]進(jìn)一步，固定化載體的制備通過以下步驟實(shí)現(xiàn):
[0010](I)種子培養(yǎng):取活化的木醋桿菌CGMCC N0.1.1812斜面種子，接入在HS培養(yǎng)基中，在 30°C下，160r/min，培養(yǎng) 24h ；
[0011](2)細(xì)菌纖維素凝膠的制備:以2-10%的接種量接入裝有HS培養(yǎng)基的發(fā)酵容器中，30°C下培養(yǎng)2-6d，形成細(xì)菌纖維素凝膠。
[0012](3)細(xì)菌纖維素凝膠的處理、打漿:細(xì)菌纖維素凝膠用水沖洗，再將其浸泡于
0.lmol/1的堿液中，100°C煮沸20min，再用蒸餾水或0.lmol/1的醋酸溶液沖洗，直至pH值為7.0，然后細(xì)菌纖維素凝膠濕重與磷酸鹽緩沖液以質(zhì)量/體積之比為1:1的比例置于打漿機(jī)中，轉(zhuǎn)速為300-1000r/min，時間為5_15min，形成細(xì)菌纖維素乳池液；
[0013](4)細(xì)菌纖維素/海藻酸鈉混合液的制備:將海藻酸鈉和細(xì)菌纖維素乳濁液以質(zhì)量/體積之比為1:14的比例進(jìn)行混合，水浴加熱，邊加熱邊攪拌，至海藻酸鈉完全溶解，室溫至冷卻。
[0014]進(jìn)一步，固定化β -半乳糖苷酶的制備方法為:量取細(xì)菌纖維素/海藻酸鈉混合液20-30ml，與20-30ml的β -半乳糖苷酶均勻混合，然后用注射器吸取混合液滴入氯化鈣溶液中，充分反應(yīng)2-6h，洗滌、離心、真空干燥得固定化β -半乳糖苷酶。
[0015]進(jìn)一步，固定化載體的制備方法步驟(2)中，培養(yǎng)方式為靜置培養(yǎng)或振蕩培養(yǎng)。
[0016]進(jìn)一步，固定化載體的制備方法步驟(2)中，培養(yǎng)方式為靜置培養(yǎng)時，培養(yǎng)方法為:以2-10%的接種量接入裝有HS培養(yǎng)基的淺層發(fā)酵容器中，裝液面高度為l-2cm，30°C下靜置培養(yǎng)2-6d，形成細(xì)菌纖維素凝膠；培養(yǎng)方式為振蕩培養(yǎng)時，培養(yǎng)方法為:以2-10%的接種量接入裝有HS培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，裝液量為60-70 %，30 °C下振蕩培養(yǎng)2-6d，轉(zhuǎn)速為80-160rpm，形成細(xì)菌纖維素凝膠。
[0017]進(jìn)一步，固定化載體的制備方法步驟(2)培養(yǎng)方式為靜置培養(yǎng)時，淺層發(fā)酵容器為托盤、錐形瓶或燒杯。
[0018]進(jìn)一步，固定化載體的制備方法步驟⑶中，堿液為NaOH、KOH、Na2COjP K 20)3中任意一種，磷酸鹽緩沖液的濃度為0.01-0.5mol/l、PH為5.0-8.0。
[0019]進(jìn)一步，固定化載體的制備方法步驟(3)中磷酸鹽緩沖液的濃度為0.lmol/1, PH為 6.0。
[0020]進(jìn)一步，固定化半乳糖苷酶的制備方法中半乳糖苷酶的濃度為
0.25-2.0mg/ml，氯化鈣的濃度為 55.3g/L。
[0021]本發(fā)明還提供一種固定化β -半乳糖苷酶，是以細(xì)菌纖維素/海藻酸鈉復(fù)合凝膠為固定化載體，該固定化酶通過上述β-半乳糖苷酶的固定化方法制備得到。
[0022]本發(fā)明的有益效果:
[0023](I)在固定化載體細(xì)菌纖維素/海藻酸鈉復(fù)合凝膠的制備過程中，直接將打漿后的細(xì)菌纖維素添加至海藻酸鈉中，提高了固定化載體的親水性、穩(wěn)定性和機(jī)械強(qiáng)度。
[0024](2)采用本發(fā)明載體及制備方法制備得到的固定化β -半乳糖苷酶活力回收率達(dá)到70-78%，最適pH偏堿性，為pH = 7.0-7.5，熱穩(wěn)定性提高，最適溫度升高為40_45°C，米氏常數(shù)為10.5mmol/L0
【具體實(shí)施方式】
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[0025]下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明的內(nèi)容進(jìn)一步說明。
[0026]實(shí)施例1
[0027]本實(shí)施例的一種β -半乳糖苷酶的固定化方法，包括固定化載體細(xì)菌纖維素/海藻酸鈉復(fù)合凝膠的制備和固定化半乳糖苷酶的制備，步驟如下:
[0028](I)固定化載體的制備:
[0029]a.種子培養(yǎng):將購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心的木醋桿菌CGMCCN0.1.1812斜面種子，接入裝有10ml HS種子培養(yǎng)液中，在30°C下，160r/min，培養(yǎng)24h ；
[0030]b.細(xì)菌纖維素凝膠的制備:
[0031]以10% (v/v)接種量接入裝有HS發(fā)酵培養(yǎng)基的醫(yī)用托盤，醫(yī)用托盤的規(guī)格為38 X 50cm，其發(fā)酵液厚度為1cm，30 °C下在恒溫恒濕培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)6天；
[0032]c.細(xì)菌纖維素凝膠的處理、打漿:
[0033]將細(xì)菌纖維素凝膠用0.lmol/1的NaOH溶液煮沸處理6h后，用0.lmol/1的醋酸溶液清洗至細(xì)菌纖維素凝膠的PH為7.0，然后細(xì)菌纖維素凝膠濕重與濃度為0.0lmol/Ι,ΡΗ為5的磷酸鹽緩沖液以質(zhì)量/體積之比為1:1的比例置于打漿機(jī)中，置于攪拌機(jī)以300rpm的轉(zhuǎn)速打漿時間為15分鐘，形成乳濁液；
[0034]d.細(xì)菌纖維素/海藻酸鈉混合液的制備:
[0035]將海藻酸鈉和步驟c制備的細(xì)菌纖維素乳濁液以質(zhì)量/體積之比為1:14的比例進(jìn)行混合，水浴加熱，邊加熱邊攪拌，至海藻酸鈉完全溶解，室溫至冷卻；
[0036](2)固定化β -半乳糖苷酶的制備:
[0037]用濃度為0.01mol/l、PH值為8.0的磷酸鹽緩沖液溶解β -半乳糖苷酶，制備得到
0.25mg/ml的β -半乳糖苷酶溶液，取20ml的β -半乳糖苷酶溶液，加入到步驟⑴中制備得到的細(xì)菌纖維素/海藻酸鈉混合液30ml中，充分?jǐn)嚢?，混合均勻，然后?ml的注射器吸取混合液，垂直滴入濃度為55.3g/l的氯化鈣溶液中，充分反應(yīng)2小時，反應(yīng)結(jié)束后，用紗布過濾，采用濃度為0.01mol/l、PH為5.0的磷酸鹽緩沖液清洗，離心、真空干燥，得細(xì)菌纖維素/海藻酸鈣復(fù)合凝膠固定化β-半乳糖苷酶；
[0038](3)對步驟⑵中制備得到的細(xì)菌纖維素/海藻酸鈣復(fù)合凝膠固定化β -半乳糖苷酶的活力回收率