一種離子液體體系下無載體固定化脂肪酶催化制備生物柴油的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物化工技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種在離子液體體系下，利用無載體固定化脂肪酶催化制備生物柴油的方法。
技術(shù)背景
[0002]隨著石油資源的日益減少以及人們環(huán)境保護意識的增強，尋找并開發(fā)清潔的可再生能源已迫在眉睫。生物柴油是以植物油或動物油為原料制成的可再生能源，不含硫和芳烴、十六烷值高、潤滑性好，具有環(huán)境友好，資源可再生的優(yōu)點，是替代石油柴油的理想燃料，近年來備受關(guān)注。傳統(tǒng)制備生物柴油的工藝使用均相無機酸堿作為催化劑，存在著醇消耗量大，產(chǎn)物難回收，環(huán)境污染大等缺點，因此人們正在積極尋找環(huán)境友好型可替代催化劑。
[0003]利用脂肪酶的酶法制備生物柴油具有反應(yīng)條件溫和，特異性強，對環(huán)境無污染等優(yōu)勢，但直接用游離的脂肪酶作催化劑，其存在操作穩(wěn)定性差、易失活、不易重復使用、分離純化操作復雜的問題。為了解決以上問題，人們將脂肪酶固定在載體上以克服游離脂肪酶存在的缺點，固定化酶與游離酶相比穩(wěn)定性高、易從反應(yīng)系統(tǒng)中分離、能重復使用、利于實現(xiàn)自動化生產(chǎn)。因此獲得性能優(yōu)異的固定化脂肪酶對實現(xiàn)工業(yè)環(huán)境下高效利用，促進生物催化產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展具有重要意義。但目前，常用的固定化方法中大都通過將脂肪酶固定在成本高昂不溶性聚合物或無機載體上，載體的存在會“稀釋”脂肪酶的活性(在整個固定化酶重量中，載體一般占90%以上)，降低脂肪酶的結(jié)合容量和反應(yīng)能力，同時，由于脂肪酶具有一定的高級空間結(jié)構(gòu)，極易受到表面活性劑、載體表面物理性狀、化學接枝等因素的影響，對脂肪酶的空間結(jié)構(gòu)或活性中心造成不可逆的破壞，使得脂肪酶活力下降、或失活，嚴重影響了固定化脂肪酶的效果和催化效率。另外，在使用固定化脂肪酶催化劑催化酯交換反應(yīng)的時候，通常以有機溶劑作為反應(yīng)介質(zhì)，而有機溶劑毒性和易揮發(fā)性常會使酶失活和對環(huán)境造成危害。
[0004]針對上述待解決的技術(shù)問題，如若能找到一種新的無載體脂肪酶固定方法，提高固定化酶的效果，并找到能夠有效提高油脂轉(zhuǎn)化效率的新型生物酶催化反應(yīng)體系，提高酯化合成量，對生物柴油工業(yè)化制備，具有一定意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于解決目前生物柴油生產(chǎn)過程中存在的脂肪酶固定成本高，且酶的活性容易下降甚至失活、油脂轉(zhuǎn)化率低下等問題，提供一種在離子液體體系下、通過無載體固定化脂肪酶催化制備生物柴油的方法，具有酶活性高、穩(wěn)定性好、可循環(huán)利用、節(jié)約成本等優(yōu)點。
[0006]本發(fā)明上述目的通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn):
[0007]一種離子液體體系下無載體固定化脂肪酶催化制備生物柴油的方法，包括如下步驟:
[0008](I)無載體固定化脂肪酶的制備:將脂肪酶、BSA保護劑、氯化鈣和碳酸鈉溶液混合震蕩，共沉淀制備酶/碳酸鈣微球；將酶/碳酸鈣微球離心洗滌后，加入還原劑二硫蘇糖醇溶液，使酶分子間交聯(lián)自組裝成固定化酶微粒；將固定化酶微粒離心洗滌后加入EDTA溶液，震蕩反應(yīng)、離心分離后，洗滌去除碳酸鈣，得到形狀可控的多孔固定化脂肪酶微球，即為無載體固定化脂肪酶；
[0009](2)生物柴油的合成:將油脂、離子液體、無載體固定化脂肪酶、甲醇混合加入到反應(yīng)釜中進行反應(yīng)，反應(yīng)完全后的物料經(jīng)過濾回收固定化酶后，靜止分層、收集上層溶液進行減壓蒸餾，即得生物柴油；下層經(jīng)常壓蒸餾、減壓蒸餾除去甲醇和甘油，提純處理后得到的離子液體進行循環(huán)使用。
[0010]作為一種優(yōu)選方案，上述步驟(I)中，所述無載體固定化脂肪酶的制備方法具體包括如下步驟:
[0011](a)將質(zhì)量比為10?5:1的脂肪酶和牛血清白蛋白保護劑溶于濃度為0.1?
1.0mol/L、pH值為5.8?8的磷酸鹽緩沖液中，配制成濃度為10?15mg/ml的酶溶液，加入0.2?0.5mol/L氯化鈣水溶液，混合均勻后，快速加入等量、等摩爾濃度的碳酸鈉溶液，在4?25°C條件下磁力攪拌I?2min，靜置2?3h，通過共沉淀讓游離態(tài)脂肪酶分子均勻分散于碳酸鈣微粒內(nèi)部，形成穩(wěn)定的球形碳酸鈣顆粒；再滴加酶溶液體積3?4倍的飽和硫酸銨溶液沉淀劑，在4?25 °C下震蕩I?2min，靜置2?3h后，3000rpm離心洗滌3min，得到脂肪酶共沉淀顆粒；
[0012](b)向步驟(a)得到的脂肪酶共沉淀顆粒中加入50mmol/L的二硫蘇糖醇溶液，4?25°C下震蕩I?2min，靜置30?45min以打開酶分子內(nèi)的二硫鍵，然后3000rpm離心洗滌3min以去除二硫蘇糖醇，將獲得的沉淀物重新用磷酸鹽緩沖液懸浮分散，靜置2?3h，使游離的巰基在脂肪酶分子間重新形成新的二硫鍵，得到分子間交聯(lián)自組裝固定化酶微粒；
[0013](c)向步驟(b)得到的分子間交聯(lián)自組裝固定化脂肪酶顆粒中加入0.05?0.5mol/L的EDTA溶液，4?25°C下震蕩洗滌lh，再離心洗滌3?5次以去除碳酸鈣，得到無載體固定化脂肪酶。
[0014]更進一步地，所述無載體固定化脂肪酶的制備方法中，所述脂肪酶與碳酸鈣的質(zhì)量比為0.1?1:1 ;所述脂肪酶與二硫蘇糖醇的質(zhì)量比為0.01?0.1:1 ;所述EDTA與碳酸鈣的質(zhì)量比為0.05?0.1:1。
[0015]本發(fā)明所述無載體固定化脂肪酶制備過程中所用的脂肪酶可以根據(jù)實際情況進行選擇，作為一種較優(yōu)選的方案，所述脂肪酶為南極假絲酵母脂肪酶、米黑根毛霉脂肪酶、擴展青霉脂肪酶、柱狀假絲酵母脂肪酶或皺褶假絲酵母脂肪酶。
[0016]本發(fā)明所述生物柴油的合成步驟中，作為一種較優(yōu)選的方案，所述油脂為大豆油、蓖麻油、菜籽油、花生油、桐子油、棉籽油、魚油、微藻油脂中的一種或幾種的混合物。
[0017]本發(fā)明所述生物柴油的合成步驟中，作為一種較優(yōu)選的方案，所述離子液體為[Bmim] [PF6]、[Bmim] [NTf2]、[Bmim] [Tf2N]、[Emim] [Tf2N]、[Emim] [TfO]中的一種。
[0018]本發(fā)明所述生物柴油的合成步驟中，作為一種較優(yōu)選的方案，所述離子液體與油脂的質(zhì)量比為1:10?50 ;所述無載體固定化脂肪酶與油脂的質(zhì)量比為I?2.5:10 ;所述甲醇與油脂的醇油摩爾比為3?12:1。
[0019]本發(fā)明所述生物柴油的合成步驟中，作為一種較優(yōu)選的方案，所述將油脂、離子液體、無載體固定化脂肪酶、甲醇混合加入到反應(yīng)Il中進行反應(yīng)是在攪拌速率為60?160rpm的恒溫水浴搖床上，反應(yīng)溫度為30?50°C，反應(yīng)時間為24?48h。
[0020]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果:
[0021](I)本發(fā)明將脂肪酶進行濃縮沉淀，使脂肪酶相互堆積形成超分子結(jié)構(gòu)，再利用活化試劑二硫蘇糖醇(DTT)對超分子結(jié)構(gòu)進行分子間共價捆綁，獲得無需引入載體的固定化脂肪酶，該方法將脂肪酶堆積形成超分子結(jié)構(gòu)保持下來，不會破壞脂肪酶原有的三維結(jié)構(gòu)，因而脂肪酶的負載量及催化活性大大提高；
[0022](2)本發(fā)明將碳酸鈣模板劑引入到脂肪酶的固定化中，碳酸鈣具有多孔球形結(jié)構(gòu)，以其為模板(俗稱模具)能夠使肪酶超分子結(jié)構(gòu)塑造出所需規(guī)則形狀，當碳酸鈣模板去除后，脂肪酶超分子結(jié)構(gòu)仍能保持規(guī)則形狀，實現(xiàn)了脂肪酶粒徑和孔徑可控的多孔性微球的制備，且能夠改善固定化脂肪酶催化過程中，底物分子擴散限制、空間位阻等傳質(zhì)問題；
[0023](3)本發(fā)明無載體固定化脂肪酶的制備方法簡單、無需成本高昂的載體，無需特殊的儀器和設(shè)備，獲得的無載體固定化酶與傳統(tǒng)的載體固定化酶相比具有更大的催化比表面積、單位體積活性大、空間效率高、穩(wěn)定性好，與傳統(tǒng)的無載體固定化酶相比具有統(tǒng)一的尺寸，穩(wěn)定的框架，更多的孔道結(jié)構(gòu)，有利于固定化脂肪酶催化生物柴油的工業(yè)化應(yīng)用；
[0024](4)本發(fā)明采用集清潔性與安全性于一體離子液體溶劑代替?zhèn)鹘y(tǒng)的有機溶劑，作為固定化脂肪酶催化生物柴油的反應(yīng)體系，避免了傳統(tǒng)方法中有機溶劑對脂肪酶催化劑的毒害作用，提高了脂肪酶的熱穩(wěn)定性及其對底物的立體選擇性、延長了脂肪酶催化劑的重復使用性；
[0025](5)本發(fā)明將無載體固定化脂肪酶和離子液體