專利名稱：一種聚丙烯腈固定化酶的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種使用聚丙烯腈納米纖維膜固定化酶的制備方法。
背景技術(shù)：
固定化酶與游離酶相比，在保持其高效、專一及溫和的酶催化反應(yīng)特性的同時，還呈現(xiàn)貯存穩(wěn)定性高、分離回收容易、多次重復(fù)使用、操作連續(xù)可控、工藝簡便等特點。當(dāng)酶以游離的狀態(tài)存在時，一些缺陷如穩(wěn)定性差、使用壽命短等未得到改善，將酶固定在分離膜上可以有效地避免上述的不足。另外，當(dāng)酶以游離態(tài)存在時，由于酶膜表面的不利吸附而造成酶的空間結(jié)構(gòu)改變或活性位點遮蔽，而降低了酶的活性。固定化酶的材料和方法有很多種，其中納米材料固定化酶因其高載酶量受到了研究者的青睞，尤其是一些具有多孔結(jié)構(gòu)、大比表面積的載體材料有利于提高固定化酶的載酶量，并有利于底物向酶活性中心和產(chǎn)物向反應(yīng)區(qū)域以外擴散以提高固定化酶的生物活性和催化效率。具有空間連續(xù)性的納米纖維膜作為固定化酶的載體具有較大的比表面積和高空隙率，并且可以通過紡絲條件進行調(diào)控等優(yōu)點，近年來越來越引起人們的重視。[I] Mincheva R, Manolova N, Paneva D, Roshkov 1.Preparation ofpolyelectrolyte-containing nanofibers by electrospinning in the presence ofa non-1onogenic water-soluble polymer.J Bioactive Compat Polym 2005， 20:419-435.CN100371372C通過電紡丙烯腈/磷脂共聚物，得到磷脂改性的丙烯腈納米纖維，并通過物理吸附的方法將酶固定化在納米纖維膜上。美國專利US20070077567A1提供了一種首先將酶單分子層共價鍵固定化在聚(苯乙烯-馬來酸酐)納米纖維上，然后再利用戊二醛將更多的酶分子與第一層固定化好的酶分子進行交聯(lián)，在納米纖維表面形成酶聚集體。但上述固定化酶的方法存在固定化過程操作繁瑣、固定化酶催化穩(wěn)定性較低和固定化載體機械強度較低等缺點。因此有必要研制一種固定化酶過程操作簡單且具有穩(wěn)定結(jié)構(gòu)、比表面積高和固定化酶材料機械強度高 的納米纖維膜用于酶的固定化，以有效的提高固定化酶的載酶量、提高固定化酶的催化效率，同時易于從反應(yīng)體系中回收且重復(fù)使用，極大地提高酶的利用率和降低生產(chǎn)成本。

發(fā)明內(nèi)容
針對一些用于固定化酶的載體容易導(dǎo)致酶催化穩(wěn)定性降低、固定化酶過程操作繁瑣、固定化材料機械強度低和難以回收等問題，本發(fā)明的目的在于提供一種具有高比表面積、高空隙率、固定化酶過程操作簡單和固定化材料機械強度高的一種聚丙烯腈納米纖維膜固定化酶的制備方法。本發(fā)明提出的聚丙烯腈納米纖維膜固定化酶的制備方法，具體步驟如下:
將聚丙烯腈納米纖維膜浸入純乙醇溶液中，通入氯化氫氣體1(Γ30分鐘，進行活化處
理取出聚丙烯腈納米纖維膜并用pH為7.0的磷酸鹽緩沖溶液充分沖洗，以除去聚丙烯腈納米纖維膜上殘余的乙醇；然后，將活化之后的納米纖維膜浸入濃度為0.廣2毫克/毫升的酶磷酸鹽緩沖溶液中，密封后于1(T30°C、轉(zhuǎn)速為3(Γ120轉(zhuǎn)/分鐘條件下，震蕩f 5小時；從溶液中取出處理后的聚丙烯腈納米纖維膜，用去離子水反復(fù)沖洗:Γ5次，即可得到聚丙烯腈納米纖維膜固定化酶；將固定化酶的納米纖維膜浸入PH為5.0的磷酸緩沖溶液中，于4°C下儲存?zhèn)溆?。本發(fā)明中，所述酶磷酸鹽緩沖溶液上的酶為酚氧化酶、過氧化物酶、蛋白酶、淀粉酶或脂肪酶中任一種。本發(fā)明中，聚丙烯腈納米纖維膜的制備方法為:將聚丙烯腈溶于N，N- 二甲基甲酰胺溶劑中，配成重量百分比為59TlO%的溶液。然后，將配好的溶液注入靜電紡絲裝置中，在電壓為12 20千伏、噴絲頭溶液流量為0.8^1.5毫升/小時、接受距離為1(Γ20厘米的條件下進行靜電紡絲得到纖維直徑在100飛00納米的纖維膜。將得到的纖維膜放置于真空干燥箱中在30°C 50°C的條件下干燥5小時 12小時。本發(fā)明中，所述聚丙烯腈的相對分子量為12 18萬。本發(fā)明的有益效果在于:
(I)聚丙烯腈納米纖維膜的制備及其酶固定化操作過程簡單。(2)聚丙烯腈納米纖維膜具有高比表面積和高空隙率，有利于提高固定化酶的載酶量和提高固定化酶的催化穩(wěn)定性。(3)聚丙烯腈納米纖維膜作為酶的固定化載體，易于從反應(yīng)體系中回收，可以重復(fù)使用，極大地提高酶的利用率和降低生產(chǎn)成本。(4)聚丙烯腈納米 纖維膜的機械強度高，能夠反復(fù)用于反應(yīng)體系中，為酶的工業(yè)化應(yīng)用提供了基礎(chǔ)。


圖1為實施例1所得到的聚丙烯腈納米纖維膜固定化漆酶的掃描電鏡 圖2為實施例3所得到的聚丙烯腈納米纖維膜固定化辣根過氧化物酶掃描電鏡圖。
具體實施例方式以下實施實例對本發(fā)明做更詳細的描述，但所述例不構(gòu)成對本發(fā)明的限制。實施例1
聚丙烯腈納米纖維膜的制備方法為:將聚丙烯腈溶于N，N- 二甲基甲酰胺溶劑中，配成重量百分比為59TlO%的溶液。然后，將配好的溶液注入靜電紡絲裝置中，在電壓為12 20千伏、噴絲頭溶液流量為0.8^1.5毫升/小時、接受距離為1(Γ20厘米的條件下進行靜電紡絲得到纖維直徑在100飛00納米的纖維膜。將得到的纖維膜放置于真空干燥箱中在300C 50°C的條件下干燥5小時 12小時。將I克聚丙烯腈納米纖維膜浸入純乙醇溶液中，通入氯化氫氣體10分鐘。取出納米纖維膜并用pH為7.0的磷酸鹽緩沖溶液充分沖洗，以除去膜上殘余乙醇。然后，將活化之后的納米纖維膜浸入濃度為0.5毫克/毫升的漆酶磷酸鹽緩沖溶液中，密封后于15°C、轉(zhuǎn)速為50轉(zhuǎn)/分鐘條件下，震蕩2小時。從溶液中取出膜，用去離子水反復(fù)沖洗3次，即可得到聚丙烯腈納米纖維膜固定化漆酶。將固定化漆酶的納米纖維膜浸入pH為5.0的磷酸緩沖溶液中，于4°C下儲存?zhèn)溆谩膱D1中掃描電鏡的結(jié)果可以看出，上述得到的聚丙烯腈納米纖維膜固定化漆酶形貌和結(jié)構(gòu)較好，纖維直徑也比較的均勻。實施例2
將I克聚丙烯腈納米纖維膜浸入純乙醇溶液中，通入氯化氫氣體20分鐘。取出納米纖維膜并用PH為7.0的磷酸鹽緩沖溶液充分沖洗，以除去膜上殘余乙醇。然后，將活化之后的納米纖維膜浸入濃度為1.0毫克/毫升的漆酶磷酸鹽緩沖溶液中，密封后于30°C、轉(zhuǎn)速為80轉(zhuǎn)/分鐘條件下，震蕩3小時。從溶液中取出膜，用去離子水反復(fù)沖洗5次，即可得到聚丙烯腈納米纖維膜固定化漆酶。將固定化漆酶的納米纖維膜浸入pH為5.0的磷酸緩沖溶液中，于4°C下儲存?zhèn)溆谩嵤├?
將I克聚丙烯腈納米纖維膜浸入純乙醇溶液中，通入氯化氫氣體15分鐘。取出納米纖維膜并用PH為7.0的磷酸鹽緩沖溶液充分沖洗，以除去膜上殘余乙醇。然后，將活化之后的納米纖維膜浸入濃度為1.0毫克/毫升的辣根過氧化物酶磷酸鹽緩沖溶液中，密封后于20°C、轉(zhuǎn)速為60轉(zhuǎn)/分鐘條件下，震蕩1.5小時。從溶液中取出膜，用去離子水反復(fù)沖洗3次，即可得到聚丙烯 腈納米纖維膜固定化辣根過氧化物酶、。將固定化辣根過氧化物酶的納米纖維膜浸入PH為5.0的磷酸緩沖溶液中，于4°C下儲存?zhèn)溆?。從圖2中掃描電鏡的結(jié)果可以看出，上述得到的聚丙烯腈納米纖維膜固定化辣根過氧化物酶的形貌和結(jié)構(gòu)較好，纖維直徑也比較的均勻。實施例4
將I克聚丙烯腈納米纖維膜浸入純乙醇溶液中，通入氯化氫氣體25分鐘。取出納米纖維膜并用PH為7.0的磷酸鹽緩沖溶液充分沖洗，以除去膜上殘余乙醇。然后，將將活化之后的納米纖維膜浸入濃度為1.5毫克/毫升的辣根過氧化物酶磷酸鹽緩沖溶液中，密封后于30°C、轉(zhuǎn)速為120轉(zhuǎn)/分鐘條件下，震蕩3小時。從溶液中取出膜，用去離子水反復(fù)沖洗5次，即可得到聚丙烯腈納米纖維膜固定化辣根過氧化物酶。將固定化辣根過氧化物酶的納米纖維膜浸入pH為5.0的磷酸緩沖溶液中，于4°C下儲存?zhèn)溆?。實施?
將I克聚丙烯腈納米纖維膜浸入純乙醇溶液中，通入氯化氫氣體15分鐘。取出納米纖維膜并用PH為7.0的磷酸鹽緩沖溶液充分沖洗，以除去膜上殘余乙醇。然后，將活化之后的納米纖維膜浸入濃度為0.5毫克/毫升的過氧化氫酶磷酸鹽緩沖溶液中，密封后于10°C、轉(zhuǎn)速為40轉(zhuǎn)/分鐘條件下，震蕩I小時。從溶液中取出膜，用去離子水反復(fù)沖洗3次，即可得到聚丙烯腈納米纖維膜固定化辣根過氧化物酶。將固定化辣根過氧化物酶的納米纖維膜浸入pH為5.0的磷酸緩沖溶液中，于4°C下儲存?zhèn)溆?。實施?
將I克聚丙烯腈納米纖維膜浸入純乙醇溶液中，通入氯化氫氣體30分鐘。取出納米纖維膜并用PH為7.0的磷酸鹽緩沖溶液充分沖洗，以除去膜上殘余乙醇。然后，將活化之后的納米纖維膜浸入濃度為1.5毫克/毫升的過氧化氫酶磷酸鹽緩沖溶液中，密封后于25°C、轉(zhuǎn)速為80轉(zhuǎn)/分鐘條件下，震蕩3小時。從溶液中取出膜，用去離子水反復(fù)沖洗4次，即可得到聚丙烯腈納米纖維膜固定化辣根過氧化物酶。將固定化辣根過氧化物酶的納米纖維膜浸入pH為5.0的磷酸 緩沖溶液中，于4°C下儲存?zhèn)溆谩?br> 權(quán)利要求
1.一種聚丙烯腈納米纖維膜固定化酶的制備方法，其特征在于具體步驟如下 將聚丙烯腈納米纖維膜浸入純乙醇溶液中，通入氯化氫氣體1(Γ30分鐘，進行活化處理取出聚丙烯腈納米纖維膜并用pH為7. O的磷酸鹽緩沖溶液充分沖洗，以除去聚丙烯腈納米纖維膜上殘余的乙醇；然后，將活化之后的納米纖維膜浸入濃度為O.廣2毫克/毫升的酶磷酸鹽緩沖溶液中，密封后于1(T30°C、轉(zhuǎn)速為3(Γ120轉(zhuǎn)/分鐘條件下，震蕩f 5小時；從溶液中取出處理后的聚丙烯腈納米纖維膜，用去離子水反復(fù)沖洗:Γ5次，即可得到聚丙烯腈納米纖維膜固定化酶；將固定化酶的納米纖維膜浸入PH為5.0的磷酸緩沖溶液中，于4°C下儲存?zhèn)溆谩?br> 2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制備方法，其特征在于所述酶磷酸鹽緩沖溶液上的酶為酚氧化酶、過氧化物酶、蛋白酶、淀粉酶或脂肪酶中任一種。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制備方法，其特征在于聚丙烯腈納米纖維膜的制備方法為將聚丙烯腈溶于N，N- 二甲基甲酰胺溶劑中，配成重量百分比為59TlO%的溶液；然后，將配好的溶液注入靜電紡絲裝置中，在電壓為12 20千伏、噴絲頭溶液流量為O. 8^1. 5毫升/小時、接受距離為1(Γ20厘米的條件下進行靜電紡絲得到纖維直徑在10(Γ600納米的纖維膜；將得到的纖維膜放置于真空干燥箱中在30°C 50°C的條件下干燥5小時 12小時。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于所述聚丙烯腈的相對分子量為12 18萬。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種聚丙烯腈納米纖維膜固定化酶的制備方法。將聚丙烯腈聚合物溶于N,N-二甲基甲酰胺，通過靜電紡絲法制成聚丙烯腈納米纖維膜。然后，將其浸入純乙醇溶液中，通入氯化氫氣體10~30分鐘，通過化學(xué)鍵合的方法將酶固定到納米纖維膜上。本發(fā)明利用聚丙烯腈納米纖維膜的高空隙率和高機械強度，可以得到具有載酶量高、易于從反應(yīng)體系中回收、可反復(fù)多次使用納米纖維膜固定化酶。該固定化酶載體能夠提高酶的利用率和降低生產(chǎn)成本，并且具有制備過程簡單等優(yōu)點。
文檔編號D06M11/11GK103255124SQ20131018256
公開日2013年8月21日 申請日期2013年5月17日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月17日
發(fā)明者徐冉, 李風(fēng)亭, 遲成龍 申請人:同濟大學(xué)