一種氫過氧化物裂解酶的固定化方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種氫過氧化物裂解酶的固定化方法，屬于酶技術領域。
【背景技術】
[0002]氫過氧化物裂解酶HPL廣泛分布于高等植物的線粒體或葉綠體膜上，其蛋白分子表面存在著很多疏水性片段而使其緊密地連接在細胞膜上。一般植物來源HPL的制備都需要采用新鮮的原材料，易受季節(jié)影響。再者，HPL在植物組織中的活力通常都比較低，且極不穩(wěn)定，在提取分離過程中也極易失活。另外，HPL在反應過程中也極易失活，原因主要在于以下三個方面:(I)作為反應底物的氫過氧化物性質非?；顫?，具有攻擊性，易造成HPL蛋白的氧化而使酶失活；(2)HPL反應過程中產生的自由基會攻擊HPL酶，使其喪失活性；(3)反應產物(包括己醛和己烯醛)也都會對HPL活力產生較強的抑制作用。

【發(fā)明內容】

[0003]為解決上述原料季節(jié)的影響和酶容易失活的問題，本發(fā)明的目的在于:提供一種氫過氧化物裂解酶的固定化方法，該方法通過對氫過氧化物裂解酶HPL的提取，羥基磷灰石固定化HPL的制備，得到固定化氫過氧化物裂解酶，其酶的穩(wěn)定性提高，活性也大大增強，并且來源豐富，也降低了成本。
[0004]為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的技術方案為:一種氫過氧化物裂解酶的固定化方法，包括以下步驟:
(I)將菠菜切碎并與PH7.5-9.5的Tris-HCl緩沖液按照質量比為1:3-2:3的比例混合，用均質機處理2-5min ;2_5層紗布過濾之后所得濾液在2_5°C下離心20_30min，得到下層固體為M-HPL ;
上述菠菜中含有很多三硝基苯磺酸、苯甲?；酋７约皩β裙郊姿徕c，他們的存在都會對菠菜HPL產生強烈的抑制作用，將菠菜與pH 7.5-9.5的Tris-HCl緩沖液按照一定的比例混合，可確保菠菜中對HPL的活性有抑制作用的物質置換出來，用均質機處理可以使溶液充分混合，其置換更徹底，并有利于菠菜中HPL的提取。
[0005](2)將M-HPL加入磷酸鹽緩沖溶液中，2-5°C下攪拌0.5-1.5h之后于同樣溫度下離心20-30min，所得上清液經體積百分比20-40%的硫酸銨沉淀之后，所得沉淀再次溶解于上述磷酸鹽緩沖溶液中，得到濃度為0.05-0.08mmol/L游離的HPL粗酶液；
上述步驟中磷酸鹽緩沖溶液可以保持細胞的活性，防止其由于HPL放置以后變質，活性遭到破壞；硫酸銨屬于惰性物質，不易與其他生物活性物質發(fā)生反應，在純化過程中能最大程度的保護蛋白活性，另外，硫酸銨的可溶性極好，能形成高鹽環(huán)境，對于蛋白沉淀與后續(xù)的高鹽純化做準備。
[0006](3)將羥基磷灰石CHT與HPL粗酶液以質量比為1:1_1:3的比例混合，于2_5°C、100-150rpm水浴震蕩2_5h之后分離出CHT-HPL，使用上述緩沖液以及去離子水分別沖洗2-3次，直到清洗液中不含酶蛋白為止，得到固定化氫過氧化物裂解酶。
[0007]所述羥基磷灰石CHT主要用于酶的固定化，該材料價錢較低，并且可以重復使用，在酶固定化以及蛋白純化過程中都有著非常廣泛的應用。
[0008]所述實驗都在2-5 °C下完成，保持低溫主要是防止HPL變質。
[0009]上述均質機為一般壓強下的均質機，可保持和大氣壓的壓強基本一致，防止菠菜中的HPL在高壓或是低壓下破壞。
[0010]上述離心速度為50_100r/min。
[0011]上述Tris-HCl緩沖液濃度濃度為0.1-0.3mol/L。
[0012]上述磷酸鹽緩沖溶液ρΗ6.8-7.8，濃度0.03-0.05mmol/Lo
[0013]上述磷酸鹽為磷酸鈉。
[0014]同現(xiàn)有技術相比較，本發(fā)明的技術效果在于:原料來源豐富，制備方法簡單、快速、成本低廉，通過該方法制備的固定化氫過氧化物裂解酶其活性達到增強，穩(wěn)定性也提高。
【具體實施方式】
[0015]下面結合實施例對本發(fā)明作進一步詳細說明，其中以下實施例僅用于更加清楚地說明本發(fā)明的技術方案，而不能限制本發(fā)明的保護范圍。所述技術領域的普通技術人員依據(jù)以上本發(fā)明公開的內容，均可實現(xiàn)本發(fā)明的目的。
[0016]實施例1:
一種氫過氧化物裂解酶的固定化方法，包括以下步驟:
a、將1g菠菜切碎并與pH 7.5、0.3mol/L的Tris-HCl緩沖液按照質量比為1:3的比例混合，用均質機處理2min ;2層紗布過濾之后所得濾液在5 V下離心20min，得到下層固體為M-HPL ;b、將M-HPL加入pH7.2,0.05mmol/L的磷酸鈉緩沖溶液中，5°C下攪拌1.5h之后于同樣溫度下離心30min，所得上清液經體積百分比40%的硫酸銨沉淀之后，所得沉淀再次溶解于上述磷酸鈉緩沖溶液中，得到0.06mmol/L游離的HPL粗酶液；
C、將羥基磷灰石CHT與HPL粗酶液以質量比為1:3的比例混合，于5°C、150rpm水浴震蕩2h之后分離出CHT-HPL，使用上述緩沖液以及去離子水分別沖洗3次，直到清洗液中不含酶蛋白為止，得到固定化氫過氧化物裂解酶。
[0017]該方法所得的HPL相對酶活為70 %。所述酶活的測定方法參照:Long Z, KongXj Zhang C，et al.Stability of hydroperoxide lyase activity from Amaranthustricolor (Amaranthus mangostanus L.) leaves:1nfluence of selected additives.實施例2:
一種氫過氧化物裂解酶的固定化方法，包括以下步驟:
a、將15g菠菜切碎并與ρΗ9.5、0.lmol/L的Tris-HCl緩沖液按照2:3的比例混合，用均質機處理5min ;5層紗布過濾之后所得濾液在5°C下離心30min，得到下層固體為M-HPL ;
b J^M-HPL加入pH6.8,0.03mmol/L磷酸鈉緩沖溶液中，2°C下攪拌0.5h之后于同樣溫度下離心20min，所得上清液經體積百分比20%的硫酸銨沉淀之后，所得沉淀再次溶解于上述PBS溶液中，得到0.08mmol/L游離的HPL粗酶液；
C、將羥基磷灰石CHT與HPL粗酶液以質量比1:3的比例混合，于5°C、150rpm水浴震蕩5h之后分離出CHT-HPL，使用上述緩沖液以及去離子水分別沖洗3次，直到清洗液中不含酶蛋白為止，得到固定化氫過氧化物裂解酶。
[0018]該方法所得的PHL相對酶活為85 %。
[0019]實施例3:
一種氫過氧化物裂解酶的固定化方法，包括以下步驟:
a、將18g菠菜切碎并與ρΗ7.5、0.2mol/L的Tris-HCl緩沖液按照質量比1.5:3的比例混合，用均質機處理4min ;3層紗布過濾之后所得濾液在4 V下離心25min，得到下層固體為M-HPL ；
b、在M-HPL加入pH7.6,0.03mmol/L磷酸鈉緩沖溶液中，3°C下攪拌Ih之后于同樣溫度下離心25min，所得上清液經體積百分比30 %的硫酸銨沉淀之后，所得沉淀再次溶解于上述磷酸鈉緩沖溶液中，得到0.05mmol/L游離的HPL粗酶液；
C、將羥基磷灰石CHT與HPL粗酶液以1:2的比例混合，于4°C、120rpm水浴震蕩4h之后分離出CHT-HPL，使用上述緩沖液以及去離子水分別沖洗3次，直到清洗液中不含酶蛋白為止，得到固定化氫過氧化物裂解酶。
[0020]該方法所得的PHL相對酶活為75 %。
[0021]實施例4:
一種氫過氧化物裂解酶的固定化方法，包括以下步驟:
a、將15g菠菜切碎并與ρΗ8.5、0.3mol/L的Tris-HCl緩沖液按照1:3的比例混合，用均質機處理4min ；3層紗布過濾之后所得濾液在3°C下離心25min，得到下層固體為M-HPL ；
b、在M-HPL加入pH7.8,0.04mmol/L磷酸鈉緩沖溶液中，4°C下攪拌Ih之后于同樣溫度下離心25min，所得上清液經體積百分比30 %的硫酸銨沉淀之后，所得沉淀再次溶解于上述磷酸鈉緩沖溶液中，得到0.07mmol/L游離的HPL粗酶液；
C、將羥基磷灰石CHT與HPL粗酶液以質量比為1:2的比例混合，于4°C、120rpm水浴震蕩4h之后分離出CHT-HPL，使用上述緩沖液以及去離子水分別沖洗3次，直到清洗液中不含酶蛋白為止，得到固定化氫過氧化物裂解酶。
[0022]該方法所得的PHL相對酶活為72 %。
【主權項】
1.一種氫過氧化物裂解酶的固定化方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)將菠菜切碎并與PH7.5-9.5的TriS-HCl緩沖液按照質量比為1:3-2:3的比例混合，用均質機處理2-5min ;2_5層紗布過濾之后所得濾液在2_5°C下離心20_30min，得到下層固體為M-HPL ; (2)將M-HPL加入磷酸鹽緩沖溶液中，2-5°C下攪拌0.5-1.5h之后于同樣溫度下離心20-30min，所得上清液經體積百分比20-40%的硫酸銨沉淀之后，所得沉淀再次溶解于上述磷酸鹽緩沖溶液中，得到濃度為0.05-0.08mmol/L游離的HPL粗酶液； (3)將羥基磷灰石CHT與HPL粗酶液以質量比為1:1-1:3的比例混合，于2_5°C、100-150rpm水浴震蕩2_5h之后分離出CHT-HPL，使用磷酸緩沖液以及去離子水分別沖洗2-3次，直到清洗液中不含酶蛋白為止，得到固定化氫過氧化物裂解酶。2.根據(jù)權利要求1所述的氫過氧化物裂解酶的固定化方法，其特征在于:所述均質機為一般壓強下的均質機。3.根據(jù)權利要求1所述的氫過氧化物裂解酶的固定化方法，其特征在于:所述離心速度為 50-100r/mino4.根據(jù)權利要求1所述的氫過氧化物裂解酶的固定化方法，其特征在于:所述Tris-HCl緩沖液濃度濃度為0.1-0.3mol/L05.根據(jù)權利要求1所述的氫過氧化物裂解酶的固定化方法，其特征在于:所述磷酸鹽緩沖溶液 PH6.8-7.8，濃度 0.03-0.05mmol/L。6.根據(jù)權利要求1所述的氫過氧化物裂解酶的固定化方法，其特征在于:所述磷酸鹽為磷酸鈉。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種氫過氧化物裂解酶的固定化方法。該方法將新鮮菠菜切碎并與Tris-HCl緩沖液混合，并進行均質、過濾、離心，將離心后得到的固體加入一定量的磷酸鹽緩沖液，離心，所得上清液經硫酸銨沉淀之后，所得沉淀再次溶解于磷酸鹽緩沖溶液中，得到游離的HPL粗酶液；羥基磷灰石CHT與HPL粗酶液混合，分離、洗滌后得到固定化氫過氧化物裂解酶。本發(fā)明對氫過氧化物裂解酶進行了固定化，可提高酶的活性和穩(wěn)定性，原料來源豐富，可節(jié)約大量成本，有利于工業(yè)化生產。
【IPC分類】C12N11/14
【公開號】CN105002156
【申請?zhí)枴緾N201510514940
【發(fā)明人】史昌蓉
【申請人】廣西大學
【公開日】2015年10月28日
【申請日】2015年8月21日