專利名稱：：具有纖維二糖水解酶活性的多肽和編碼該多肽的多核苷酸的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及具有纖維二糖水解酶活性的分離的多肽和編碼該多肽的分離的多核苷酸。本發(fā)明還涉及包含所述多核苷酸的核酸構建體、載體和宿主細胞，以及產生和使用所述多肽的方法。相關技術描述纖維素是一種通過β-1，4_鍵共價結合的簡單糖類葡萄糖的聚合物。許多微生物產生水解β-連接的葡聚糖的酶。這些酶包括內切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和β-葡糖苷酶。內切葡聚糖酶在隨機位置消化纖維素聚合物，使其對纖維二糖水解酶的攻擊敞開。纖維二糖水解酶從纖維素聚合物的末端順序釋放纖維二糖分子。纖維二糖是水溶性β-1，4-連接的葡萄糖二聚體。β-葡糖苷酶將纖維二糖水解成葡萄糖。將纖維素原料轉化成乙醇具有以下優(yōu)勢大量原料現成可用，避免焚燒或填埋材料的合意性，和乙醇燃料的清潔性。木材、農業(yè)殘余物、草本作物和城市固體廢物被認為是用于乙醇產生的原料。這些材料主要由纖維素、半纖維素和木質素組成。一旦將纖維素轉化成葡萄糖，葡萄糖將容易地由酵母發(fā)酵成乙醇。WO2004/056981公開了來自嗜熱毛殼(Chaetomiumthermophilum)和嗜熱毀絲霉(Myceliophthorathermophila)的纖維二糖水解酶。Gusakov等，2007，BiotechnologyBioengineering97:1028_1038描述了分離自Chrysosporiumlucknowense的纖維二糖水解酶。本發(fā)明涉及具有纖維二糖水解酶活性的多肽和編碼所述多肽的多核苷酸。
發(fā)明內容本發(fā)明涉及選自下組的具有纖維二糖水解酶活性的分離的多肽(a)多肽，其包含與SEQIDNO2的成熟多肽具有至少80%同一性的氨基酸序列；(b)由如下多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸在至少高嚴緊條件下與以下雜交(i)SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列，(ii)SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列中所含的cDNA序列，或(iii)⑴或()的全長互補鏈；(c)由如下多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸包含與SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列具有至少80%同一性的核苷酸序列；和(d)變體，其包含取代、缺失和/或插入一個或多個(幾個)氨基酸的SEQIDNO2的成熟多肽。本發(fā)明還涉及選自下組的分離的多核苷酸，其編碼具有纖維二糖水解酶活性的多肽(a)多核苷酸，其編碼包含與SEQIDNO2的成熟多肽具有至少80%同一性的氨基酸序列的多肽；(b)多核苷酸，其在至少高嚴緊條件下與以下雜交(i)SEQIDN0:1的成熟多肽編碼序列，(ii)SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列中所含的cDNA序列，或(iii)⑴或()的全長互補鏈；(c)多核苷酸，其包含與SEQIDNO=I的成熟多肽編碼序列具有至少80%同一性的核苷酸序列；和(d)多核苷酸，其編碼變體，該變體包含取代、缺失和/或插入一個或多個(幾個)氨基酸的SEQIDNO2的成熟多肽。本發(fā)明還涉及包含所述多核苷酸的核酸構建體、重組表達載體、重組宿主細胞，和產生具有纖維二糖水解酶活性的多肽的方法。本發(fā)明還涉及抑制多肽在細胞中表達的方法，包括向所述細胞施用或在所述細胞中表達雙鏈RNA(dsRNA)分子，其中所述dsRNA包含本發(fā)明的多核苷酸的亞序列。本發(fā)明還涉及這樣的雙鏈抑制性RNA(dsRNA)分子，其中任選地所述dsRNA是siRNA或miRNA分子。本發(fā)明還涉及在洗滌劑和在將纖維素轉化成葡萄糖和多種物質的轉化中使用所述具有纖維二糖水解酶(活性)的多肽。本發(fā)明還涉及包含分離的多核苷酸的植物，所述多核苷酸編碼這樣的具有纖維二糖水解酶活性的多肽。本發(fā)明還涉及產生這樣的具有纖維二糖水解酶(活性)的多肽的方法，包括(a)在有益于產生所述多肽的條件下培養(yǎng)轉基因植物或植物部分，所述轉基因植物或植物部分包含編碼這樣的具有纖維二糖水解酶活性的多肽的多核苷酸；和(b)回收所述多肽。本發(fā)明還涉及包含編碼蛋白質的基因的核酸構建體，其中所述基因與編碼信號肽的核苷酸序列可操作地連接，所述信號肽包含SEQIDNO:2的氨基酸1-17或由SEQIDNO2的氨基酸1-17組成，其中所述基因對于所述核苷酸序列是外源的。附圖簡述圖IA和IB顯示嗜熱毀絲霉CBS202.75纖維二糖水解酶的基因組DNA序列和推導的氨基酸序列(分別為SEQIDNO1和2)。圖2顯示pSMail80的限制圖譜。圖3顯示pSMail82的限制圖譜。定義纖維二糖水解酶活性術語“纖維二糖水解酶活性”在本文中定義為1，4-D_葡聚糖纖維二糖水解酶(E.C.3.2.1.91)活性，其催化纖維素、纖維四糖(cellotetriose)或任何含有β_1，4-連接的葡萄糖的聚合物中l(wèi)，4-i3-D-糖苷鍵的水解，從鏈的還原端或非還原端釋放纖維二糖。就本發(fā)明而言，根據由Lever等，1972,Anal.Biochem.47=273-279；vanTilbeurgh等，1982，FEBSLetters,149152-156；vanTilbeurgh禾口Claeyssens，1985，FEBSLetters,187:283_288；和Tomme等，1988，Eur.J.Biochem.170:575_581描述的方法測定纖維二糖水解酶活性。在本發(fā)明中，可以采用Lever等的方法評定玉米秸稈(cornstover)中纖維素的水解，而vanTilbeurgh等和Tomme等的方法可以用于測定纖維二糖水解酶對于熒光二糖衍生物的活性。內切葡聚糖酶活性術語內切葡聚糖酶活性”在本文中定義為內切-1，4-(1，3;l，4)-i3-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶(endo-l，4-(1，3；1，4)-β-D-glucan4-glucanohydrolase)(Ε.C.3.2.1.4)，其催化纖維素、纖維素衍生物(例如羧甲基纖維素和羥乙基纖維素)、地衣淀粉(Iichenin)中的1，4-β-D-糖苷鍵、混合型β_1，3葡聚糖如谷類β-D-葡聚糖或木葡聚糖中的β_1，4鍵和其它含有纖維素組分的植物材料的內水解(endohydrolysis)。就本發(fā)明而言，內切葡聚糖酶活性是使用羧甲基纖維素(CMC)水解根據Ghose，1987，PureandApp1.Chem.59:257_268的方法測定的。β_葡糖苷酶活性術語“β-葡糖苷酶活性”在本文中定義為β-D-葡糖苷葡糖水解酶(Ε.C.3.2.1.21)活性，其催化末端非還原性β-D-葡萄糖殘基的水解并釋放β-D-葡萄糖。纖維二糖酶與葡糖苷酶同義。就本發(fā)明而言，葡糖苷酶活性是在25°C使用ImM4-硝基苯基-β-D-吡喃型葡糖苷作為底物在50mM檸檬酸鈉pH4.8中測定的。將一個單位的β-葡糖苷酶活性定義為在25°C、pH4.8每分鐘產生1.0微摩爾的4-硝基酚。家族6或家族GH6或Cel6術語“家族6”或“家族GH6”或“Cel6”在本文中定義為根據HenrissatB.,1991,Aclassificationofglycosylhydrolasesbasedonamino-acidsequencesimilarities,Biochem.J.280:309_316,及HenrissatB.禾口BairochΑ.,1996,Updatingthesequence-basedclassificationofglycosylhydrolases,Biochem.J.316:695_696屬于糖苷水解酶家族6的多肽。根據這樣的分類，SEQIDNO2或其成熟多肽屬于家族6并被預測為纖維二糖水解酶II。分離的多肽術語“分離的多肽”用于本文中指從來源分離的多肽。在一個優(yōu)選的方面，如通過SDS-PAGE測定的，所述多肽為至少純，優(yōu)選至少5%純，更優(yōu)選至少10%純，更優(yōu)選至少20%純，更優(yōu)選至少40%純，更優(yōu)選至少60%純，甚至更優(yōu)選至少80%純，并且最優(yōu)選至少90%純?；旧霞兊亩嚯男g語“基本上純的多肽”在本文表示多肽制備物，所述多肽制備物含有按重量計至多10%，優(yōu)選至多8%，更優(yōu)選至多6%，更優(yōu)選至多5%，更優(yōu)選至多4%，更優(yōu)選至多3%，甚至更優(yōu)選至多2%，最優(yōu)選至多1%，并且甚至最優(yōu)選至多0.5%的與其天然或重組結合的(associated)的其它多肽材料。因此，優(yōu)選所述基本上純的多肽是按存在于制備物中的全部多肽材料的重量計至少92%純，優(yōu)選至少94%純，更優(yōu)選至少95%純，更優(yōu)選至少96%純，更優(yōu)選至少96%純，更優(yōu)選至少97%純，更優(yōu)選至少98%純，甚至更優(yōu)選至少99%純，最優(yōu)選至少99.5%純，并且甚至最優(yōu)選100%純。本發(fā)明的多肽優(yōu)選是基本上純的形式，即所述多肽制備物基本上(essentially)不含與其天然或重組結合的其它多肽材料。例如，這能夠通過如下實現由公知的重組方法或由經典純化方法制備多肽。成熟多肽術語“成熟多肽”在本文中定義為具有纖維二糖水解酶活性的多肽，所述多肽以其在翻譯和任何翻譯后修飾(如N-末端加工、C-末端截短、糖基化、磷酸化等)之后的最終形式存在。在一個優(yōu)選的方面，基于預測SEQIDNO:2的氨基酸1-17是信號肽的SignalP軟件程序(Nielsen等，1997，ProteinEngineering10:1_6)，所述成熟多肽是SEQIDNO2的氨基酸18-482。成熟多肽編碼序列術語“成熟多肽編碼序列”在本文中定義為編碼具有纖維二糖水解酶活性的成熟多肽的核苷酸序列。在一個優(yōu)選的方面，基于預測核苷酸1-51編碼信號肽的SignalP軟件程序(Nielsen等，1997，ProteinEngineering10:1_6)所述成熟多肽編碼序列是SEQIDNO1的核苷酸52-1809。同一性兩個氨基酸序列之間或兩個核苷酸序列之間的相關性由參數“同一性”來描述。就本發(fā)明而言，兩個氨基酸序列之間的同一性程度是使用如EMBOSS程序包(EMBOSS:TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite,Rice等，2000,TrendsinGenetics16:276_277)(優(yōu)選版本3.0.0或更新的版本)的Needle程序中執(zhí)行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48443-453)來測定的。使用的可選參數是缺口產生罰分為10，缺口延伸罰分為0.5，和EBL0SUM62(BL0SUM62的EMBOSS版本)取代矩陣。將標記為“最長同一性”的Needle輸出(使用-nobrief選項獲得)用作百分比同一性并且是如下計算的(相同的殘基XlOO)/(比對的長度-比對中的缺口總數)就本發(fā)明而言，兩個脫氧核糖核苷酸序列之間的同一性程度使用如EMBOSS程序包(EMBOSSTheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite，Rice等，2000，見上)(優(yōu)選版本3.0.0或更新的版本)的Needle程序中執(zhí)行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，見上)測定。使用的可選參數是缺口產生罰分為10，缺口延伸罰分為0.5，和EDNAFULL(NCBINUC4.4的EMBOSS版本)取代矩陣。將標記為“最長同一性”的Needle輸出(使用-nobrief選項獲得)用作百分比同一性并且是如下計算的(相同的脫氧核糖核苷酸XlOO)/(比對的長度-比對中的缺口總數)同源序列術語“同源序列”在本文中定義為用SEQIDNO2的嗜熱毀絲霉纖維二糖水解酶或其成熟多肽，在tfasty檢索(Pearson，W.R.，1999，于BioinformaticsMethodsandProtocols，S.Misener和S.A.Krawetz編，185-219頁)中給出小于0.001的E值(或預期分數)的預測蛋白質。多肽片段術語“多肽片段”在本文定義為從SEQIDNO2的成熟多肽的氨基和/或羧基末端缺失了一個或多個(幾個)氨基酸的多肽；或其同源序列；其中所述片段具有纖維二糖水解酶活性。在一個優(yōu)選的方面，片段含有SEQIDNO:2的成熟多肽或其同源序列的至少415個氨基酸殘基，更優(yōu)選至少435個氨基酸殘基，并且最優(yōu)選至少455個氨基酸殘基。亞序列術語“亞序列(subsequence)”在本文中定義為從SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列的5'和/或3'端缺失了一個或多個(幾個)核苷酸的核苷酸序列；或其同源序列；其中所述亞序列編碼具有纖維二糖水解酶活性的多肽片段。在一個優(yōu)選的方面，亞序列含有SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列或其同源序列的至少1245個核苷酸，更優(yōu)選至少1305個核苷酸，并且最優(yōu)選至少1365個核苷酸。等位變體(allelicvariant)術語“等位變體”在本文中表示占據相同染色體基因座的基因的任何兩種或兩種以上可選形式。等位變異通過突變天然地發(fā)生，并且可導致種群內的多態(tài)性?；蛲蛔兛梢允浅聊?在編碼的多肽中無變化)或可以編碼具有改變的氨基酸序列的多肽。多肽的等位變體是由基因的等位變體編碼的多肽。分離的多核苷酸術語“分離的多核苷酸”用于本文中指從來源分離的多核苷酸。在一個優(yōu)選的方面，如通過瓊脂糖電泳測定的，所述多核苷酸為至少純，優(yōu)選至少5%純，更優(yōu)選至少10%純，更優(yōu)選至少20%純，更優(yōu)選至少40%純，更優(yōu)選至少60%純，甚至更優(yōu)選至少80%純，并且最優(yōu)選至少90%純。基本上純的多核苷酸術語“基本上純的多核苷酸”用于本文指多核苷酸制備物，其不含其它外來的或不期望的核苷酸，并且處于適合于在遺傳工程蛋白質生產體系中使用的形式。因此，基本上純的多核苷酸含有按重量計至多10%，優(yōu)選至多8%，更優(yōu)選至多6%，更優(yōu)選至多5%，更優(yōu)選至多4%，更優(yōu)選至多3%，甚至更優(yōu)選至多2%，最優(yōu)選至多1%，并且甚至最優(yōu)選至多0.5%的與其天然或重組結合的其它多核苷酸材料。然而，基本上純的多核苷酸可以包括天然存在的5’和3’非翻譯區(qū)，如啟動子和終止子。優(yōu)選基本上純的多核苷酸是按重量計至少90%純，優(yōu)選至少92%純，更優(yōu)選至少94%純，更優(yōu)選至少95%純，更優(yōu)選至少96%純，更優(yōu)選至少97%純，甚至更優(yōu)選至少98%純，最優(yōu)選至少99%，并且甚至最優(yōu)選至少99.5%純的。本發(fā)明的多核苷酸優(yōu)選為基本上純的形式，即所述多核苷酸制備物基本上(essentially)不含與其天然或重組結合的其它多核苷酸材料。所述多核苷酸可以是基因組、cDNA、RNA、半合成、合成來源的，或它們的任何組合。編碼序列當用于本文時術語“編碼序列”的意思是直接指定其蛋白產物的氨基酸序列的核苷酸序列。編碼序列的邊界通常由開讀框確定，所述開讀框通常以ATG起始密碼子或可供選擇的起始密碼子如GTG和TTG開始，并且以終止密碼子如TAA、TAG和TGA結束。編碼序列可以是DNA、cDNA或重組核苷酸序列。cDNA:術語“cDNA”在本文中定義為能夠通過反轉錄從得自真核細胞的成熟的、已剪接的mRNA分子制備的DNA分子。cDNA缺少可能存在于相應基因組DNA中的內含子序列。起始的(initial)、初級的RNA轉錄物是mRNA的前體，其通過一系列的步驟加工然后作為成熟的已剪接的mRNA出現。這些步驟包括通過稱為剪接的過程去除內含子序列。因而源自mRNA的cDNA沒有任何內含子序列。核酸構建體術語“核酸構建體”用于本文指單鏈或雙鏈的核酸分子，所述核酸分子分離自天然存在的基因，或將所述核酸分子以本來不存在于(nototherwiseexist)自然界中的方式修飾以含有核酸的區(qū)段或所述核酸分子是合成的。當所述核酸構建體含有表達本發(fā)明的編碼序列所需的調控序列時，術語核酸構建體與術語“表達盒”同義。調控序列(controlsequence)術語“調控序列”在本文定義為包括對編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸表達是必需的或有利的所有組分。各個調控序列對于編碼所述多肽的核苷酸序列可以是天然的或外源的，或各個調控序列對于彼此可以是天然的或外源的。這些調控序列包括但不限于前導序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動子、信號肽序列和轉錄終止子。最少的情況，調控序列包括啟動子和轉錄和翻譯的終止信號。調控序列可以和用于引入特異性限制位點的接頭一起提供，所述特異性限制位點促進調控序列與編碼多肽的核苷酸序列編碼區(qū)的連接?？刹僮鞯剡B接術語“可操作地連接”在本文表示這樣的構型，其中將調控序列置于相對于多核苷酸序列的編碼序列的適當位置，使得調控序列指導多肽編碼序列的表達。表達術語“表達”包括涉及多肽產生的任何步驟，其包括但不限于轉錄、轉錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾和分泌。表達載體術語“表達載體”在本文定義為線性的或環(huán)狀的DNA分子，其包含編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸，并且所述多核苷酸與提供用于其表達的額外核苷酸可操作地連接。宿主細胞如本文中所使用的術語“宿主細胞”包括任何細胞類型，所述細胞類型對于使用包含本發(fā)明多核苷酸的核酸構建體或表達載體的轉化、轉染、轉導等是易感的(susceptible)0修飾術語“修飾”在本文的意思是，對由SEQIDNO2的成熟多肽組成的多肽或其同源序列的任何化學修飾，以及對編碼這樣的多肽的DNA的遺傳操作。所述修飾可以是一個或多個(幾個)氨基酸的取代、缺失和/或插入，以及一個或多個(幾個)氨基酸側鏈的置換。人工變體當用在本文時，術語“人工變體”的意思是具有纖維二糖水解酶活性的多肽，所述多肽由表達SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列的修飾的多核苷酸序列或其同源序列的生物體產生。所述修飾的核苷酸序列通過人為干預(humanintervention)，通過修飾公開于SEQIDNO:1的多核苷酸序列或其同源序列來獲得。發(fā)明詳述具有纖維二糖水解酶活性的多肽在第一個方面，本發(fā)明涉及包含下述氨基酸序列的分離的多肽，所述氨基酸序列與SEQIDNO2的成熟多肽具有優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少65%，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少85%，甚至更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%，并且甚至最優(yōu)選至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的同一性程度，所述多肽具有纖維二糖水解酶活性(下文中的“同源多肽”)。在一個優(yōu)選的方面，所述同源多肽具有的氨基酸序列與SEQIDNO:2的成熟多肽相差十個氨基酸，優(yōu)選相差五個氨基酸，更優(yōu)選相差四個氨基酸，甚至更優(yōu)選相差三個氨基酸，最優(yōu)選相差兩個氨基酸，并且甚至最優(yōu)選相差一個氨基酸。本發(fā)明的多肽優(yōu)選包含SEQIDNO2的氨基酸序列或其等位變體；或它們的具有纖維二糖水解酶活性的片段。在一個優(yōu)選的方面，多肽包含SEQIDNO:2的氨基酸序列。在另一優(yōu)選的方面，多肽包含SEQIDNO:2的成熟多肽。在另一優(yōu)選的方面，多肽包含SEQIDNO2的氨基酸18至482，或其等位變體；或它們的具有纖維二糖水解酶活性的片段。在另一優(yōu)選的方面，多肽包含SEQIDNO2的氨基酸18至482。在另一優(yōu)選的方面，多肽由SEQIDNO:2的氨基酸序列或其等位變體，或它們的具有纖維二糖水解酶活性的片段組成。在另一優(yōu)選的方面，多肽由SEQIDNO:2的氨基酸序列組成。在另一優(yōu)選的方面，多肽由SEQIDNO2的成熟多肽組成。在另一優(yōu)選的方面，多肽由SEQIDNO2的氨基酸18至482或其等位變體，或它們的具有纖維二糖水解酶活性的片段組成。在另一優(yōu)選的方面，多肽由SEQIDNO2的氨基酸18至482組成。在第二個方面，本發(fā)明涉及具有纖維二糖水解酶活性的分離的多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在優(yōu)選極低嚴緊條件、更優(yōu)選低嚴緊條件、更優(yōu)選中嚴緊條件、更優(yōu)選中_高嚴緊條件、甚至更優(yōu)選高嚴緊條件、和最優(yōu)選非常高嚴緊條件下與下列雜交(i)SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列，(ii)SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列中所含的cDNA序列，(iii)⑴或(ii)的亞序列，或(iv)(i)、(ii)或(iii)的全長互補鏈(J.Sambrook，Ε·F.Fritsch禾口Τ·Maniatis,1989,MolecularCloning,ALaboratoryManual,第2版，ColdSpringHarbor,NewYork)。SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列的亞序列含有至少100個連續(xù)的核苷酸或優(yōu)選至少200個連續(xù)的核苷酸。而且，所述亞序列可以編碼具有纖維二糖水解酶活性的多肽片段。在一個優(yōu)選的方面，所述互補鏈是SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列的全長互補鏈。SEQIDNO1的核苷酸序列或其亞序列；以及SEQIDNO2的氨基酸序列或其片段，可用于設計核酸探針，以根據本領域內公知的方法從不同屬或種的菌株鑒定和克隆編碼具有纖維二糖水解酶活性的多肽的DNA。具體而言，可將這些探針用于根據標準的Southern印跡方法與感興趣的屬或種的基因組或cDNA雜交，以鑒定并從其中分離相應的基因。這些探針可明顯短于完整序列，但長度上應為至少14個，優(yōu)選至少25個，更優(yōu)選至少35個，并且最優(yōu)選至少70個核苷酸。然而，優(yōu)選所述核酸探針長度上是至少100個核苷酸。例如，所述核酸探針長度上可以是至少200個核苷酸，優(yōu)選至少300個核苷酸，更優(yōu)選至少400個核苷酸，或最優(yōu)選至少500個核苷酸。甚至可以使用更長的探針，例如，長度是優(yōu)選至少600個核苷酸，更優(yōu)選至少700個核苷酸，甚至更優(yōu)選至少800個核苷酸，或最優(yōu)選至少900個核苷酸的核酸探針。DNA和RNA探針二者均可使用。通常將探針標記以探測相應的基因(例如，用32P、3H、35S、生物素或抗生物素蛋白(avidin)標記)。將這些探針包含于本發(fā)明中。因而，可從由這些其它菌株制備的基因組DNA或cDNA文庫中篩選DNA，所述DNA與上述探針雜交并且編碼具有纖維二糖水解酶活性的多肽?？梢酝ㄟ^瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳，或通過其它分離技術分離來自這些其它菌株的基因組或其它DNA?？梢詫碜晕膸斓腄NA或分離的DNA轉移至硝化纖維素(nitrocellulose)或其它合適的載體材料并且固定于其上。為了鑒定與SEQIDNO:1或其亞序列同源的克隆或DNA，將所述載體材料優(yōu)選用在Sounthern印跡中。就本發(fā)明而言，雜交表示核苷酸序列在非常低至非常高的嚴緊條件下與標記的核酸探針雜交，所述核酸探針對應于SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列；SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列中所含的cDNA序列；其全長互補鏈；或其亞序列?？墒褂美鏧射線片(X-rayfilm)檢測在這些條件下與核酸探針雜交的分子。在一個優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO:1的核苷酸52-1809。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是編碼SEQIDNO:2的多肽的多核苷酸序列，或其亞序列。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO:1。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是包含在大腸桿菌(E.coli)NRRLB-50059中的質粒pSMail82中含有的多核苷酸序列，其中所述其多核苷酸序列編碼具有纖維二糖水解酶活性的多肽。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是包含在大腸桿菌NRRLB-50059中的質粒pSMail82中含有的成熟多肽編碼區(qū)。對于長度至少100個核苷酸的長探針，將非常低至非常高的嚴緊條件定義為在42°C，在5XSSPE、0.3%SDS、200yg/ml已剪切并且變性的鮭精DNA中，并且對于非常低和低嚴緊性為25%的甲酰胺、對于中和中-高嚴緊性為35%的甲酰胺、或對于高和非常高嚴緊性為50%的甲酰胺，根據標準的Southern印跡步驟進行預雜交和雜交最佳12至24小時。對于長度為至少100個核苷酸的長探針，使用2XSSC、0.2%SDS優(yōu)選在45°C(非常低嚴緊性)，更優(yōu)選在50°C(低嚴緊性)，更優(yōu)選在55°C(中嚴緊性)，更優(yōu)選在60°C(中-高嚴緊性)，甚至更優(yōu)選在65°C(高嚴緊性)，并且最優(yōu)選在70°C(非常高嚴緊性)將載體材料最終洗滌三次，每次15分鐘。對于長度大約15個核苷酸至大約70個核苷酸的短探針，將嚴緊條件定義為在比使用根據Bolton和McCarthy計算法(1962，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA48:1390)計算得出的Tm低大約5°C至大約10°C，在0.9MNaCl，0.09MTris-HClpH7.6,6mMEDTA，0.5%NP-40，IXDenhardt溶液，ImM焦磷酸鈉(sodiumpyrophosphate)，ImM舞酸二Mi內(sodiummonobasicphosphate),0.ImMATP和0.2mg每ml的酵母RNA中，根據標準的Southern印跡步驟進行預雜交、雜交和雜交后洗滌最佳12至24小時。對于長度大約15個核苷酸至大約70個核苷酸的短探針，將所述載體材料在6XSSC加0.1%SDS中洗滌一次15分鐘，并用6XSSC在比計算得出的T1Jg5°C至10°C的溫度洗滌兩次，每次15分鐘。在第三個方面，本發(fā)明涉及由如下多核苷酸編碼的具有纖維二糖水解酶活性的分離的多肽，所述多核苷酸包含與SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列具有優(yōu)選至少60%、更優(yōu)選至少65%、更優(yōu)選至少70%、更優(yōu)選至少75%、更優(yōu)選至少80%、更優(yōu)選至少85%、甚至更優(yōu)選至少90%、最優(yōu)選至少95%、并且甚至最優(yōu)選至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%同一性程度的核苷酸序列或由所述核苷酸序列組成，其編碼活性多肽。參見本文多核苷酸部分。在第四個方面，本發(fā)明涉及人工變體，所述人工變體包含取代、缺失和/或插入一個或多個(或幾個)氨基酸的SEQIDNO:2的成熟多肽；或其同源序列。優(yōu)選地，氨基酸改變對性質是較不重要的(ofaminornature)，即保守的氨基酸取代或插入，其不顯著影響蛋白質的折疊和/或活性；通常為1至大約30個氨基酸的小缺失；小的氨基或羧基末端延伸，如氨基末端甲硫氨酸殘基；多至大約20-25個殘基的小接頭肽；或通過改變凈電荷或其它功能來促進純化的小延伸，如多組氨酸序列(poly-histidinetract)、抗原表位(antigenicepitope)或結合域(bindingdomain)。保守取代的實例是在以下組之內堿性氨基酸組(精氨酸、賴氨酸和組氨酸)、酸性氨基酸組(谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基酸組(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸組(亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)、芳族氨基酸組(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸組(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸)。通常不改變比活性(specificactivity)的氨基酸取代是本領域已知的，并且由例如H.Neuratt和PR.L.Hill,1979，于TheProteins,AcademicPress,NewYork中描述。最普遍發(fā)生的交換是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。除了20個基本氨基酸，非基本氨基酸(如4-羥脯氨酸、6-N-甲基賴氨酸、2_氨基異丁酸、異纈氨酸和α-甲基絲氨酸)可以取代野生型多肽的氨基酸殘基。有限數量的非保守氨基酸、不由遺傳密碼編碼的氨基酸和非天然氨基酸可以取代氨基酸殘基。“非天然氨基酸”在蛋白質合成后已經過修飾，和/或在它們的側鏈具有不同于基本氨基酸的化學結構。非天然氨基酸能夠以化學方法合成，并且優(yōu)選是商業(yè)上可得到的，包括六氫吡啶羧酸(pipecolicacid)、噻唑燒羧酸(thiazolidinecarboxylicacid)、脫氫脯氨酸、3-和4-甲基脯氨酸，和3，3-二甲基脯氨酸。可供選擇的是，氨基酸改變具有這樣的性質以使多肽的物理化學性質改變。例如，氨基酸改變可改進多肽的熱穩(wěn)定性，改變底物特異性，改變最適PH等。能夠根據本領域已知的方法，例如定位誘變或丙氨酸分區(qū)誘變法(Cunningham和Wells，1989，Science244:1081_1085)來鑒定親本多肽中的必需氨基酸。在后一技術中，將單一丙氨酸突變引入到分子中的每個殘基，并且測試所得突變分子的生物活性(即，纖維二糖水解酶活性)以鑒定對于所述分子的活性關鍵的氨基酸殘基。同樣參見Hilton等，1996，J.Biol.Chem.271:4699_4708。酶的活性部位或其它的生物相互作用也能夠通過結構的物理分析而確定，如通過以下這些技術如核磁共振、晶體學、電子衍射或光親和標記，連同推定的接觸位點氨基酸的突變來確定。參見例如deVos等，1992，Science255306-312；Smith等，1992，J.Mol.Biol.224:899_904；Wlodaver等，1992，FEBSLett.30959-64。必需氨基酸的同一性也能夠從與多肽的同一性分析來推斷，所述多肽與根據本發(fā)明的多肽相關。能夠使用已知的誘變、重組和/或改組(shuffling)方法，然后是有關的篩選方法，例如那些由Reidhaar-Olson和Sauer，1988，Science241:53_57；Bowie和Sauer，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:2152_2156；WO95/17413；或W095/22625公開的那些方法來進行并測試單個或多個氨基酸取代、缺失、和/或插入。能夠使用的其它方法包括易錯PCR、噬菌體展示(例如，Lowman等，1991，Biochem.3010832-10837；美國專利5，223，409號；WO92/06204)和區(qū)域定向的誘變(Derbyshire等，1986，Gene46145；Ner等，1988，DNA7127)。誘變/改組方法能夠與高通量、自動化的篩選方法組合以檢測由宿主細胞表達的克隆的、誘變的多肽的活性(Ness等，1999，NatureBiotechnology17:893-896)。能夠從宿主細胞回收編碼活性多肽的誘變的DNA分子，并且使用本領域內標準方法快速測序。這些方法允許快速確定感興趣的多肽中單個氨基酸殘基的重要性，并且能夠應用于未知結構的多肽。SEQIDNO2的成熟多肽如SEQIDNO2的氨基酸18-482的氨基酸取代、缺失和/或插入的總數是10，優(yōu)選9，更優(yōu)選8，更優(yōu)選7，更優(yōu)選至多6，更優(yōu)選5，更優(yōu)選4，甚至更優(yōu)選3，最優(yōu)選2，并且甚至最優(yōu)選1。具有纖維二糖水解酶活性的多肽的來源本發(fā)明的多肽可以獲得自任何屬的微生物。就本發(fā)明而言，用于本文與給定的來源有關的術語“獲得自”，意思是核苷酸序列編碼的多肽由所述來源產生，或由其中插入了來自所述來源的核苷酸序列的菌株產生。在一個優(yōu)選的方面，獲得自給定來源的多肽是胞外分泌的。本發(fā)明具有纖維二糖水解酶活性的多肽可以是細菌多肽。例如，所述多肽可以是革蘭氏陽性細菌多肽例如芽孢桿菌屬(Bacillus)、鏈球菌屬(Str印tococcus)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、腸球菌屬(Enterococcus)>？LIf菌屬(Lactobacillus)、乳球菌屬(Lactococcus)、梭菌屬(Clostridium)、地芽孢桿菌屬(Geobacillus)或海洋芽孢桿菌屬(Oceanobacillus)多肽，所述多肽具有纖維二糖水解酶活性；或革蘭氏陰性細菌多肽，如大腸桿菌、假單胞菌屬(Pseudomonas)、沙門氏菌屬(Salmonella)、彎曲桿菌屬(Campylobacter)、螺桿菌屬(Helicobacter)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、梭桿菌屬(Fusobacterium)、泥桿菌屬(Ilyobacter)、奈瑟氏菌屬(Neisseria)或脲原體屬(Ureaplasma)多肽，所述多肽具有纖維二糖水解酶活性。在一個優(yōu)選的方面，所述多肽是具有纖維二糖水解酶活性的嗜堿芽孢桿菌(Bacillusalkalophilus)>l^^^^ffelf|if(Bacillusamyloliquefaciens)、^Hf包|f菌(Bacillusbrevis)、環(huán)狀芽孢桿菌(Bacilluscirculans)、克勞氏芽孢桿菌(Bacillusclausii)、凝結芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)、堅強芽孢桿菌(Bacillusfirmus)、燦爛芽孢桿菌(Bacilluslautus)、遲緩芽孢桿菌(Bacilluslentus)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)、巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)、短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)、嗜熱月旨肪芽孢桿菌(Bacillusstearothermophilus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)或蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)多肽。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽是具有纖維二糖水解酶活性的似馬鏈球菌(Streptococcusequisimilis)、酉良月農鏈球菌(Streptococcuspyogenes)、乳房鏈球菌(Streptococcusuberis)或馬鏈球菌獸痕亞禾中(Streptococcusequisubsp.Zooepidemicus)多月太。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽是具有纖維二糖水解酶活性的不產色鏈霉菌(Streptomycesachromogenes)、除蟲鏈霉菌(Streptomycesavermitilis)、天藍色鏈霉菌(Streptomycescoelicolor)、灰色鏈霉菌(Streptomycesgriseus)或淺青紫鏈霉菌(Streptomyceslividans)多月太。本發(fā)明具有纖維二糖水解酶活性的多肽也可以是真菌多肽，并且更優(yōu)選酵母多肽如念珠菌屬(Candida)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、畢赤酵母屬(Pichia)、酵母屬(Saccharomyces)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)或西洋蓍霉屬(Yarrowia)多肽，其具有纖維二糖水解酶活性；或更優(yōu)選絲狀真菌多肽如枝頂孢霉屬(Acremonium)、傘菌屬(Agaricus)、鏈格孢屬(Alternaria)、曲霉屬(Aspergillus)、短梗霉屬(Aureobasidium)、Botryospaeria、擬賭菌屬(Ceriporiopsis)、毛_殼屬(Chaetomidium)、金抱子菌屬(Chrysosporium)、麥角菌屬(Claviceps)、方寵抱腔菌屬(Cochliobolus)、Coprinopsis、Coptotermes、棒囊殼屬(Corynascus)、隱叢赤殼屬(Cryphonectria)、隱球菌屬(Cryptococcus)、色二胞屬(Diplodia)、黑耳屬(Exidia)、線黑粉酵母屬(Filibasidium)、鐮孢屬(Fusarium)、赤霉屬(Gibberella)、全毛蟲目(Holomastigotoides)、腐質霉屬(Humicola)、耙菌屬(Irpex)、香菇屬(Lentinula)、小球腔菌屬(L印tospaeria)、梨孢菌屬(Magnaporthe)、Melanocarpus、多孑L菌屬(Meripilus)、毛毒屬(Mucor)、毀絲毒屬(Myceliophthora)、新考瑪脂霉屬(Neocallimastix)、脈孢菌屬(Neurospora)、擬青霉屬(Paecilomyces)、青霉屬(PeniciIlium)、平革菌屬(Phanerochaete)、瘤胃壺菌屬(Piromyces)、Poitrasia^{段M盤菌屬(Pseudoplectania)、Pseudotrichonympha^根毛霉屬(Rhizomucor)、裂褶菌屬(Schizophyllum)、柱頂孢屬(Scytalidium)、踝節(jié)菌屬(Talaromyces)、嗜熱子囊菌屬(Thermoascus)、梭孢殼屬(Thielavia)、彎頸霉屬(Tolypocladium)、木霉屬(Trichoderma)、長毛盤菌屬(Trichophaea)、輪枝孢屬(Verticillium)、草菇屬(Volvariella)或炭角菌屬(Xylaria)多肽，其具有纖維二糖水解酶活性。在一個優(yōu)選的方面，所述多肽是具有纖維二糖水解酶活性的卡爾酵母(Saccharomycescarlsbergensis)、酉良酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、糖化酵母(Saccharomycesdiastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomycesdouglasii)、克魯弗酵母(Saccharomyceskluyveri)、諾地酵母(Saccharomycesnorbensis)或卵形酵母(Saccharomycesoviformis)多月太。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽是具有纖維二糖水解酶活性的解纖維枝丁頁抱霉(Acremoniumcellulolyicus)、棘抱曲霉(Aspergillusaculeatus)、^^ft#(Aspergillusawamori).ft#(Aspergillusfumigatus).1ft#(Aspergillusfoetidus)、曰本曲霉(Aspergillusjaponicus)、構巢曲霉(Aspergillusnidulans)、漂曲霉(Aspergillusniger)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、嗜角質金抱子菌(Chrysosporiumkeratinophilum)、Chrysosporiumlucknowense、熱帶金抱子菌(Chrysosporiumtropicum)、Chrysosporiummerdarium、Chrysosporiuminops、租金抱子菌(Chrysosporiumpannicola)、昆士蘭金抱子菌(Chrysosporiumqueenslandicum)、褐薄金抱子菌(Chrysosporiumzonatum)、桿抱狀德抱(Fusariumbactridioides)、禾谷鐮孢(Fusariumcerealis)、庫威鐮孢(Fusariumcrookwellense)、大刀鐮孢(Fusariumculmorum)、禾本禾斗德抱(Fusariumgraminearum)、禾赤德抱(Fusariumgraminum)、異抱德抱(Fusariumheterosporum)、合歡木德抱(Fusariumnegundi)、尖德抱(Fusariumoxysporum)、多枝德抱(Fusariumreticulatum)、粉紅德抱(Fusariumroseum)、接骨木德抱(Fusariumsambucinum)、膚色德抱(Fusariumsarcochroum)、擬分枝抱德抱(Fusariumsporotrichioides)、硫色德抱(Fusariumsulphureum)、圓德抱(Fusariumtorulosum)、擬絲抱德抱(Fusariumtrichothecioides)、壤片德抱(Fusariumvenenatum)、灰腐質霉(Humicolagrisea)、特異腐質霉(Humicolainsolens)、疏棉狀腐質毒(Humicolalanuginosa)、白囊奉巴菌(Irpexlacteus)、米M毛毒(Mucormiehei)、嗜熱毀絲霉、粗糙脈孢菌(Neurosporacrassa)、繩狀青霉(Penicilliumfunieulosum)、產紫青霉(Penicilliumpurpurogenum)、黃抱平革菌(Phanerochaetechrysosporium)、Thielaviaachromatica、Thielaviaalbomyces、Thielaviaalbopilosa、Thielaviaaustraleinsis、Thielaviafimeti、微抱梭抱殼(Thielaviamicrospora)、卵抱梭抱殼(Thielaviaovispora)、Thielaviaperuviana^罾fe冑(Thielaviaspededonium)、毛梭抱殼(Thielaviasetosa)、Thielaviasubthermophila、土生梭抱霉(Thielaviaterrestris)、哈茨木毒(Trichodermaharzianum)、康寧木毒(Trichodermakoningii)、長枝木霉(Trichodermalongibrachiatum)、里氏木霉(Trichodermareesei)或綠色木霉(Trichodermaviride)多月太。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽是嗜熱毀絲霉、Myceliophthorafergusii、Myceliophthorahinnulea、Myceliophthorahistoplasmoides、Myceliophthoraindica、藤黃毀絲霉(Myceliophthoralutea)、硫磺毀絲霉(Myceliophthorasulphurea)、嗜熱毀絲霉或Myceliophthoravellerea多月太。在一個更優(yōu)選的方面，所述多肽是具有纖維二糖水解酶活性的嗜熱毀絲霉多肽。在一個優(yōu)選的方面，所述多肽是具有纖維二糖水解酶活性的嗜熱毀絲霉CBS202.75多肽，例如，包含SEQIDNO2的成熟多肽的多肽。可理解的是對于前述的種，本發(fā)明包含完全和不完全階段(perfectandimperfectstates)，和其它分類學的等同物(equivalent)，例如無性型(anamorph)，而無論它們已知的種名。本領域熟練技術人員會容易地識別適合的等同物的身份(identity)。這些種的菌株在許多培養(yǎng)物保藏機構對于公眾能夠容易地獲得，所述保藏機構如美國典型培養(yǎng)物保藏中心(theAmericanTypeCultureCollection)(ATCC)、德意志微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中心(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH)(DSM)、真菌菌種保藏中心(CentraalbureauVoorSchimmelcultures)(CBS)和農業(yè)研究機構專利培養(yǎng)物保藏中心北區(qū)研究中心(AgriculturalResearchServicePatentCultureCollection,NorthernRegionalResearchCenter)(NRRL)。此外，可以使用上述的探針從其它來源，包括從自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分離的微生物鑒定和獲得這些多肽。用于從天然生境(habitat)分離微生物的技術是本領域內公知的。然后可通過相似地篩選這種微生物的基因組或cDNA文庫來獲得所述多核苷酸。一旦用所述探針檢測到編碼多肽的多核苷酸序列，就能夠使用本領域普通技術人員熟知的技術將所述多核苷酸分離或克隆(參見，例如，Sambrook等，1989，見上)。本發(fā)明的多肽還包括融合多肽或可切割的融合多肽，其中將另外的多肽融合到所述多肽或其片段的N末端或C末端。通過將編碼另一個多肽的核苷酸序列(或其部分)融合于本發(fā)明的核苷酸序列(或其部分)來產生融合的多肽。產生融合多肽的技術是本領域已知的，并包括連接編碼多肽的編碼序列以使它們符合讀框，并且使融合多肽的表達在相同啟動子和終止子的控制下。融合多肽還可以包括切割位點。一旦分泌了融合多肽，就切割所述位點，從融合蛋白質釋放具有纖維二糖水解酶活性的多肽。切割位點的實例包括，但不限于，編碼二肽Lys-Arg的Kex2位點(Martin等，2003，J.Ind.Microbiol.Biotechnol.3568-76；Svetina，2000，J.Biotechnol.76245-251；Rasmussen-ffilson1997,Appl.Environ.Microbiol.633488-3493；Ward等，1995,Biotechnology13498-503；和Contreras等，1991，Biotechnology9:378_381)；Ile_(Glu或Asp)-Gly-Arg位點，其在精氨酸殘基后通過因子Xa蛋白酶切割(Eaton等，1986，Biochem.25505-512)；Asp-Asp-Asp-Asp-Lys位點，其在賴氨酸后通過腸激酶切割(Collins-Racie等，1995，Biotechnology13:982_987)；His-Tyr-Glu位點或His-Tyr-Asp位點，其通過GenenaseI切割(Carter等，1989,Proteins-Structure,Function,andGenetics6:240_248)；Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser位點，其在Arg后通過凝血酶切割(Stevens，2003，DrugDiscoveryWorld435-48)；Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly位點，其在Gin后通過TEV蛋白酶切割(Stevens，2003，見上)；和Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro位點，其在Gin后通過遺傳工程形式的人鼻病毒3C蛋白酶切割(Stevens，2003，見上)。多核苷酸本發(fā)明還涉及分離的多核苷酸，其包含編碼本發(fā)明具有纖維二糖水解酶活性的多肽的核苷酸序列，或由該核苷酸序列組成。在一個優(yōu)選的方面，核苷酸序列包含SEQIDN0:1或由SEQIDNO:1組成。在另一更優(yōu)選的方面，核苷酸序列包含大腸桿菌NRRLB-50059中所含質粒pSMail82中的序列，或由該序列組成。在另一優(yōu)選的方面，核苷酸序列包含SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列或由SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列組成。在另一優(yōu)選的方面，核苷酸序列包含SEQIDNO1的核苷酸52-1809或由SEQIDNO:1的核苷酸52-1809組成。在另一更優(yōu)選的方面，核苷酸序列包含大腸桿菌NRRLB-50059中所含質粒pSMai182中的成熟多肽編碼序列或由該成熟多肽編碼區(qū)組成。本發(fā)明還包含編碼如下多肽的核苷酸序列，所述多肽包含SEQIDNO2的氨基酸序列或其成熟多肽，或由SEQIDNO2的氨基酸序列或其成熟多肽組成；由于遺傳密碼的簡并性，所述核苷酸序列不同于SEQIDNO:1或其成熟多肽編碼序列。本發(fā)明還涉及SEQIDNO:1的亞序列，所述亞序列編碼具有纖維二糖水解酶活性的SEQIDNO2的片段。本發(fā)明還涉及突變的多核苷酸，其在SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列中包含至少一個突變或由具有至少一個突變的SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列組成，其中突變的核苷酸序列編碼SEQIDN02的成熟多肽。用于分離或克隆編碼多肽的多核苷酸的技術是本領域內已知的，且包括從基因組DNA分離，從cDNA制備，或其組合?？赏ㄟ^例如使用熟知的聚合酶鏈式反應(PCR)或表達文庫的抗體篩選來檢測具有共有結構特性的克隆DNA片段，從而實現從這種基因組DNA克隆本發(fā)明的多核苷酸。參見，例如，Innis等，1990，PCR:AGuidetoMethodsandApplication,AcademicPress,NewYork?？梢允褂闷渌怂釘U增方法，如連接酶鏈式反應(LCR)、連接活化轉錄(ligatedactivatedtranscription；LAT)和基于核苷酸序列的擴增(NASBA)?？梢詮臍Ыz霉屬菌株，或另外的或相關的生物體克隆所述多核苷酸，并且因此可以是例如所述核苷酸序列的多肽編碼區(qū)的等位基因變體或種變體(speciesvariant)。本發(fā)明還涉及分離的多核苷酸，其包含下述核苷酸序列或由其組成，所述核苷酸序列與SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列具有優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少65%，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少85%，甚至更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%，并且甚至最優(yōu)選至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的同一性程度，所述多核苷酸編碼活性多肽。修飾編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列對于合成與所述多肽基本上相似的多肽可為必需的。術語與所述多肽“基本上相似”指多肽的非天然存在的形式。這些多肽可能以一些工程改造的方式而不同于從其天然來源分離的多肽，例如，比活性、熱穩(wěn)定性、最適PH等方面不同的人工變體?？梢栽谧鳛镾EQIDN01的成熟多肽編碼序列存在的核苷酸序列，例如其亞序列的基礎上，和/或通過引入如下核苷酸取代來構建變體序列所述取代不產生由核苷酸序列編碼的多肽的另外的氨基酸序列，但是符合意欲產生酶的宿主生物體的密碼子選擇；或者所述取代可產生不同的氨基酸序列。關于核苷酸取代的概述，參見，例如，Ford等，1991，ProteinExpressionandPurification2一107。對于本領域技術人員顯而易見的是，這些取代能夠在對于分子功能重要的區(qū)域之外進行，并且仍然產生活性多肽。對于由本發(fā)明的分離的多核苷酸編碼的多肽活性關鍵的并且因此優(yōu)選不進行取代的氨基酸殘基，可以根據本領域公知的方法，如定位誘變或丙氨酸分區(qū)誘變法(參見，例如，Cunningham和Wells，1989，見上)來鑒定。在后一技術中，將突變引入到分子中的每個荷正電的殘基處，并且測試所得突變分子的纖維二糖水解酶活性，以鑒定對于所述分子的活性關鍵的氨基酸殘基。底物_酶相互作用的位點也能夠通過分析三維結構確定，通過如核磁共振分析、晶體學或光親和標記這樣的技術來確定(參見，例如，deVos等，1992，見上；Smith等，1992，見上；fflodaver等，1992，見上)。本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明多肽的分離的多核苷酸，所述分離的多核苷酸在非常低嚴緊條件下，優(yōu)選低嚴緊條件，更優(yōu)選中嚴緊條件，更優(yōu)選中_高嚴緊條件，甚至更優(yōu)選高嚴緊條件，并且最優(yōu)選非常高的嚴緊條件下，與以下雜交(i)SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列，(ii)SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列中所含的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全長互補鏈，或它們的等位變體和亞序列(Sambrook等，1989，同上)，如本文所定義的。在一個優(yōu)選的方面，互補鏈是SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列的全長互補鏈。本發(fā)明還涉及如下獲得的分離的多核苷酸(a)在非常低、低、中、中-高、高或非常高嚴緊條件下，將DNA的群體與以下雜交(i)SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列，(ii)SEQIDN01的成熟多肽編碼序列中所含的cDNA序列，或(iii)⑴或(ii)的全長互補鏈；和(b)分離雜交的多核苷酸，其編碼具有纖維二糖水解酶活性的多肽。在一個優(yōu)選的方面，所述互補鏈是SEQIDN0:1的成熟多肽編碼序列的全長互補鏈。核酸構建體本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的分離的多核苷酸的核酸構建體，所述分離的多核苷酸與一個或多個(幾個)調控序列可操作地連接，所述調控序列在合適的宿主細胞中在與該調控序列相容的條件下指導編碼序列的表達?？梢杂迷S多方式操作編碼本發(fā)明多肽的分離的多核苷酸以供多肽的表達。依賴于表達載體，在將多核苷酸的序列插入載體之前對其進行操作可能是理想的或必需的。使用重組DNA方法修飾多核苷酸序列的技術是本領域熟知的。調控序列可以是適當的啟動子序列，其是由用于表達編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸的宿主細胞識別的核苷酸序列。啟動子序列含有介導多肽的表達的轉錄調控序列。啟動子可以是在所選的宿主細胞中顯示轉錄活性的任何核苷酸序列，包括突變的、截短的和雜合的啟動子，并且可以從編碼與宿主細胞同源或異源的胞外或胞內多肽的基因獲得。用于指導本發(fā)明的核酸構建體轉錄，特別是在細菌宿主細胞中轉錄的合適啟動子的實例是從下述獲得的啟動子大腸桿菌lac操縱子、天藍色鏈霉菌瓊脂糖酶基因(dagA)、枯草芽孢桿菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、地衣芽孢桿菌a-淀粉酶基因(amyL)、嗜熱脂肪芽孢桿菌產麥芽淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢桿菌淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢桿菌青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢桿菌xylA和xylB基因和原核內酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等，1978,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA75:3727-3731),\)JsRtacj^sj]^(DeBoer1983,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA80:21_25)。另夕卜的啟動子在〃Usefulproteinsfromrecombinantbacteria"于ScientificAmerican，1980，242:74_94中；和在Sambrook等，1989，見上中描述。用于指導本發(fā)明的核酸構建體在絲狀真菌宿主細胞中轉錄的合適啟動子的實例是從下列酶的基因獲得的啟動子米曲霉TAKA淀粉酶、曼赫根毛霉(Rhizomucormiehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性a-淀粉酶、黑曲霉酸穩(wěn)定性a-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、曼赫根毛霉脂肪酶、米曲霉堿性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸異構酶、構巢曲霉乙酰胺酶、鑲片鐮孢淀粉葡糖苷酶(W000/56900)、鑲片鐮孢Daria(W000/56900)、鑲片鐮孢Quirm(W000/56900)、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶(W096/00787)、里氏木霉葡糖苷酶、里氏木霉纖維二糖水解酶I、里氏木霉纖維二糖水解酶、里氏木霉內切葡聚糖酶I、里氏木霉內切葡聚糖酶II、里氏木霉內切葡聚糖酶III、里氏木霉內切葡聚糖酶IV、里氏木霉內切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉木糖苷酶，以及NA2-tpi啟動子(來自黑曲霉中性a-淀粉酶基因和米曲霉丙糖磷酸異構酶基因的啟動子的雜合體)；和它們的突變的、截短的和雜合的啟動子。在酵母宿主中，有用的啟動子從如下酶的基因獲得釀酒酵母烯醇化酶(EN0-1)、釀酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ADH1，ADH2/GAP)、釀酒酵母丙糖磷酸異構酶(TPI)、釀酒酵母金屬硫蛋白(CUP1)和釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。對于酵母宿主細胞其它有用的啟動子由Romanos等，1992，Yeast8:423_488描述。調控序列也可以是合適的轉錄終止子序列，其是由宿主細胞識別以終止轉錄的序列。所述終止子序列與編碼所述多肽的核苷酸序列的3’末端可操作地連接?？梢詫⒃谒x宿主細胞中有功能的任何終止子用在本發(fā)明中。對于絲狀真菌宿主細胞優(yōu)選的終止子從如下酶的基因獲得米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構巢曲霉鄰氨基苯甲酸合酶、黑曲霉a-葡糖苷酶和尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶。對于酵母宿主細胞優(yōu)選的終止子從如下酶的基因獲得釀酒酵母烯醇化酶、釀酒酵母細胞色素C(CYC1)和釀酒酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶。對于酵母宿主細胞其它有用的終止子由Romanos等，1992，見上描述。調控序列還可以是合適的前導序列，其是對于宿主細胞的翻譯重要的mRNA非翻譯區(qū)。前導序列可操作地連接于編碼多肽的核苷酸序列的5’-末端?？梢詫⒃谒x宿主細胞中有功能的任何前導序列用在本發(fā)明中。對于絲狀真菌宿主細胞優(yōu)選的前導序列從如下酶的基因獲得米曲霉TAKA淀粉酶和構巢曲霉丙糖磷酸異構酶。對于酵母宿主細胞合適的前導序列從如下酶的基因獲得釀酒酵母烯醇化酶(EN0-1)、釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、釀酒酵母a因子和釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ADH2/GAP)。調控序列也可以是聚腺苷酸化序列，其是與核苷酸序列的3，末端可操作地連接的序列，并且在轉錄時，宿主細胞將其識別為向轉錄的mRNA添加聚腺苷殘基的信號。可以將在所選宿主細胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列在本發(fā)明中使用。對于絲狀真菌宿主細胞優(yōu)選的聚腺苷酸化序列從如下酶的基因獲得米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構巢曲霉鄰氨基苯甲酸合酶、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶和黑曲霉a-葡糖苷酶。對于酵母宿主細胞有用的聚腺苷酸化序列由Guo和Sherman，1995，MolecularCellularBiology15:5983_5990描述。調控序列還可以是信號肽編碼序列，其編碼與多肽的氨基末端相連的氨基酸序列，并且指導編碼的多肽進入細胞分泌途徑。核苷酸序列的編碼序列5’端可固有地包含信號肽編碼序列，該信號肽編碼序列與編碼分泌多肽的編碼序列區(qū)段一起天然地連接在翻譯閱讀框中?；蛘?，編碼序列5’端可含有對于所述編碼序列為外源的信號肽編碼序列。外源信號肽編碼序列在編碼序列不天然地含有信號肽編碼序列時可為必需的?；蛘?，外源信號肽編碼序列可以簡單地取代天然信號肽編碼序列以增強多肽的分泌。然而，指導表達的多肽進入所選宿主細胞的分泌途徑(即，分泌至培養(yǎng)基中)的任何信號肽編碼序列可在本發(fā)明中使用。對于細菌宿主細胞有效的信號肽編碼序列是從如下酶的基因獲得的信號肽編碼序列芽孢桿菌屬NCIB11837產麥芽糖淀粉酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌a-淀粉酶、地衣芽孢桿菌枯草蛋白酶(subtilisin)、地衣芽孢桿菌內酰胺酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌中性蛋白酶(nprT，nprS,nprM)和枯草芽孢桿菌prsA。另外的信號肽由Simonen和Palva，1993，MicrobiologicalReviews57109-137描述。對于絲狀真菌宿主細胞有效的信號肽編碼序列是從如下酶的基因獲得的信號肽編碼序列米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、特異腐質霉纖維素酶、特異腐質霉內切葡聚糖酶V和疏棉狀腐質霉脂肪酶。對于酵母宿主細胞有用的信號肽從釀酒酵母a因子和釀酒酵母轉化酶的基因獲得。其它有用的信號肽編碼序列由Romanos等，1992，見上描述。在一個優(yōu)選的方面，信號肽包含SEQIDNO2的氨基酸1至17或由SEQIDN02的氨基酸1至17組成。在另一優(yōu)選的方面，信號肽編碼序列包含SEQIDNO1的核苷酸1至51或由SEQIDNO1的核苷酸1至51組成。調控序列還可以是前肽編碼序列，其編碼位于多肽氨基末端的氨基酸序列。所得多肽稱為酶原(proenzyme)或前多肽(propolyp印tide)(或在某些情況下稱為酶原(zymogen))0前肽通常是無活性的并且能夠通過前肽的催化或自催化切割從前多肽轉化為成熟活性多肽?？梢詮目莶菅挎邨U菌堿性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢桿菌中性蛋白酶(nprT)、釀酒酵母a因子、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶和嗜熱毀絲霉漆酶(W095/33836)的基因獲得前肽編碼區(qū)。當信號肽和前肽序列二者均出現在多肽的氨基末端時，將前肽序列置于緊接著(nextto)多肽氨基末端，并且將信號肽序列置于緊接著前肽序列的氨基末端。同樣理想的是添加調節(jié)序列，其允許相對于宿主細胞的生長來調節(jié)多肽的表達。調節(jié)系統(tǒng)的實例是引起基因表達響應化學或物理刺激物，包括調節(jié)化合物的存在而開啟或關閉的那些系統(tǒng)。原核系統(tǒng)中的調節(jié)系統(tǒng)包括lac、tac和trp操縱基因系統(tǒng)。在酵母中，可以使用ADH2系統(tǒng)或GAL1系統(tǒng)。在絲狀真菌中，可以使用TAKAa-淀粉酶啟動子、黑曲霉葡糖淀粉酶啟動子和米曲霉葡糖淀粉酶啟動子作為調節(jié)序列。調節(jié)序列的其它實例是那些允許基因擴增的序列。在真核系統(tǒng)中，這些調節(jié)序列包括在氨甲蝶呤(methotrexate)存在下擴增的二氫葉酸還原酶基因，和以重金屬(withheavymetal)擴增的金屬硫蛋白基因。在這些情況下，編碼多肽的核苷酸序列將與調節(jié)序列可操作地連接。表達載體本發(fā)明還涉及重組表達載體，所述重組表達載體包含本發(fā)明的多核苷酸、啟動子和轉錄和翻譯終止信號。本文所述的多種核酸和調控序列可以結合在一起以產生重組表達載體，所述表達載體可以包括一個或多個(幾個)方便的限制位點以允許在這些位點插入或取代編碼多肽的核苷酸序列?？晒┻x擇的是，可以通過在適當的用于表達的載體中插入包含所述序列的核苷酸序列或核酸構建體來表達本發(fā)明的多核苷酸序列。在制備表達載體的過程中，將編碼序列置于載體中，使得該編碼序列與適當的表達用調控序列可操作地連接。重組表達載體可以是任何載體(例如，質?；虿《?，其能夠方便地進行重組DNA步驟，并且能夠產生核苷酸序列的表達。載體的選擇將通常依賴于載體與將引入該載體的宿主細胞的相容性。載體可以是線狀或閉合環(huán)狀質粒。載體可以是自主復制載體，即，作為染色體外實體(entity)存在的載體，其復制獨立于染色體復制，例如，質粒、染色體外元件、微型染色體(minichromosome)或人工染色體。載體可以含有任何用于確保自復制的手段(means)。或者，載體可以是一種當被引入宿主細胞中時，整合到基因組中并且與整合了該載體的染色體一起復制的載體。此外，可以使用單獨的載體或質?；騼蓚€或更多個載體或質粒，其共同含有待引入宿主細胞基因組的完整DNA(totalDNA)，或可以使用轉座子(transposon)。本發(fā)明的載體優(yōu)選地含有一個或多個(幾個)選擇性標記，其允許簡單選擇經轉化、轉染、轉導等的細胞。選擇性標記是基因，其產物提供殺生物劑或病毒抗性、對重金屬的抗性、對營養(yǎng)缺陷型的原養(yǎng)性(prototrophytoauxotrophs)等。細菌選擇性標記的實例是來自枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌的dal基因，或賦予抗生素抗性的標記，所述抗生素抗性如氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素或四環(huán)素抗性。對于酵母宿主細胞合適的標記是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于絲狀真菌宿主細胞的選擇性標記包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鳥氨酸氨甲酰基轉移酶)、bar(草銨膦(phosphinothricin)乙酰轉移酶)、hph(潮霉素磷酸轉移酶)、niaD(硝酸還原酶)(nitratereductase)、pyrG(乳清酸核苷-5，-磷酸脫羧酶)(orotidine-5，-phosphatedecarboxylase)、sC(硫酸腺苷酰轉移酶)和trpC(鄰氨基苯甲酸合酶(anthranilatesynthase))以及它們的等價物。優(yōu)選用在曲霉屬細胞中的是構巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因禾口吸水鏈霄菌(Streptomyceshygroscopicus)的bar基因。本發(fā)明的載體優(yōu)選含有元件，其允許載體整合入宿主細胞基因組或載體在細胞中獨立于基因組的自主復制。為了整合入宿主細胞基因組，載體可依賴編碼多肽的多核苷酸的序列或用于通過同源或非同源重組整合入基因組的任何其它載體元件?；蛘撸d體可以含有額外的核苷酸序列，用于指導通過同源重組整合入宿主細胞基因組染色體中的精確位置。為了增加在精確位置整合的可能性，整合元件應優(yōu)選含有足夠數量的核酸，如100至10，000堿基對，優(yōu)選400至10，000堿基對，并且最優(yōu)選800至10，000堿基對，其與相應的目標序列具有高度同一性以增強同源重組的概率。整合元件可以是任何序列，其與宿主細胞基因組中的目標序列同源。此外，整合元件可以是非編碼或編碼的核苷酸序列。另一方面，可以將載體通過非同源重組整合到宿主細胞的基因組中。為了自主復制，載體可以還包含復制起點，其使載體能夠在所述的宿主細胞中自主地復制。復制起點可以是介導自主復制的任何質粒復制子(r印licator)，其在細胞中發(fā)揮功能。術語“復制起點”或“質粒復制子”在本文定義為能夠使質粒或載體體內復制的核苷酸序列。細菌復制起點的實例是允許在大腸桿菌中復制的質粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的復制起點，和允許在芽孢桿菌屬中復制的質粒pUBllO、pE194、pTA1060和pAM31的復制起點。用于酵母宿主細胞中的復制起點的實例是2微米復制起點，ARS1，ARS4，ARS1和CEN3的組合，和ARS4和CEN6的組合。在絲狀真菌細胞中有用的復制起點的實例是AMA1和ANSI(Gems等，1991，Gene98:61-67;Cullen等，1987，NucleicAcidsResearch159163-9175；WO00/24883)。分離AMA1基因和構建包含該基因的質?；蜉d體能夠根據公開于WO00/24883中的方法完成。可以將多于一個拷貝的本發(fā)明的多核苷酸插入宿主細胞以增加基因產物的產生。多核苷酸拷貝數的增加可通過如下方法獲得將至少一個額外拷貝的序列整合入宿主細胞基因組，或將可擴增的選擇性標記基因包括于多核苷酸，其中可通過在合適的選擇劑(selectableagent)存在下培養(yǎng)細胞來選擇含有選擇性標記基因的擴增拷貝，從而也含有多核苷酸的額外拷貝的細胞。用于連接上述元件以構建本發(fā)明的重組表達載體的方法是本領域技術人員熟知的(參見，例如，Sambrook等，1989，見上)。宿主細胞本發(fā)明還涉及重組宿主細胞，其包含本發(fā)明的分離的多核苷酸，將所述重組宿主細胞有利地用于多肽的重組產生。將包含本發(fā)明的多核苷酸的載體引入宿主細胞使得所述載體作為染色體整合體或作為自復制的染色體外載體保持，如前文所述。術語“宿主細胞”包含親本細胞的任何子代，其因為在復制過程中發(fā)生的突變而與該親本細胞不同。宿主細胞的選擇在很大程度上會依賴于編碼多肽的基因及其來源。宿主細胞可以是在本發(fā)明的多肽的重組產生中有用的任何細胞，例如，原核或真核細胞。原核宿主細胞可以是任何革蘭氏陽性細菌或革蘭氏陰性細菌。革蘭氏陽性細菌包括但不限于，芽孢桿菌屬、鏈球菌屬、鏈霉菌屬、葡萄球菌屬、腸球菌屬、乳桿菌屬、乳球菌屬、梭菌屬、地芽孢桿菌屬和海洋芽孢桿菌屬。革蘭氏陰性細菌包括但不限于，大腸桿菌、假單胞菌屬、沙門氏菌屬、彎曲桿菌屬、螺桿菌屬、黃桿菌屬、梭桿菌屬、泥桿菌屬、奈瑟氏菌屬和脲原體屬。細菌宿主細胞可以是任何芽孢桿菌屬細胞。在本發(fā)明的實施中有用的芽孢桿菌屬細胞包括但不限于，嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌、堅強芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌細胞。在一個優(yōu)選的方面，細菌宿主細胞是解淀粉芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌細胞。在一個更優(yōu)選的方面，細菌宿主細胞是解淀粉芽孢桿菌細胞。在另一個更優(yōu)選的方面，細菌宿主細胞是克勞氏芽孢桿菌細胞。在另一個更優(yōu)選的方面，細菌宿主細胞是地衣芽孢桿菌細胞。在另一個更優(yōu)選的方面，細菌宿主細胞是枯草芽孢桿菌細胞。細菌宿主細胞還可以是任何鏈球菌屬細胞。在本發(fā)明的實施中有用的鏈球菌屬細胞包括但不限于，似馬鏈球菌、釀膿鏈球菌、乳房鏈球菌和馬鏈球菌獸瘟亞種細胞。在一個優(yōu)選的方面，細菌宿主細胞是似馬鏈球菌細胞。在另一個優(yōu)選的方面，細菌宿主細胞是釀膿鏈球菌細胞。在另一個優(yōu)選的方面，細菌宿主細胞是乳房鏈球菌細胞。在另一個優(yōu)選的方面，細菌宿主細胞是馬鏈球菌獸瘟亞種細胞。細菌宿主細胞還可以是任何鏈霉菌屬細胞。在本發(fā)明的實施中有用的鏈霉菌屬細胞包括但不限于，不產色鏈霉菌、除蟲鏈霉菌、天藍色鏈霉菌、灰色鏈霉菌和淺青紫鏈霉菌細胞。在一個優(yōu)選的方面，細菌宿主細胞是不產色鏈霉菌細胞。在另一個優(yōu)選的方面，細菌宿主細胞是除蟲鏈霉菌細胞。在另一個優(yōu)選的方面，細菌宿主細胞是天藍色鏈霉菌細胞。在另一個優(yōu)選的方面，細菌宿主細胞是灰色鏈霉菌細胞。在另一個優(yōu)選的方面，細菌宿主細胞是淺青紫鏈霉菌細胞?？赏ㄟ^如下方法實現將DNA引入到芽孢桿菌細胞例如原生質體轉化(參見，例如，Chang和Cohen，1979，MolecularGeneralGenetics168:111_115)，使用感受態(tài)細胞(參見，例如，Young和Spizizen，1961，JournalofBacteriology81:823_829或Dubnau禾口Davidoff-Abelson,1971，JournalofMolecularBiology56:209_221)，電穿孑L(參見，例如，Shigekawa禾口Dower，1988，Biotechniques6742-751)或接合(參見，例如，Koehler和Thorne，1987，JournalofBacteriologyl69:5771_5278)?？赏ㄟ^如下方法實現將DNA引入到大腸桿菌細胞例如原生質體轉化(參見，例如，Hanahan，1983，J.Mol.Biol.166557-580)或電穿孔(參見，例如，Dower等，1988，NucleicAcidsRes.16:6127_6145)。可通過如下方法實現將DNA引入到鏈霉菌屬細胞例如原生質體轉化和電穿孔(參見，例如，Gong等，2004，FoliaMicrobiol.(Praha)49:399_405)，接合(參見，例如，Mazodier等，1989，J.Bacteriol.171:3583_3585)，或轉導(參見，例如，Burke等，2001，Proc.Natl.Acad.Sci.USA98=6289-6294)?？赏ㄟ^如下方法實現將DNA引入到假單胞菌屬細胞例如電穿孔(參見，例如，Choi等，2006，J.Microbiol.Methods64:391-397)或接合(參見，例如，Pinedo和Smets，2005,Appl.Environ.Microbiol.71:51_57)?？赏ㄟ^如下方法實現將DNA引入到鏈球菌屬細胞例如天然感受態(tài)(naturalcompetence)(參見，例如，Perry和Kuramitsu，1981，Infect.Immun.32:1295_1297)，原生質體轉化(參見，例如，Catt和Jollick,1991，Microbios.68189-207)，電穿孔(參見，例如，Buckley等，1999，Appl.Environ.Microbiol.653800-3804)或接合(參見，例如，Clewell，1981，Microbiol.Rev.45409-436)。然而，可以使用任何已知的將DNA引入宿主細胞的方法。宿主細胞還可以是真核生物，如哺乳動物、昆蟲、植物或真菌細胞。在一個優(yōu)選的方面，宿主細胞是真菌細胞?！罢婢庇迷诒疚陌ㄒ韵麻T子囊菌門(Ascomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)禾口接合菌門(Zygomycota)(如由Hawksworth等，于AinsworthandBisby，sDictionaryofTheFungi，第八版，1995，CABInternational,UniversityPress，Cambridge，UK中所定義)以及卵菌門(Oomycota)(如Hawksworth等，1995，見上，171頁中所引用)，和所有有絲分裂孢^^^(mitosporicfungi)(Hawksworth等，1995,)。在一個更優(yōu)選的方面，真菌宿主細胞是酵母細胞。“酵母”用在本文包括產子囊酵母(ascosporogenousyeast)(內孢霉目(Endomycetales))、產擔子酵母(basidiosporogenousyeast)禾口屬于半知菌類(FungiImperfecti)(芽抱綱(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分類在未來可能改變，就本發(fā)明而言，會將酵母定義為如BiologyandActivitiesofYeast(Skinner,F.A.,Passmore,S.M.,禾口Davenport,R.R.,eds,Soc.App.Bacterid.SymposiumSeriesNo.9,1980)中所述。在甚至更加優(yōu)選的方面，酵母宿主細胞是念珠菌屬、漢遜酵母屬(Hansenula)、克魯維酵母屬、畢赤酵母屬、酵母屬、裂殖酵母屬或西洋蓍霉屬細胞。在最優(yōu)選的方面，酵母宿主細胞是卡爾酵母、釀酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克魯弗酵母、諾地酵母或卵形酵母細胞。在另一個最優(yōu)選的方面，酵母宿主細胞是乳酸克魯維酵母(Kluyveromyceslactis)細胞。在另一個最優(yōu)選的方面，酵母宿主細胞是解脂西洋蓍霉(Yarrowialipolytica)細胞。在另一個更優(yōu)選的方面，真菌宿主細胞是絲狀真菌細胞?！敖z狀真菌”包括真菌門(Eumycota)和卵菌門的亞門(如由Hawksworth等，1995，見上文，所定義)的所有絲狀形式。絲狀真菌通常的特征在于由殼多糖(chitin)、纖維素、葡聚糖、殼聚糖(chitosan)、甘露聚糖和其它復雜多糖組成的菌絲體壁。通過菌絲延伸進行營養(yǎng)生長，而碳分解代謝是專性需氧的。相反，酵母例如釀酒酵母的營養(yǎng)生長通過單細胞菌體的出芽生殖(budding)進行，而碳分解代謝可以是發(fā)酵的。在甚至更優(yōu)選的方面，絲狀真菌宿主細胞是枝頂孢霉屬、曲霉屬、短梗霉屬、煙管霉屬(Bjerkandera)、擬蠟菌屬、金孢子菌屬、鬼傘屬(Coprinus)、革蓋菌屬(Coriolus)、隱球菌屬、線黑粉酵母屬、鐮孢屬、腐質霉屬、梨孢菌屬、毛霉屬、毀絲霉屬、新考瑪脂霉屬、脈孢菌屬、擬青霉屬、青霉屬、平革菌屬、射脈菌屬(Phlebia)、瘤胃壺菌屬、側耳屬(Pleurotus)、裂褶菌屬、踝節(jié)菌屬、嗜熱子囊菌屬、梭孢殼屬、彎頸霉屬、栓菌屬(Trametes)或木霉屬細胞。在最優(yōu)選的方面，絲狀真菌宿主細胞是泡盛曲霉、煙曲霉、臭曲霉、日本曲霉、構巢曲霉、黑曲霉或米曲霉細胞。在另一個最優(yōu)選方面，絲狀真菌宿主細胞是桿孢狀鐮孢、禾谷鐮孢、庫成鐮孢、大刀鐮孢、禾本科鐮孢、禾赤鐮孢、異孢鐮孢、合歡木鐮孢、尖鐮孢、多枝鐮孢、粉紅鐮孢、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、擬分枝孢鐮孢、硫色鐮孢、圓鐮孢、擬絲孢鐮孢或鑲片鐮孢細胞。在另一個最優(yōu)選的方面，絲狀真菌宿主細胞是黑刺■i胃(Bjerkanderaadusta)^Ceriporiopsisaneirina^Ceriporiopsisaneirina^Ceriporiopsiscaregiea、Ceriporiopsisgilvescens、Ceriporiopsispannocinta^Ceriporiopsisrivulosa、Ceriporiopsissubrufa、Ceriporiopsissubvermispora、口譽角質金抱子菌、Chrysosporiumlucknowense、熱帶金抱子菌、Chrysosporiummerdarium、Chrysosporiuminops、氈金孢子菌、昆士蘭金孢子菌、褐薄金孢子菌、灰蓋鬼傘(Coprinuscinereus)、毛革蓋菌(Coriolushirsutus)、特異腐質霉、疏棉狀腐質霉、米黑毛霉、嗜熱毀絲霉、粗糙脈孢菌、產紫青霉、黃孢平革菌、輻射射脈菌(Phlebiaradiata)、剌芹側耳(Pleurotuseryngii)、土生梭抱霉、Trametesvillosa、Trametesversicolor、哈茨木霉、康寧木霉、長枝木霉、里氏木霉或綠色木霉細胞。可以將真菌細胞通過涉及原生質體形成、原生質體轉化和細胞壁重建的方法以本身公知的方式轉化。用于轉化曲霉屬和木霉屬宿主細胞的合適方法在EP238023和Yelton等，1984，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA81:1470-1474中描述。用于轉化鐮孢屬菌種的合適方法由Malardier等，1989，Gene78147-156和W096/00787描述?？梢允褂糜扇缦挛墨I描述的方法轉化酵母Becker和Guarente，于Abelson，J.N.和Simon,M.I(編者)，GuidetoYeastGeneticsandMolecularBiology,MethodsinEnzymology,Volume194,182-187頁，AcademicPress,Inc.,NewYork;Ito等，1983,JournalofBacteriology153:163；禾口Hinnen等，1978,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA75:1920o產生方法本發(fā)明還涉及產生本發(fā)明多肽的方法，其包括(a)在有益于產生多肽的條件下培養(yǎng)細胞，所述細胞以其野生型形式產生所述多肽；和(b)回收所述多肽。在一個優(yōu)選的方面，所述細胞是毀絲霉屬的。在一個更優(yōu)選的方面，所述細胞是嗜熱毀絲霉。在最優(yōu)選的方面，所述細胞是嗜熱毀絲霉CBS202.75。本發(fā)明還涉及產生本發(fā)明的多肽的方法，其包括(a)在有益于產生多肽的條件下培養(yǎng)如本文所述的重組宿主細胞；和(b)回收所述多肽。本發(fā)明還涉及產生本發(fā)明的多肽的方法，包括(a)在有益于產生多肽的條件下培養(yǎng)重組宿主細胞，其中所述宿主細胞包含突變核苷酸序列，其在SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列中具有至少一個突變，其中所述突變核苷酸序列編碼多肽，所述多肽包含SEQIDNO2的成熟多肽或由SEQIDNO2的成熟多肽組成，和(b)回收所述多肽。在本發(fā)明的產生方法中，使用本領域熟知的方法在適合于產生所述多肽的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞。例如，可以通過在合適培養(yǎng)基中和允許表達和/或分離所述多肽的條件下進行的搖瓶培養(yǎng)，和實驗室或工業(yè)發(fā)酵罐中的小規(guī)?；虼笠?guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)、分批、補料分批或固態(tài)發(fā)酵)來培養(yǎng)細胞。使用本領域已知的方法在合適的營養(yǎng)培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，所述營養(yǎng)培養(yǎng)基包含碳源和氮源和無機鹽。合適的培養(yǎng)基能夠從商業(yè)供應商獲得或可以根據公開的組成制備(例如，在美國典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄中)。如果多肽分泌到營養(yǎng)培養(yǎng)基中，該多肽能夠從所述培養(yǎng)基中直接回收。如果多肽不分泌到培養(yǎng)基中，其能夠從細胞裂解物(lysate)回收?？梢允褂帽绢I域已知的對于所述多肽是特異性的方法來檢測多肽。這些檢測方法可包括特異性抗體的使用、酶產物的形成或酶底物的消失。例如，酶試驗(enzymeassay)可用于測定如本文所述的多肽的活性。所得多肽可以使用本領域已知的方法回收。例如，多肽可以通過常規(guī)方法從營養(yǎng)培養(yǎng)基中回收，所述常規(guī)方法包括但不限于離心、過濾、提取、噴霧干燥、蒸發(fā)或沉淀。本發(fā)明的多肽可以通過多種本領域已知的方法純化以獲得基本上純的多肽，所述方法包括但不限于層析(例如，離子交換、親和、疏水、層析聚焦和大小排阻)、電泳方法(例如，制備型(pr印arative)等電聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸銨沉淀)、SDS_PAGE或提取(參見，例如，ProteinPurification，J.Janson禾口LarsRyden編，VCHPublishers,NewYork,1989)。植物本發(fā)明還涉及植物，例如，轉基因植物、植物部分或植物細胞，其包含分離的多核苷酸，所述多核苷酸編碼本發(fā)明具有纖維二糖水解酶活性的多肽，從而以可回收的量表達和產生所述多肽?？蓮闹参锘蛑参锊糠只厥斩嚯??；蛘撸墒褂煤性撝亟M多肽的植物或植物部分本身(assuch)來改進食品或飼料的質量，例如，改進營養(yǎng)價值、適口性(palatability)和流變性質(rheologicalproperties)，或用于破壞抗營養(yǎng)因子。轉基因植物可以是雙子葉的(雙子葉植物)或單子葉的(單子葉植物)。單子葉植物的實例是草(grasses)，如草地早熟禾(meadowgrass)(藍草(bluegrass)，早熟禾屬(Poa))；飼用牧草(foragegrass)如羊茅屬(Festuca)、黑麥草屬(Lolium)；寒地型牧草(temperategrass)，如Agrostis(剪股穎屬)；和谷類，例如，小麥、燕麥、黑麥、大麥、稻(rice)、高粱和玉蜀黍(maize)(玉米)。雙子葉植物的實例是煙草(tobacco)，豆類(legumes)，如羽扇豆(lupins)，馬鈴薯，糖甜菜(sugarbeet),豌豆,豆(bean)和大豆(soybean)和十字花科的(cruciferous)植物(十字花科(familyBrassicaceae))，如花椰菜(cauliflower)，油菜籽(rapeseed)和緊密相關的模型生物體擬南芥(Arabidopsisthaliana)。植物部分的實例是莖(stem)、愈傷組織(callus)、葉(leaf)、根(root)、果實(fruit)、種子(seed)和塊莖(tuber)，以及包含這些部分的獨立組織，例如，表皮(epidermis)、葉肉(mesophyll)、薄壁組織(parenchyme)、維管組織(vasculartissue)、分生組織(meristem)。具體的植物細胞區(qū)室(compartments)，如葉綠體(chloroplast)、質夕卜體(apoplast)、線粒體(mitochondria)>(vacuole)、過氧化物酶體(peroxisome)和細胞質(cytoplasm)也被認為是植物部分。此外，任何植物細胞，無論什么組織來源，都被認為是植物部分。同樣地，植物部分，如為了促進本發(fā)明的應用而分離的特定組織和細胞也被認為是植物部分，例如胚(embryo)、胚乳(endosperm)、糊粉(aleurone)和種皮(seedcoat)0同樣包含于本發(fā)明范圍內的還有這些植物、植物部分和植物細胞的后代。表達本發(fā)明多肽的轉基因植物或植物細胞可以依照本領域已知方法構建。簡而言之，通過如下方法構建所述植物或植物細胞將編碼本發(fā)明多肽的一個或多個(幾個)表達構建體并入植物宿主基因組或葉綠體基因組，并且將所得的修飾植物或植物細胞繁殖為轉基因植物或植物細胞。表達構建體便利地是包含編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸的核酸構建體，所述多核苷酸與在選擇的植物或植物部分中表達該多核苷酸序列所需的適當的調節(jié)序列可操作地連接。此外，表達構建體可以包含對于鑒定其中整合了表達構建體的宿主細胞有用的選擇性標記，和將該構建體引入到所述植物中所必需的DNA序列(后者依賴于使用的DNA引入方法)。調節(jié)序列的選擇，如啟動子和終止子序列和任選地信號或轉運序列的選擇，舉例來說，基于期望何時、何處以及如何表達多肽而確定。例如，編碼本發(fā)明多肽的基因的表達可以是組成型的或誘導型的，或可以是發(fā)育、階段或組織特異性的，并且基因產物可以靶向特定的組織或植物部分如種子或葉。調節(jié)序列由例如Tague等，1988，PlantPhysiology86506描述。對于組成性表達，可以使用35S_CaMV、玉米泛素1和稻肌動蛋白1啟動子(Franck等，1980，Cell21:285-294，Christensen等，1992，PlantMo.Biol.18:675_689；Zhang等，1991，PlantCell3:1155-1165)。器官特異性啟動子可以是例如來自貯藏庫組織(storagesinktissue)例如種子、馬鈴薯塊蓮和果實的啟動子(Edwards&Coruzzi，1990，Ann.Rev.Genet.24:275-303)，或來自代謝庫組織(metabolicsinktissue)例如分生組織的啟動子(Ito等，1994，PlantMol.Biol.24:863_878)，種子特異性啟動子諸如來自稻的谷蛋白(glutelin)、醇溶蛋白(prolamin)、球蛋白(globulin)或白蛋白(albumin)啟動子(Wu等，1998，PlantandCellPhysiology39:885_889)，來自豆球蛋白(legumin)B4和蠶豆(Viciafaba)的未知種子蛋白基因的蠶豆啟動子(Conrad等，1998，JournalofPlantPhysiologyl52:708_711)、來自種子油體蛋白(oilbodyprotein)的啟動子(Chen等，1998，PlantandCellPhysiology39:935_941)，來自歐洲油菜(Brassicanapus)的貯藏蛋白napA啟動子，或本
技術領域：
公知的任何其它種子特異性的啟動子，例如，在TO91/14772中所描述的。此外，啟動子可為葉特異性的啟動子，如來自稻或番茄的rbcs啟動子(Kyozuka等，1993，PlantPhysiology102:991_1000)，小球藻病毒(chlorellavirus)腺嘌呤甲基轉移酶(adeninemethyltransferase)基因啟動子(Mitra和Higgins，1994，PlantMolecularBiology26:85_93)，或來自稻的aldP基因啟動子(Kagaya等，1995，MolecularandGeneralGenetics248:668_674)，或傷口誘導的啟動子，如馬鈴薯pin2啟動子(Xu等，1993，PlantMolecularBiology22:573-588)。同樣地，所述啟動子可通過非生物的處理誘導，所述非生物的處理如溫度、干旱或鹽度變化，或通過外源施加的激活所述啟動子的物質誘導，例如乙醇、雌激素(oestrogens)、植物激素(planthormones)如乙烯、脫落酸(abscisicacid)和赤霉酸(gibberellicacid)，和重金屬。啟動子增強子元件也可以用于實現本發(fā)明多肽在植物中的較高表達。例如，啟動子增強子元件可以是內含子，其置于啟動子和編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列之間。例如Xu等，1993，見上，公開了使用稻肌動蛋白1基因的第一內含子以增強表達。選擇性標記基因和表達構建體的任何其它部分可以選自本領域內可用的那些。將核酸構建體根據本領域已知的常規(guī)技術并入植物基因組，所述常規(guī)技術包括土壤桿菌屬(Agrobacterium)介導的轉化、病毒介導的轉化、顯微注射(microinjection)、粒子轟擊、生物射彈轉化和電穿孔(Gasser等，1990，Science2441293；Potrykus,1990,Bio/Technology8535；Shimamoto等，1989，Nature338274)。目前，根癌土壤桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)介導的基因轉移(genetransfer)，是產生轉基因雙子葉植物的優(yōu)選方法(為了參考，見Hooykas和Schilperoort，1992，PlantMolecularBiology19:15_38)，而且它也可以用于轉化單子葉植物，雖然對于這些植物其它的轉化方法是常用的。目前，產生轉基因單子葉植物的優(yōu)選的方法，是用粒子(用轉化DNA涂覆的微觀的金或鎢粒子)轟擊胚愈傷組織(embryoniccalli)或發(fā)育中的胚(developingembryos)(Christou,1992,PlantJournal2:275-281;Shimamoto,1994,CurrentOpinionBiotechnology5158-162；Vasil等，1992,Bio/Technology10667-674)0轉化單子葉植物的可供選擇的方法是基于原生質體轉化，如由Omirulleh等，1993，PlantMolecularBiology21:415_428所描述的。轉化之后，根據本領域熟知的方法選擇并入了表達構建體的轉化體并且再生成為完整植物。通常設計轉化方法用于通過如下方法在再生期間或在后續(xù)世代中選擇性消除選擇基因例如，使用帶有兩種獨立的T-DNA構建體的共轉化或通過特異性重組酶位點特異性地切除選擇基因。本發(fā)明還涉及產生本發(fā)明多肽的方法，其包括(a)在有益于產生多肽的條件下培養(yǎng)包含多核苷酸的轉基因植物或植物細胞，所述多核苷酸編碼本發(fā)明具有纖維二糖水解酶活性的多肽；和(b)回收所述多肽。去除或減少纖維二糖水解酶活性本發(fā)明還涉及產生親本細胞突變體的方法，其包括破壞或缺失編碼本發(fā)明的多肽的多核苷酸序列或其部分，所述方法導致在相同條件下培養(yǎng)時，與親本細胞相比突變的細胞產生較少的所述多肽?？梢允褂帽绢I域熟知的方法(例如，插入、破壞、替代或缺失)通過減少或消除編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列的表達來構建突變細胞。在一個優(yōu)選的方面，所述核苷酸序列是被失活的。待修飾或失活的核苷酸序列可以是，例如，編碼區(qū)或其對活性關鍵的部分，或表達編碼區(qū)所需的調節(jié)元件。這種調節(jié)或調控序列的實例可以是啟動子序列或其功能部分，即，足以影響核苷酸序列表達的部分。用于可能的修飾的其它調控序列包括但不限于前導序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、信號肽序列、轉錄終止子和轉錄激活子?？梢酝ㄟ^向親本細胞施以誘變，并且選擇其中已將所述核苷酸序列的表達減少或消除的突變細胞來進行核苷酸序列的修飾或失活。誘變可能是特異性的或隨機的，可以通過例如使用合適的物理或化學誘變劑進行，通過使用合適的寡核苷酸進行，或通過將所述DNA序列進行PCR產生的誘變。此外，可以通過使用這些誘變劑的任何組合來進行誘變。適合于本發(fā)明目的的物理或化學誘變劑的實例包括紫外線(UV)照射、羥胺、N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)、0_甲基羥胺、亞硝酸、乙基甲烷磺酸酯(ethylmethanesulphonate)(EMS)、亞硫酸氫鈉、甲酸和核苷酸類似物。當使用這些試劑時，通常通過如下來進行所述誘變在合適條件下存在優(yōu)選的誘變劑時培育待誘變的親本細胞，并篩選和/或選擇顯示基因表達減少的或無基因表達的突變體細胞。通過導入、取代或去除基因中的一個或多個(幾個)核苷酸或其轉錄或翻譯所需的調節(jié)元件可以實現所述核苷酸序列的修飾或失活。例如，可以插入或去除核苷酸從而導致引入終止密碼子，去除起始密碼子，或改變開放閱讀框。按照本領域已知的方法通過定位誘變或PCR產生的誘變可以實現這種修飾或失活。盡管在理論上所述修飾可以在體內進行，即，直接在表達待修飾核苷酸序列的細胞上進行，但優(yōu)選如下面所示例的那樣在體外進行所述修飾。消除或減少核苷酸序列通過細胞的表達的便利方式的例子是基于基因替代、基因缺失或基因破壞的技術。例如，在基因破壞方法中，將相應于內源核苷酸序列的核酸序列在體外進行誘變以產生缺陷性的核酸序列，隨后將其轉化入親本細胞中以產生缺陷基因。通過同源重組，所述缺陷性核酸序列替代了內源性核苷酸序列?？赡芾硐氲氖撬鋈毕菪院塑账嵝蛄羞€編碼標記，其可用于選擇其中核苷酸序列被修飾或破壞的轉化子。在特別優(yōu)選的方面，用可選擇的標記(如本文所述的那些)來破壞所述核苷酸序列?；蛘?，可以使用與所述核苷酸序列互補的序列通過確定的反義或RNAi技術來進行所述核苷酸序列的修飾或失活。更具體地，通過導入與所述基因的核苷酸序列互補的序列可以減少或消除所述核苷酸序列通過細胞的表達，所述序列可以在細胞中轉錄并且能夠與細胞中產生的mRNA雜交。在允許所述互補反義核苷酸序列與mRNA雜交的條件下，由此減少或消除翻譯的蛋白質的量。本發(fā)明進一步涉及親本細胞的突變體細胞，其包含編碼多肽的核苷酸序列或其調控序列的破壞或缺失，這導致與親本細胞相比突變體細胞產生更少的多肽或不產生多肽。這樣生成的多肽缺陷型突變細胞作為表達天然和/或異源多肽的宿主細胞特別有用。所以，本發(fā)明進一步涉及產生天然或異源多肽的方法，其包括(a)在有益于產生多肽的條件下培養(yǎng)突變細胞；和(b)回收所述多肽。術語“異源多肽”在本文中定義為對宿主細胞不是天然的多肽，進行了修飾以改變天然序列的天然蛋白，或作為通過重組DNA技術對宿主細胞操作的結果其表達在量上改變的天然蛋白。在另一方面，本發(fā)明涉及通過發(fā)酵產生本發(fā)明的多肽以及目標蛋白產物的細胞來生產基本上無纖維二糖水解酶活性的蛋白質產物的方法在發(fā)酵之前、之中或發(fā)酵完成之后向發(fā)酵液(fermentationbroth)中添加有效量的能夠抑制纖維二糖水解酶活性的試劑，從發(fā)酵液中回收目標產物，并且任選地將回收的產物進行進一步純化。在另一方面，本發(fā)明涉及如下生產基本上無纖維二糖水解酶活性的蛋白質產物的方法在允許產物表達的條件下培養(yǎng)細胞，將得到的培養(yǎng)液進行組合的PH和溫度處理以實質上(substantially)減少纖維二糖水解酶活性，和從發(fā)酵液中回收產物?；蛘?，可以將從培養(yǎng)液回收的酶制備物進行組合的PH和溫度處理。所述組合的pH和溫度處理可任選地與纖維二糖水解酶抑制劑處理組合使用。依照本發(fā)明的這個方面，可能去除至少60%，優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少85%，還更優(yōu)選至少95%，并且最優(yōu)選至少99%的纖維二糖水解酶活性?？墒褂么朔椒ǐ@得纖維二糖水解酶活性的完全去除。組合的pH和溫度處理優(yōu)選在2-4或9-11范圍內的pH和至少60_70°C范圍內的溫度進行一段足夠的時間以達到期望的效果，通常30至60分鐘是足夠的。用于培養(yǎng)和純化感興趣的產物的方法可以通過本領域已知的方法進行。本發(fā)明用于產生基本上無纖維二糖水解酶產物的方法在真核多肽，特別是真菌蛋白質如酶的產生中是特別令人有興趣的。所述酶可以選自，例如，淀粉分解酶(amylolyticenzyme)、脂肪分解酶、蛋白水解酶、纖維素分解酶(cellulolyticenzyme)、氧化還原酶或植物細胞壁降解酶。這些酶的實例包括氨肽酶、淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維二糖水解酶、纖維素酶、幾丁質酶(chitinase)、角質酶(cutinase)、環(huán)糊精糖基轉移酶、脫氧核糖核酸酶、內切葡聚糖酶、酯酶、半乳糖苷酶、3-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、葡糖氧化酶、葡糖苷酶、商素過氧化酶、半纖維素酶、轉化酶、異構酶、漆酶、連接酶、脂肪酶、裂合酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果膠分解酶、過氧化物酶、肌醇六磷酸酶、酚氧化酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉移酶、轉谷氨酰胺酶或木聚糖酶。纖維二糖水解酶缺陷細胞也可以用于表達在制藥上引起興趣的異源蛋白質例如激素、生長因子、受體等?？衫斫獾氖切g語“真核多肽”不僅包括天然多肽，也包括多肽例如酶，其通過氨基酸取代、缺失或添加或其它這樣的修飾而被修飾以增強活性、熱穩(wěn)定性、PH耐受性等。在另外的方面，本發(fā)明涉及基本上無纖維二糖水解酶活性的蛋白質產物，其通過本發(fā)明的方法產生。抑制具有纖維二糖水解酶活性的多肽表達的方法本發(fā)明還涉及抑制具有纖維二糖水解酶活性的多肽在細胞中表達的方法，其包括對細胞施用雙鏈RNA(dsRNA)分子或者在細胞中表達雙鏈RNA(dsRNA)分子，其中所述dsRNA包含本發(fā)明多核苷酸的亞序列。在一個優(yōu)選的方面，dsRNA長約15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多的雙鏈體核苷酸。dsRNA優(yōu)選是小干擾RNA(siRNA)或微RNA(miRNA)。在一個優(yōu)選的方面，dsRNA是用于抑制轉錄的小干擾RNA(siRNA)。在另一優(yōu)選的方面，dsRNA是用于抑制翻譯的微RNA(miRNA)。本發(fā)明還涉及用于抑制細胞中多肽表達的這些包含SEQIDNO:1成熟多肽編碼序列的部分的雙鏈RNA(dsRNA)分子。本發(fā)明不受到任何特定作用機制的限制，dsRNA能進入細胞，并引起相似或相同序列的單鏈RNA(ssRNA)的降解，所述RNA包括內源mRNA。當細胞接觸dsRNA時，來自同源基因的mRNA選擇性地受到稱為RNA干擾(RNAi)的過程的降解。本發(fā)明的dsRNA可以用于基因沉默療法。在一個方面，本發(fā)明提供使用本發(fā)明的dsRNAi選擇性地降解RNA的方法。所述過程可以在體外、在活體外(exvivo)或在體內進行。在一個方面，dsRNA分子能夠用于產生細胞、器官或動物中的功能喪失突變(loss-of-functionmutation)。制備或使用選擇性降解RNA的dsRNA分子的方法在本領域中公知，參見，例如，美國專利No.6，506，559；美國專利No.6，511，824；美國專利No.6，515，109；和美國專利No.6，489，127。組合物本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的多肽的組合物。優(yōu)選地，所述組合物富含這種多肽。術語“富含”表示所述組合物的纖維二糖水解酶活性，例如，以至少1.1的富集因數(enrichmentfactor)增力口。所述組合物可以包含本發(fā)明的多肽作為主要酶組分，例如，單組分組合物?；蛘?，所述組合物可以包含多種酶活性，例如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維素酶、幾丁質酶、角質酶、環(huán)糊精糖基轉移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、a-半乳糖苷酶、半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、a-葡糖苷酶、葡糖苷酶、鹵素過氧化物酶、轉化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果膠分解酶、肽谷氨酰胺酶(p印tidoglutaminase)、過氧化物酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉谷氨酰胺酶或木聚糖酶。額外的酶可以通過例如屬于以下屬或種的微生物產生曲霉屬，優(yōu)選棘孢曲霉、泡盛曲霉、煙曲霉、臭曲霉、日本曲霉、構巢曲霉、黑曲霉或米曲霉；鐮孢屬，優(yōu)選桿孢狀鐮孢、禾谷鐮孢、庫威鐮孢、大刀鐮孢、禾本科鐮孢、禾赤鐮孢、異孢鐮孢、合歡木鐮孢、尖鐮孢、多枝鐮孢、粉紅鐮孢、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、硫色鐮孢、圓鐮孢、擬絲孢鐮孢或鑲片鐮孢；腐質霉屬，優(yōu)選特異腐質霉或疏棉狀腐質霉；或木霉屬，優(yōu)選哈茨木霉、康寧木霉、長枝木霉、里氏木霉或綠色木毒o可以依照本領域內已知的方法制備多肽組合物，并且可以是液體或干組合物的形式。例如，所述多肽組合物可以是顆粒(granulate)或微粒(microgranulate)的形式?？梢砸勒毡绢I域內已知方法將包括于所述組合物中的多肽穩(wěn)定化。下面給出的是本發(fā)明多肽組合物的優(yōu)選的用途的實例。本發(fā)明的多肽組合物的劑量和使用該組合物的其它條件可以基于本領域內已知的方法確定。用途本發(fā)明還涉及使用具有纖維二糖水解酶活性的多肽或其組合物的方法，如下文所述。纖維素材料的降解或轉化本發(fā)明還涉及用于降解或轉化纖維素材料的方法，其包括在有效量的本發(fā)明具有纖維二糖水解酶活性的多肽存在下，用包含一種或多種纖維素分解蛋白的組合物處理纖維素材料。在一個優(yōu)選的方面，所述方法進一步包括回收降解的或轉化的纖維素材料。本發(fā)明的多肽和宿主細胞可用于單糖、二糖和多糖的生產中，所述糖類作為來自纖維素生物質的化學或發(fā)酵原料用于產生乙醇、塑料、其它產品或中間物。包含具有纖維二糖水解酶活性的多肽的組合物可以是去除或不去除細胞的粗發(fā)酵液形式，或是半純化或純化的酶制備物形式。組合物還可以包含在生物質的加工中有用的其它蛋白質和酶，例如，內切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶、葡糖苷酶、半纖維素分解酶(hemicellulolyticenzyme)、增效劑(enhancer)(WO2005/074647,WO2005/074656)等?；蛘撸M合物可以包含本發(fā)明的宿主細胞，所述宿主細胞在使用生物質的發(fā)酵方法中作為具有纖維二糖水解酶活性的多肽的來源。具體地，本發(fā)明的多肽和宿主細胞可以通過部分或全部降解纖維素或半纖維素而增加加工殘余物(干燥的蒸餾殘渣、釀酒酒糟、甘蔗渣等)的價值。宿主細胞也可以含有編碼在生物質加工中有用的上述其它蛋白質和酶的天然或異源的基因。生物質初生細胞壁(primarycellwall)中的主要多糖是纖維素，其次最豐富的是半纖維素，而第三是果膠。次生細胞壁(secondarycellwall)在細胞停止生長后產生，其同樣含有多糖并通過聚合木質素共價交聯至半纖維素而加強。纖維素是脫水纖維二糖的均聚物，并且因此是線性0-(1-4)_D-葡聚糖，而半纖維素包括多種具有系列取代基的復雜分支結構的化合物，如木聚糖、木葡聚糖(xyloglucan)、阿拉伯木聚糖和甘露聚糖。盡管通常是多形的，但是纖維素主要作為平行葡聚糖鏈的不溶晶體基質存在于植物組織中。半纖維素通常與纖維素以及其它半纖維素以氫鍵相連，其幫助穩(wěn)定細胞壁基質。在本發(fā)明的方法中，纖維素材料可以是任何含纖維素的材料。纖維素通常存在于例如植物的莖、葉、外皮(hull)、外殼(husk)和穗軸(cob)，或樹木的葉、枝和木材。纖維素材料可以是，但不限于，草本材料、農業(yè)殘余物、林業(yè)殘余物、市政固體廢物、廢紙、紙漿和造紙廠殘余物。纖維素材料可以是任何類型的生物質，包括但不限于木材資源、市政固體廢物、廢紙、作物和作物殘余物(參見，例如，Wiselogel等，1995，于HandbookonBioethanol(CharlesE.Wyman編)，105-118頁，Taylor&Francis,WashingtonD.C.；ffyman,1994,BioresourceTechnology503~16；Lynd,1990,AppliedBiochemistryandBiotechnology24/25:695_719;Mosier等，1999,RecentProgressinBioconversionofLignocellulosics,于AdvancesinBiochemicalEngineering/Biotechnology,T.Sch印er，主編，Volume65，23—40頁，Springer—Verlag，NewYork)。本文中可理解的是纖維素可以是木素纖維素的形式，其為在混合基質中含有木質素、纖維素和半纖維素的植物細胞壁材料。在一個優(yōu)選的方面，纖維素材料是玉米秸稈。在另一優(yōu)選的方面，纖維素材料是玉米纖維。在另一優(yōu)選的方面，纖維素材料是玉米穗軸。在另一優(yōu)選的方面，纖維素材料是稻草。在另一優(yōu)選的方面，纖維素材料是造紙和紙漿加工廢物(paperandpulpprocessingwaste)在另一優(yōu)選的方面，纖維素材料是木本或草本植物。在另一優(yōu)選的方面，纖維素材料是甘蔗渣。在另一優(yōu)選的方面，纖維素材料是桔橙皮(orangepeel)。將三種主要類別的酶用于分解纖維素生物質(1)“內切-1，4_0-葡聚糖酶”或1，4-0_D-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶(EC3.2.1.4)，其隨機作用于可溶和不溶的1，4-0_葡聚糖底物。(2)“外切-1，4-0-葡聚糖酶”，包括1，4-0-D-葡聚糖葡糖水解酶(EC3.2.1.74)，其從1，4-0-D-葡聚糖釋放D-葡萄糖并且緩慢水解D-纖維二糖；和纖維二糖水解酶(1，4-3-D-葡聚糖纖維二糖水解酶，EC3.2.1.91)，其從1，4-0-葡聚糖釋放D-纖維二糖。(3)“0-D-葡糖苷酶”或0-D-葡糖苷葡糖水解酶(EC3.2.1.21)，其作用于從纖維二糖和可溶的纖維糊精以及一系列糖苷釋放D-葡萄糖單位。本發(fā)明具有纖維二糖水解酶活性的多肽優(yōu)選與其它纖維素分解蛋白(例如，內切-1，4-0-葡聚糖酶和外切-1，4-0-D-葡聚糖酶)一同使用以降解生物質底物的纖維素組分(參見，例如，Brigham等，1995，于HandbookonBioethanol(CharlesE.Wyman編)中，119-141頁，Taylor&Francis,WashingtonD.C.；Lee,1997,JournalofBiotechnology561-24)。內切-1，4-0-葡聚糖酶和外切-1，4-0-D-葡聚糖酶可以通過本領域已知的任何己知方法產生(參見，例如，Bennett,J.ff.禾口LaSure，L.(編)，MoreGeneManipulationsinFungi,AcademicPress,CA,1991)。具有纖維二糖水解酶活性的多肽和其它纖維素分解蛋白的最適量取決于幾個因素，其包括但不限于，組分纖維素分解蛋白的混合物、纖維素底物、纖維素底物的濃度、纖維素底物的預處理、溫度、時間、PH和包括發(fā)酵生物體(例如，用于同步糖化和發(fā)酵的酵母)。術語“纖維素分解蛋白”在本文中定義為顯示出能夠在測試條件下水解或轉化或降解纖維素的那些蛋白質或蛋白質的混合物。在一個優(yōu)選的方面，每克纖維素材料的具有纖維二糖水解酶活性的多肽的量是約0.5至約50mg，優(yōu)選約0.5至約40mg，更優(yōu)選約0.5至約25mg，更優(yōu)選約0.75至約20mg，更優(yōu)選約0.75至約15mg，甚至更優(yōu)選約0.5至約10mg，并且最優(yōu)選約2.5至約10mg每克纖維素材料。在另一優(yōu)選的方面，每克纖維素材料的纖維素分解蛋白的量是約0.5至約50mg，優(yōu)選約0.5至約40mg，更優(yōu)選約0.5至約25mg，更優(yōu)選約0.75至約20mg，更優(yōu)選約0.75至約15mg，甚至更優(yōu)選約0.5至約10mg，并且最優(yōu)選約2.5至約10mg每克纖維素材料。在本發(fā)明的方法中，組合物可補充一種或幾種其它的酶活性，以改善纖維素材料的降解。優(yōu)選的其它酶是半纖維素酶、酯酶(例如，脂肪酶、磷脂酶和/或角質酶)、蛋白酶、漆酶、過氧化物酶或它們的混合物。在本發(fā)明的方法中，可以在發(fā)酵前或發(fā)酵過程中(包括在發(fā)酵微生物的繁殖的過程中或之后)加入其它酶。酶可以源自或獲得自任何合適的來源，包括細菌、真菌、酵母或哺乳動物來源。術語“獲得”在本文中表示酶可以從自然地產生所述酶作為天然酶的生物體分離。術語“獲得”在本文中還表示酶可以在宿主生物體中重組產生，其中重組產生的酶對宿主生物體是天然或外源的，或具有修飾的氨基酸序列，例如，缺失、插入和/或取代一個或多個氨基酸，即，其為天然氨基酸序列的突變體和/或片段的重組產生的酶，或由本領域已知的核酸改組方法產生的酶。天然酶的意義中包含天然變體，而外源酶的意義中包含通過重組，如通過位點定向誘變或改組獲得的變體。還可以將酶純化。本文中使用的術語“純化”包括不含來自其所源自的生物體中其它組分的酶。術語“純化”還包括不含來自其所獲得自的天然生物體的組分的酶?？蓪⒚讣兓?，僅存在少量的其它蛋白質。表述“其它蛋白質”具體涉及其它酶。本文使用的術語“純化”還指去除其它組分，特別是其它蛋白質，并且最特別是存在于本發(fā)明的酶的起源細胞中的其它酶。所述酶可以是基本上純的。本發(fā)明使用的酶可以是適用于本文所述方法的任何形式，如，例如，含有或者不含細胞的粗發(fā)酵液、干粉或顆粒、無粉塵顆粒、液體、穩(wěn)定化的液體或受保護的酶。顆粒可以通過，例如美國專利號4，106，991和4，661，452中公開的方法產生，并且可以任選地通過本領域已知的方法包覆?？梢裕?，根據已確立的方法通過加入穩(wěn)定劑(如糖、糖醇或另一種多羥基化合物(polyol)，和/或乳酸或另一種有機酸)將液體酶制備物穩(wěn)定化。受保護的酶可以根據EP238，216中公開的方法制備?？梢允褂帽景l(fā)明的方法將纖維素材料處理成為很多有用的有機產品、化學品和燃料。除乙醇外，一些可以由纖維素產生的用品和專門化學品包括木糖、丙酮、乙酸、甘氨酸、賴氨酸、有機酸(例如，乳酸)、1，3_丙二醇、丁二醇、甘油、乙二醇、糠醛、多羥基鏈烷酸(polyhydroxyalkanoates)、順式、順式-粘康酸和動物飼料(Lynd，L.R.，ffyman,C.E.禾口Gerngross,T.U.,1999,BiocommodityEngineering,Biotechnol.Prog.,15777-793；Philippidis,G.P.,1996,Cellulosebioconversiontechnology,于HandbookonBioethanolProductionandUtilization,ffyman,C.E.編，Taylor&Francis,Washington,DC,179—212；及Ryu,D.D.Y.和Mandels，M.，1980，Cellulases:biosynthesisandapplications,Enz.Microb.Technol.，2:91_102)?？赡艿墓采a效益擴大而超越了多種有機產物從可發(fā)酵糖的合成。生物處理后殘留的富含木質素的殘余物可以轉化成木質素衍生的化學品，或者用于產生能量(powerproduction)。根據本發(fā)明的方法用于處理纖維素材料的常規(guī)方法為本領域那些技術人員充分理解?？梢允褂萌魏纬Ｒ?guī)生物質處理設備來實施本發(fā)明的方法，所述設備經配置以根據本發(fā)明操作。這種設備可以包括分批式攪拌反應器、具有超濾的連續(xù)流攪拌反應器、連續(xù)活塞流柱式反應器(Gusakov,A.V.,禾口Sinitsyn,A.P.,1985,Kineticsoftheenzymatichydrolysisofcellulose:1.Amathematicalmodelforabatchreactorprocess,Enz.Microb.Technol.7:346_352)、研磨反應器(Ryu,S.K.，禾口Lee，J.M.，1983，Bioconversionofwastecellulosebyusinganattritionbioreactor,Biotechnol.Bioeng.2553-65)，或者具有由電磁場引起的強烈攪拌的反應器(Gusakov，A.V.，Sinitsyn,A.P.，Davydkin,I.Y.,Davydkin,V.Y.,Protas,0.V.,1996,Enhancementofenzymaticcellulosehydrolysisusinganoveltypeofbioreactorwithintensivestirringinducedbyelectromagneticfield,Appl.Biochem.Biotechnol.56:141-153)。常規(guī)方法包括但不限于，糖化、發(fā)酵、分離的水解和發(fā)酵(SHF)、同步糖化和發(fā)酵(SSF)、同步糖化和共發(fā)酵(SSCF)、混合的水解和發(fā)酵(HHF)，和直接微生物轉化(DMC)。SHF使用分離的處理步驟，首先將纖維素用酶水解為葡萄糖，然后將葡萄糖發(fā)酵成為乙醇。在SSF中，纖維素的酶水解和葡萄糖到乙醇的發(fā)酵組合在一個步驟中(Philippidis，G.P.，1996，Cellulosebioconversiontechnology,inHandbookonBioethanolProductionandUtilization,ffyman,C.E.編，Taylor&Francis,Washington,DC,179-212)。SSCF包括多種糖的共發(fā)酵(Sheehan,J.，和Himmel，M.，1999,Enzymes,energyandtheenvironment:AstrategicperspectiveontheU.S.DepartmentofEnergy'sresearchanddevelopmentactivitiesforbioethanol,Biotechnol.Prog.15=817-827)。HHF包括在同一個反應器但不同的溫度進行的兩個分開的步驟，即，高溫酶糖化，然后在發(fā)酵菌株能夠耐受的較低溫度進行SSF。DMC在一個步驟中組合了所有三個過程(纖維素酶產生、纖維素水解和發(fā)酵)(Lynd，L.R.，ffeimer,P.J.，vanZyl,W.H.,禾口Pretorius,I.S.,2002,Microbialcelluloseutilization:Fundamentalsandbiotechnology,Microbiol.Mol.Biol.Reviews66:506_577)。“發(fā)酵”或“發(fā)酵方法”指任何發(fā)酵方法或包含發(fā)酵步驟的任何方法。發(fā)酵方法包括而不限于，用于產生發(fā)酵產品的發(fā)酵方法，所述發(fā)酵產品包括醇(例如，阿拉伯糖醇(arabinitol)、丁醇、乙醇、甘油、甲醇、1，3_丙二醇、山梨醇和木糖醇)；有機酸(例如，乙酸、醋酮酸、己二酸、抗壞血酸、檸檬酸、2，5-二酮-D-葡萄糖酸、蟻酸、反丁烯二酸、葡萄糖二酸、葡糖酸、葡糖醛酸、戊二酸、3-羥基丙酸、衣康酸、乳酸、蘋果酸、丙二酸、草酸、丙酸、琥珀酸和木糖酸)；酮(例如，丙酮)；氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、賴氨酸、絲氨酸和蘇氨酸)；氣體(例如，甲烷、氫氣(H2)、二氧化碳(C02)和一氧化碳(C0))。發(fā)酵方法還包括在消費品醇工業(yè)(例如，啤酒和酒)、乳制品業(yè)(例如，發(fā)酵乳制品)、皮革業(yè)和煙草業(yè)中使用的發(fā)酵方法。本發(fā)明進一步涉及產生物質的方法，其包括(a)在有效量的本發(fā)明具有纖維二糖水解酶活性的多肽存在下，用有效量的包含一種或多種纖維素分解蛋白的組合物糖化纖維素材料；(b)用一種或多種發(fā)酵微生物發(fā)酵步驟(a)的糖化的纖維素材料；和(c)從發(fā)酵回收物質。包含具有纖維二糖水解酶活性的多肽的組合物可以是去除或不去除細胞的粗發(fā)酵液的形式，或者是半純化或純化的酶制備物形式，或者組合物可以包含本發(fā)明的宿主細胞，作為具有生物質的發(fā)酵方法中具有纖維二糖水解酶活性的多肽的來源。物質可以是任何源自發(fā)酵的物質。在優(yōu)選的實施方案中，物質是醇。可理解的是，術語“醇”包括含一個或多個羥基部分(moiety)的物質。在更優(yōu)選的實施方案中，所述醇是阿拉伯糖醇。在另一個更優(yōu)選的實施方案中，所述醇是丁醇。在另一個更優(yōu)選的實施方案中，所述醇是乙醇。在另一個更優(yōu)選的實施方案中，所述醇是甘油。在另一個更優(yōu)選的實施方案中，所述醇是甲醇。在另一個更優(yōu)選的實施方案中，所述醇是1，3_丙二醇。在另一個更優(yōu)選的實施方案中，所述醇是山梨醇。在另一個更優(yōu)選的實施方案中，所述醇是木糖醇。參見，例如，Gong，C.S.，Cao，N.J.，Du，J.和Tsao，G.T.，1999,Ethanolproductionfromrenewableresources,于AdvancesinBiochemicalEngineering/Biotechnology,Scheper,T.編，Springer-VerlagBerlinHeidelberg,Germany,65:207_241；Silveira,M.M.禾口Jonas，R.，2002，Thebiotechnologicalproductionofsorbitol,Appl.Microbiol.Biotechnol.59400~408；Nigam,P.禾口Singh,D.,1995,Processesforfermentativeproductionofxylitol-asugarsubstitute,ProcessBiochemistry30(2):117_124;Ezeii,T.C.,Qureshi,N.禾口Blaschek,H.P.,2003,Productionofacetone,butanolandethanolbyClostridiumbeijerinckiiBA101andinsiturecoverybygasstripping,WorldJournalofMicrobiologyandBiotechnology19(6):595_603。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述物質是有機酸。在另一個更優(yōu)選的實施方案中，所述有機酸是乙酸。在另一個更優(yōu)選的實施方案中，所述有機酸是醋酮酸。在另一個更優(yōu)選的實施方案中，所述有機酸是己二酸。在另一個更優(yōu)選的實施方案中，所述有機酸是抗壞血酸。在另一個更優(yōu)選的實施方案中，所述有機酸是檸檬酸。在另一個更優(yōu)選的實施方案中，所述有機酸是2，5-二酮-D-葡糖酸。在另一個更優(yōu)選的實施方案中，所述有機酸是蟻酸。在另一個更優(yōu)選的實施方案中，所述有機酸是反丁烯二酸。在另一個更優(yōu)選的實施方案中，所述有機酸是葡萄糖二酸。在另一個更優(yōu)選的實施方案中，所述有機酸是葡糖酸。在另一個更優(yōu)選的實施方案中，所述有機酸是葡糖醛酸。在另一個更優(yōu)選的實施方案中，所述有機酸是戊二酸。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述有機酸是3-羥基丙酸。在另一個更優(yōu)選的實施方案中，所述有機酸是衣康酸。在另一個更優(yōu)選的實施方案中，所述有機酸是乳酸。在另一個更優(yōu)選的實施方案中，所述有機酸是蘋果酸。在另一個更優(yōu)選的實施方案中，所述有機酸是丙二酸。在另一個更優(yōu)選的實施方案中，所述有機酸是草酸。在另一個更優(yōu)選的實施方案中，所述有機酸是丙酸。在另一個更優(yōu)選的實施方案中，所述有機酸是琥珀酸。在另一個更優(yōu)選的實施方案中，所述有機酸是木糖酸。參見，例如，Chen,R.，和Lee，Y.Y.，1997，Membrane-mediatedextractivefermentationforlacticacidproductionfromcellulosicbiomass，Appl.Biochem.Biotechnol.63—65:435_4480在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述物質是酮?？衫斫獾氖切g語“酮”包括含有一個或多個酮基的物質。在另一個更優(yōu)選的方面，所述酮是丙酮。參見，例如，Qureshi和Blaschek，2003，見上文。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述物質是氨基酸。在另一個更優(yōu)選的實施方案中，所述有機酸是天冬氨酸。在另一個更優(yōu)選的實施方案中，所述氨基酸是谷氨酸。在另一個更優(yōu)選的實施方案中，所述氨基酸是甘氨酸。在另一個更優(yōu)選的實施方案中，所述氨基酸是賴氨酸。在另一個更優(yōu)選的實施方案中，所述氨基酸是絲氨酸。在另一個更優(yōu)選的實施方案中，所述氨基酸是蘇氨酸。參見，例如，Richard，A.，和Margaritis，A.，2004，Empiricalmodelingofbatchfermentationkineticsforpoly(glutamicacid)productionandothermicrobialbiopolymers,BiotechnologyandBioengineering87(4):501_515o在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述物質是氣體。在另一個更優(yōu)選的實施方案中，所述氣體是甲烷。在另一個更優(yōu)選的實施方案中，所述氣體是H2。在另一個更優(yōu)選的實施方案中，所述氣體是co2。在另一個更優(yōu)選的實施方案中，所述氣體是CO。參見，例如，Kataoka，N.，A.Miya,禾口K.Kiriyama，1997，Studiesonhydrogenproductionbycontinuousculturesystemofhydrogen-producinganaerobicbacteria,WaterScienceandTechnology36(6-7):41_47；禾口GunaseelanV.N.inBiomassandnBioenergy，Vol.13(1-2)，pp.83-114，1997，Anaerobicdigestionofbiomassformethaneproduction:Areview。從纖維素材料產生物質通常需要四個主要步驟。這四個步驟是預處理、酶水解、發(fā)酵和回收。下面示例的是產生乙醇的過程，但可理解的是，可以使用相似的過程產生其它物質，例如，上述物質。預處理。在預處理或預水解步驟中，將纖維素材料加熱以分解木質素和碳水化合物結構，溶解大部分半纖維素，并使纖維素分解酶能夠到達纖維素部分。加熱或者直接用蒸汽進行，或者在漿料中進行，此時也可向材料加入催化劑以加速反應的進行。催化劑包括強酸，如硫酸和S02，或堿，如氫氧化鈉。預處理階段的目的是促進酶和微生物的滲透。纖維素生物質還可以經過水熱蒸汽爆炸預處理(參見美國專利申請?zhí)?0020164730)。糖化。在酶水解步驟(也稱作糖化)中，將本文所述酶加入預處理的材料中以將纖維素部分轉化成葡萄糖和/或其它糖。糖化通常在攪拌釜反應器或發(fā)酵罐中，在受控的PH、溫度和混合條件下進行。糖化步驟可以持續(xù)長達200小時。糖化可以在約30°C至約65°C，特別是約50°C的溫度，和約4-約5，尤其是約pH4.5的pH進行。為了產生能由酵母代謝的葡萄糖，通常在存在葡糖苷酶時進行水解。發(fā)酵。在發(fā)酵步驟中，作為預處理和酶水解步驟的結果從纖維素材料釋放的糖，通過發(fā)酵生物體(如酵母)發(fā)酵成為乙醇。發(fā)酵還可與酶水解在同一個容器中，同樣在受控的PH、溫度和混合條件下同時進行。當糖化和發(fā)酵在同一個容器中同時進行時，該方法通常稱作同步的糖化和發(fā)酵或SSF。在本發(fā)明的發(fā)酵過程中可以使用任何合適的纖維素底物或原材料。通常根據理想的發(fā)酵產品(即，要從發(fā)酵獲得的物質)和使用的方法來選擇底物，如本領域中所公知。適用于本發(fā)明的方法中的底物的實例包括含纖維素材料，如木材或植物殘余物或獲得自能夠由發(fā)酵微生物代謝的經處理的纖維素材料的低分子量糖DP1-3，所述物質可通過直接向發(fā)酵培養(yǎng)基中加入而提供。術語“發(fā)酵培養(yǎng)基”可理解為指加入發(fā)酵微生物之前的培養(yǎng)基，如，由糖化方法產生的培養(yǎng)基，以及同步的糖化和發(fā)酵方法(SSF)中使用的培養(yǎng)基?！鞍l(fā)酵微生物”指適用于理想的發(fā)酵方法中的任何微生物。合適的發(fā)酵微生物能將糖(如葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖或寡糖)直接或間接地發(fā)酵(即，轉化)成理想的發(fā)酵產物。發(fā)酵微生物的實例包括真菌生物體，如酵母。優(yōu)選的酵母包括酵母屬菌種的菌株，且具體為釀酒酵母。商業(yè)上可得到的酵母包括，例如REDSTAR/LesaffreEthanolRed(nJ/ARedStar/Lesaffre,USA)>FALI(nJ/AFleischmann'sYeast,BurnsPhilpFoodInc.，USA的部門獲得)、SUPERSTART(可從Alltech獲得)、GERTSTRAND(可從GertStrandAB,Sweden獲得)和FERMIOL(可從DSMSpecialties獲得)。在優(yōu)選的實施方案中，所述酵母是酵母屬菌種。在更優(yōu)選的實施方案中，所述酵母是釀酒酵母。在另一個更優(yōu)選的實施方案中，所述酵母是糖化酵母(Saccharomycesdistaticus)。在另一個更優(yōu)選的實施方案中，所述酵母是葡萄汁酵母(Saccharomycesuvarum)。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述酵母是克魯維酵母屬。在另一個更優(yōu)選的實施方案中，所述酵母是馬克思克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus)0在另一個更優(yōu)選的實施方案中，所述酵母是脆壁克魯維酵母(Kluyveromycesfragilis)0在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述酵母是念珠菌屬。在另一個更優(yōu)選的實施方案中，所述酵母是假熱帶念珠菌(Candidapseudotropicalis)0在另一個更優(yōu)選的實施方案中，所述酵母是蕓苔念珠菌(Candidabrassicae)0在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述酵母是棍孢屬(Clavispora)。在另一個更優(yōu)選的實施方案中，所述酵母是葡萄牙棍孢(Clavisporalusitaniae)。在另一個更優(yōu)選的實施方案中，所述酵母是仙人掌棍孢(Clavisporaopuntiae)0在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述酵母是管囊酵母屬(Pachysolen)。在另一個更優(yōu)選的實施方案中，所述酵母是管囊酵母(Pachysolentannophilus)0在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述酵母是酒香酵母屬(Bretarmomyces)。在另一個更優(yōu)選的實施方案中，所述酵母是克勞森酒香酵母(Bretannomycesclausenii)(Philippidis,G.P.，1996，Cellulosebioconversiontechnology,于HandbookonBioethanol:ProductionandUtilization,ffyman,C.E.編，Taylor&Francis,Washington,DC,179-212)。可以有效地將葡萄糖發(fā)酵成乙醇的細菌包括，例如，運動發(fā)酵單胞菌(Zymomonasmobilis)和熱纖維梭菌(Clostridiumthermocellum)(Philippidis，1996，見上文)。在本領域中公知上述生物體還能用于產生其它物質，如本文所述。$酉良胃—(Chen,Z.，Ho,N.ff.Y.,1993,CloningandimprovingtheexpressionofPichiastipitisxylosereductasegeneinSaccharomycescerevisiae,Appl.Biochem.Biotechnol.39-40:135—147；Ho,N.ff.Y.，Chen,Z,Brainard,A.P.，1998,GeneticallyengineeredSaccharomycesyeastcapableofeffectivelycofermentingglucoseandxylose,Appl.Environ.Microbiol.641852-1859)或在細菌如大腸桿菌(Beall,D.S.,Ohta,K.,Ingram,L.0.,1991,ParametricstudiesofethanolproductionfromxyloseandothersugarsbyrecombinantEscherichiacoli,Biotech.Bioeng.38296-303)、產酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)(Ingram,L.0.，Gomes,P.F.，Lai,X.，Moniruzzaman,M.,Wood,B.E.,Yomano,L.P.,York,S.ff.,1998,Metabolicengineeringofbacteriaforethanolproduction，Biotechnol.Bioeng.58:204_214)禾口運動發(fā)酵單胞菌(zhang,M.,Eddy,C.,Deanda,K.,Finkelstein,M.,禾口Picataggio,S.,1995,MetabolicengineeringofapentosemetabolismpathwayinethanologenicZymomonasmobilis,Science267:240_243；Deanda,K.,Zhang,M.,Eddy,C.,禾口Picataggio,S.,1996,Developmentofanarabinose-fermentingZymomonasmobilisstrainbymetabolicpathwayengineering,Appl.Environ.Microbiol.624465-4470)中克隆異源基因導致構建能將己糖和戊糖轉化成乙醇(共發(fā)酵)的生物體。通常向降解的纖維素或水解產物中加入酵母或另一種微生物，進行約24至96小時的發(fā)酵，如約35至約60小時。溫度通常在約26°C-約40°C，特別是約32°C，并在約pH3至約pH6，特別是約pH4-5進行。在優(yōu)選的實施方案中，將酵母或另一種微生物施用于降解的纖維素或水解產物，且發(fā)酵進行約24至約96小時，如通常35-60小時。在優(yōu)選的實施方案中，溫度通常在約26至約40°C之間，特別是約32°C，而pH通常在約pH3至約pH6，優(yōu)選約pH4_5。優(yōu)選以大約105至1012，優(yōu)選大約107至101(1，特別是大約5xl07活菌計數每ml發(fā)酵液的量施用酵母或另一種微生物。在乙醇產生階段的過程中，酵母細胞計數應該優(yōu)選在大約107至10"1的范圍內，尤其是約2xl08。關于使用酵母進行發(fā)酵的其它指導可見于例如“TheAlcoholTextbook，，(K.Jacques,T.P.Lyons禾口D.R.Kelsall編，NottinghamUniversityPress,UnitedKingdom1999)中，所述文獻通過提述并入本文。本領域最廣泛使用的方法是同步的糖化和發(fā)酵(SSF)方法，其中沒有糖化的保留階段，意味著酵母和酶是一起添加的。對于乙醇產生，在發(fā)酵后蒸餾醪(mash)以提取乙醇。根據本發(fā)明的方法獲得的乙醇可以用作，例如燃料乙醇；飲用乙醇，即，中性飲料酒(potableneutralspirits)，或工業(yè)乙醇。發(fā)酵刺激劑可以與本文所述的任何酶方法組合使用，以進一步改進發(fā)酵方法，而且特定地，改進發(fā)酵微生物的性能，如，速率增加和乙醇得率。“發(fā)酵刺激劑”指用于發(fā)酵微生物(特別是酵母)生長的刺激劑。優(yōu)選的用于生長的發(fā)酵刺激劑包括維生素和礦物質。維生素的實例包括多種維生素、生物素、泛酸(鹽)、煙酸、內消旋肌醇(meso-inositol)、硫胺素、維生素B6(pyrid0Xine)、對氨基苯甲酸、葉酸、核黃素和維生素A、B、C、D和E。參見，例如，Alfenore等，ImprovingethanolproductionandviabilityofSaccharomycescerevisiaebyavitaminfeedingstrategyduringfed-batchprocess,Springer-Verlag(2002)，其通過提述并入本文。礦物質的實例包括能夠提供營養(yǎng)物的礦物質和礦物質鹽，所述營養(yǎng)物包括P、K、Mg、S、Ca、Fe、Zn、Mn和Cu。Ml。從發(fā)酵的纖維素材料中分離醇，并通過常規(guī)的蒸餾方法純化。能夠獲得純度高達約96體積％乙醇的乙醇，其可以用作，例如，燃料乙醇、飲用乙醇(即，中性飲料酒)或工業(yè)乙醇。對于其它物質，可以使用本領域已知的任何方法，所述方法包括但不限于層析(例如，離子交換、親和、疏水、層析聚焦和大小排阻)、電泳方法(例如，制備型等電聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸銨沉淀)、SDS-PAGE、蒸餾或提取。在本發(fā)明的方法中，可以向具有纖維二糖水解酶活性的多肽和其它纖維素分解蛋白補充一種或多種其它酶活性，以改進纖維素材料的降解。優(yōu)選的其它酶是半纖維素酶、酯酶(例如，脂肪酶、磷脂酶和/或角質酶)、蛋白酶、漆酶、過氧化物酶，或它們的混合物。在本發(fā)明的方法中，可以在發(fā)酵前或發(fā)酵過程中(包括在發(fā)酵微生物繁殖的過程中或之后)加入其它酶。洗滌劑組合物本發(fā)明還涉及洗滌劑組合物，其包含表面活性劑和本發(fā)明的具有纖維二糖水解酶活性的多肽?？梢约尤胨鼍哂欣w維二糖水解酶活性的多肽并由此使其成為洗滌劑組合物的組分。例如，本發(fā)明的洗滌劑組合物可以配制成手洗或機洗洗滌劑組合物，其包括適合于預處理沾污織物的洗衣添加劑組合物和漂洗添加的織物柔軟劑組合物；或者可以配制成用于一般家庭硬表面清潔操作的洗滌劑組合物；或者配制用于手洗或機洗洗碗操作。在具體的方面，本發(fā)明提供包含本發(fā)明具有纖維二糖水解酶活性的多肽的洗滌劑添加劑。洗滌劑添加劑以及洗滌劑組合物可以包含一種或多種其它的酶，如蛋白酶、脂肪酶、角質酶(cutinase)、淀粉酶、糖酶、纖維素酶、果膠酶、甘露聚糖酶(marmanase)、阿拉伯糖酶(arabinase)、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶，例如漆酶，和/或過氧化物酶。通常酶組分的性質應與選擇的洗滌劑相容(即，最適pH、與其它酶和非酶成分的相容性等)，并且所述酶組分應該以有效量存在。蛋白酶合適的蛋白酶包括動物、植物或微生物來源的那些。微生物來源是優(yōu)選的。包括化學修飾的或蛋白質工程的突變體。蛋白酶可以是絲氨酸蛋白酶或金屬蛋白酶，優(yōu)選是堿性微生物蛋白酶或胰蛋白酶-樣蛋白酶。堿性蛋白酶的實例是枯草蛋白酶，特別是源自芽孢桿菌屬的那些枯草蛋白酶，例如，枯草蛋白酶Novo、枯草蛋白酶Carlsberg、枯草蛋白酶309、枯草蛋白酶147和枯草蛋白酶168(在W089/06279中描述)。胰蛋白酶-樣蛋白酶的實例是胰蛋白酶(例如，豬或牛來源的)和W089/06270和W094/25583中描述的鐮孢屬蛋白酶。有用的蛋白酶的實例是W092/19729,W098/20115,W098/20116和W098/34946中描述的變體，特別是在以下位置中的一個或多個具有取代的變體27、36、57、76、87、97、101、104、120、123、167、170、194、206、218、222、224、235和274。優(yōu)選的商業(yè)上能夠獲得的蛋白酶包括ALCALASE、SAVINASE、PRIMASE、DURALASE、ESPERASE、和KANNASE(NovozymesA/S)、MAXATASE、MAXACAL、MAXAPEM、PROPERASE、PURAFECT、PURAFECTOXP、FN2和FN3(GenencorInternationalInc.)。MM:合適的脂肪酶包括細菌或真菌來源的那些。包括化學修飾的或蛋白質工程的突變體。有用的脂肪酶的實例包括來自腐質霉屬(同物異名嗜熱霉屬(Thermomyces))的脂肪酶，例如EP258068和EP305216中所述來自疏棉狀腐質霉(細毛嗜熱霉(T.lanuginosus))的脂肪酶或W096/13580中所述來自特異腐質霉的脂肪酶；假單胞菌屬(Pseudomonas)脂肪酶，例如來自產堿假單胞菌(P.alcaligenes)或類產堿假單胞菌(P.pseudoalcaligenes)(EP218272)、洋蔥假單胞菌(P.cepacia)(EP331376)、施氏假單胞菌(P.stutzeri)(GB1，372，034)、熒光假單胞菌(P.fluorescens)、假單胞菌屬菌種菌株SD705(W095/06720和W096/27002)、威斯康辛假單胞菌(P.wisconsinensis)(W096/12012)；芽孢桿菌屬脂肪酶，例如來自枯草芽孢桿菌(Dartois等，1993，BiochemicaetBiophysicaActa，1131，253-360)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(JP64/744992)或短小芽孢桿菌(W091/16422)。其它例子是脂肪酶變體，如在W092/05249,W094/01541、EP407225,EP260105、W095/35381、W096/00292、W095/30744、W094/25578、W095/14783、W095/22615、W097/04079和W097/07202中描述的那些變體。優(yōu)選的商業(yè)上能夠獲得的脂肪酶包括LIP0LASE、LIPEX和LIP0LASEULTRA(NovozymesA/S)。淀粉酶合適的淀粉酶(a和/或0)包括細菌或真菌來源的那些。包括化學修飾的或蛋白質工程的突變體。淀粉酶包括，例如，獲得自芽孢桿菌屬，例如地衣芽孢桿菌的特殊菌株的a-淀粉酶，在GB1，296，839中有更詳細的描述。有用的淀粉酶的實例是W094/02597,W094/18314,W096/23873和W097/43424中描述的變體，特別是在以下位置中的一個或幾個具有取代的變體15、23、105、106、124、128、133、154、156、181、188、190、197、202、208、209、243、264、304、305、391、408和444。商業(yè)上能夠獲得的淀粉酶是DURAMYLtm、TERMAMYLtm、FUNGAMYL和BAN(NovozymesA/S)，RAPIDASE和PURASTAR(來自GenencorInternationalInc.)。纖維素酶合適的纖維素酶包括細菌或真菌來源的那些。包括化學修飾的或蛋白質工程的突變體。合適的纖維素酶包括來自芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、腐質霉屬、鐮孢屬、梭孢殼屬、枝頂孢霉屬的纖維素酶，例如從特異腐質霉、嗜熱毀絲霉和尖鐮孢產生的真菌纖維素酶，其在美國專利4，435，307號、美國專利5，648，263號、美國專利5，691，178號、美國專利5，776，757號和W089/09259中公開。特別合適的纖維素酶是具有顏色保護益處的堿性或中性纖維素酶。這些纖維素酶的實例是EP0495257、EP0531372、W096/11262、W096/29397、W098/08940中描述的纖維素酶。其它實例是纖維素變體如WO94/07998、EP0531315、美國專利5，457，046號、美國專利5，686，593號、美國專利5，763，254號、W095/2447UW098/12307和PCT/DK98/00299中描述的那些變體。商業(yè)上能夠獲得的纖維素酶包括CELLUZYME，和CAREZYME(NovozymesA/S)，CLAZINASE禾口PURADAXHA(GenencorInternationallnc.),禾口KAC—500(B)(KaoCorporation)。過氧化物酶/氧化酶合適的過氧化物酶/氧化酶包括植物、細菌或真菌來源的那些。包括化學修飾的或蛋白質工程的突變體。有用的過氧化物酶的實例包括來自鬼傘屬(Coprinus)例如來自灰蓋鬼傘(C.cinereus)的過氧化物酶，和它們的變體，如W093/24618,W095/10602和W098/15257中所述的那些變體。商業(yè)上能夠獲得的過氧化物酶包括GUARDZYME(NovozymesA/S)?？梢酝ㄟ^加入含有一種或多種酶的單獨的添加劑，或通過加入包含全部這些酶的組合添加劑，將酶成分包括在洗滌劑組合物中?？梢詫⒈景l(fā)明的洗滌劑添加劑，即單獨添加劑或組合添加劑，配制成例如顆粒、液體、漿料等。優(yōu)選的洗滌劑添加劑劑型是顆粒，特別是無粉塵的顆粒；液體，特別是穩(wěn)定化的液體；或漿料。無粉塵的顆?？梢岳缛缑绹鴮＠?，106，991和4，661，452號中所公開的產生，并且可以任選地通過本領域已知的方法進行包覆。蠟質包覆材料的實例是具有1000-20000的平均摩爾量(meanmolarweight)的聚(環(huán)氧乙烷)產品(聚乙二醇，PEG)；具有16-50個環(huán)氧乙烷單位的乙氧基化壬基酚；乙氧基化的脂肪醇，其中所述醇含有12-20個碳原子且其中存在15-80個環(huán)氧乙烷單位；脂肪醇；脂肪酸；和脂肪酸的單-和二-和三酸甘油酯。適于通過流化床技術施用的成膜包覆材料的實例在GB1483591中給出。例如，可以通過根據已確定的方法添加多羥基化合物如丙二醇、糖或糖醇、乳酸或硼酸來使液體酶制備物穩(wěn)定化。受保護的酶(protectedenzyme)可根據EP238,216中公開的方法來制備。本發(fā)明的洗滌劑組合物可以是任何方便的形式，例如，條、片劑、粉劑、顆粒(granule)、糊劑(paste)或液體。液體洗滌劑可以是含水的，通常含有多至70%水和0-30%有機溶劑；或者是非水的。洗滌劑組合物包含一種或多種表面活性劑，所述表面活性劑可以是非離子的包括半_極性的和/或陰離子的和/或陽離子的和/或兩性離子的。表面活性劑通常以按重量計0.-60%的水平存在。當包括于其中時，洗滌劑通常會含有約至約40%的陰離子表面活性劑，例如直鏈烷基苯磺酸酯(linearalkylbenzenesulfonate),a-烯烴磺酸酯、烷基硫酸酯(脂肪醇硫酸酯)、醇乙氧基硫酸酯(alcoholethoxysulfate)、仲烷基磺酸酯(secondaryalkanesulfonate)、a-磺基脂肪酸甲酯、烷基-或烯基琥珀酸或肥皂(soap)。當包括于其中時，洗滌劑通常會含有約0.2%至約40%的非離子表面活性劑，如醇乙氧基化物、壬基酚乙氧基化物、烷基聚苷(alkylpolyglycoside)、烷基二甲胺氧化物(alkyldimethylamineoxide)、乙氧基化的脂肪酸單乙醇酰胺(ethoxylatedfattyacidmonoethanolamide)、脂肪酸單乙醇酰胺、多羥基烷基脂肪酸酰胺，或葡糖胺的N-?；鵑-烷基衍生物(“葡糖酰胺(glucamides)，，)。洗滌劑可以含有0-65%的洗滌劑增效劑(builder)或絡合劑如沸石、二磷酸鹽/酯、三磷酸鹽/酯、膦酸鹽/酯(phosphonate)、碳酸鹽/酯、檸檬酸鹽/酯、氮川三乙酸(nitrilotriaceticacid)、乙二胺四乙酸、二亞乙基三胺五乙酸、烷基-或烯基琥珀酸、可溶性硅酸鹽或層狀硅酸鹽(例如來自Hoechst的SKS-6)。洗滌劑可包含一種或多種聚合物。實例是羧甲基纖維素、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(乙二醇)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯吡啶-N-氧化物)、聚(乙烯基咪唑)、聚羧酸鹽/酯(polycarboxylate)如聚丙烯酸鹽/酯、馬來酸/丙烯酸共聚物和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物。洗滌劑可含有漂白體系，所述體系可包含H202源如過硼酸鹽或過碳酸鹽，可將其與形成過酸的漂白活化劑如四乙酰乙二胺或壬酰氧基苯磺酸酯(nonanoyloxybenzenesulfonate)組合?？晒┻x擇的是，漂白體系可包含過氧酸，例如酰胺、酰亞胺或砜型的過氧酸?？梢允褂贸Ｒ?guī)穩(wěn)定劑使本發(fā)明的洗滌劑組合物中的酶組分穩(wěn)定化，所述穩(wěn)定劑例如，多羥基化合物如丙二醇或甘油，糖或糖醇，乳酸，硼酸或硼酸衍生物，例如，芳族硼酸酯，或苯基硼酸(phenylboronicacid)衍生物如4_甲酰苯基硼酸，并且所述組合物可如例如W092/19709和W092/19708中所述配制。洗滌劑也可含有其它常規(guī)洗滌劑成分如織物調節(jié)劑，包括粘土、泡沫促進劑、抑泡劑、抗腐蝕劑、懸污劑、防污物再沉積劑、染料、殺菌劑、光學增亮劑、助水溶物(bydrotrope)、晦暗抑制劑(tarnishinhibitors)或香料。在洗滌劑組合物中，可以以相當于每升洗滌液0.01-100mg酶蛋白，優(yōu)選每升洗滌液0.05-5mg酶蛋白，特別是每升洗滌液0.1-lmg酶蛋白的量加入任何酶組分，特別是本發(fā)明的具有纖維二糖水解酶活性的多肽?？梢灶~外地將本發(fā)明的具有纖維二糖水解酶活性的多肽并入W097/07202中公開的洗滌劑配方，在此將W097/07202并入作為參考。信號月太本發(fā)明還涉及核酸構建體，所述核酸構建體包含編碼蛋白質的基因，其中所述基因與編碼信號肽的核苷酸序列可操作地連接，所述信號肽包含SEQIDN02的氨基酸1到17，或由SEQIDNO:2的氨基酸1至17組成，其中所述基因對于所述核苷酸序列是外源的。在一個優(yōu)選的方面，所述核苷酸序列包含SEQIDNO:1的核苷酸1-51或由SEQIDN0:1的核苷酸1-51組成。本發(fā)明還涉及包含這樣的核苷酸構建體的重組表達載體和重組宿主細胞。本發(fā)明還涉及產生蛋白質的方法，包括(a)在適合于產生所述蛋白質的條件下培養(yǎng)這樣的重組宿主細胞；和(b)回收所述蛋白質。所述蛋白質對于宿主細胞可以是天然的或異源的。術語“蛋白質”在本文的意思不是指具體長度的編碼產物，并因此包括肽、寡肽和蛋白質。術語“蛋白質”還包括組合以形成編碼產物的兩種或兩種以上多肽。所述蛋白質還包括雜合多肽，其包含部分或全部多肽序列的組合，所述多肽序列從至少兩種不同的蛋白質獲得，其中一種或多種(幾種)對于宿主細胞可以是異源或天然的。蛋白質進一步包括上述蛋白質和雜合蛋白質天然存在的等位基因變異和工程化的變異。優(yōu)選地，蛋白質是激素或其變體、酶、受體或其部分、抗體或其部分，或報告蛋白(reporter)。在一個更優(yōu)選的方面，所述蛋白質是氧化還原酶、轉移酶、水解酶、裂合酶(lyase)、異構酶或連接酶。在更加優(yōu)選的方面，所述蛋白質是氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維素酶、幾丁質酶、角質酶、環(huán)糊精糖基轉移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、a-半乳糖苷酶、3-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、a-葡糖苷酶、3-葡糖苷酶、轉化酶、漆酶、另外的脂肪酶、甘露糖苷酶、變聚糖酶(mutanase)、氧化酶、果膠分解酶、過氧化物酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉谷氨酰胺酶或木聚糖酶?；蚩梢垣@得自任何原核、真核或其它來源。通過以下實施例進一步對本發(fā)明進行描述，但不應將其理解為對本發(fā)明范圍的限制。實施例材料用作緩沖液和底物的化學品是至少試劑級的商業(yè)產品。菌株使用嗜熱毀絲霉CBS202.75作為具有纖維二糖水解酶活性的家族6多肽的基因的來源。使用米曲霉JaL355菌株(W02002/40694)用于表達編碼具有纖維二糖水解酶活性的多肽的嗜熱毀絲霉基因。培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基平板每升由6gNaN03、0.52gKCl、1.52gKH2P04、lmlCOVE痕量元素溶液、20gNoble瓊脂、20ml50%葡萄糖、2.5mlMgS04*7H20和20ml0.02%生物素溶液組成。COVE痕量元素溶液每升由0.04gNa2B40710H20、0.4gCuS045H20、1.2gFeS047H20、0.7gMnS04H20、0.8gNa2Mo022H20和lOgZnS047H20組成。MDU2BP培養(yǎng)基每升由45g麥芽糖、lgMgS04.7H20、lgNaCl、2gK2S04、12gKH2P04、7g酵母提取物、2g尿素和0.5mlAMG痕量金屬溶液；pH5.0組成。AMG痕量金屬溶液每升由14.3gZnS047H20、2.5gCuS045H20、0.5gNiCl26H20、13.8gFeS047H20、8.5gMnS047H20和3g檸檬酸組成。YEG培養(yǎng)基每升由20g右旋糖(dextrose)和5g酵母提取物組成。實施例1嗜熱毀絲霉CBS202.75基因組DNA提取將嗜熱毀絲霉CBS202.75在帶擋板的搖瓶中的100mlYEG培養(yǎng)基中于45°C和200rpm培養(yǎng)2天。使用MIRACLOTH(Calbiochem,LaJolla,CA，USA)通過過濾收集菌絲體，在去離子水中洗滌兩次，并在液氮中冷凍。將冷凍的菌絲體通過研缽和杵磨成細粉，并使用DNEASYPlantMaxiKit(QIAGENInc.,Valencia,CA,USA)分離總DNA。實施例2從嗜熱毀絲霉CBS202.75分離全長家族6纖維二糖水解酶基因(cel6a)使用GEN0MEWALKERUniversalKit(ClontechLaboratories,Inc.，MountainView,CA,USA)按照制造商的說明書從嗜熱毀絲霉CBS202.75分離全長家族6纖維二糖水解酶基因(cel6a)。簡言之，用四種不同的產生平末端的限制酶(DraI、EcoRV、PvuII和StuI)分別消化來自嗜熱毀絲霉CBS202.75的全基因組DNA。然后將各個批次消化的基因組DNA分別連接到GEN0MEWALKERAdaptor(ClontechLaboratories,Inc.，MountainView,CA,USA)以創(chuàng)建四種文庫。然后將這些文庫用作PCR反應中的模板，所述PCR反應使用下文所示的兩種基因特異性引物，一種用于首次PCR，一種用于二次PCR。所述引物是根據來自嗜熱毀絲霉的部分家族6纖維二糖水解酶基因(cel6a)序列(W02004/056981)設計的。引物MtCel6a_R45'-ATTGGCAGCCCGGATCTGGGACAGAGTCTG-3'(SEQIDNO3)引物MtCel6a_R55'-CCGGTCATGCTAGGAATGGCGAGATTGTGG-3'(SEQIDNO4)首次擴增由1Pi(約6ng)的各文庫作為模板,0.4mMdATP、dTTP、dGTP和dCTP中的每一種，lOpmolAdaptor弓|物1(ClontechLaboratories,Inc.,MountainView,CA,USA)，lOpmol引物MtCel6a-R4，2u1IXADVANTAGEGC-MeltLA緩沖液(ClontechLaboratories,Inc.，MountainView,CA,USA)和1.25單位的ADVANTAGEGC基因組聚合酶混合物(GenomicPolymeraseMix)(ClontechLaboratories,Inc.,MountainView,CA,USA)組成，終體積為25yl。使用EPPENDORFMASTERCYCLER5333(EppendorfScientific,Inc.,ffestbury,NY,USA)進行擴增，程序為94°C預變性1分鐘；7個循環(huán)，每個循環(huán)在94°C的變性溫度30秒；在72°C退火和延伸5分鐘；和32個循環(huán)，每個循環(huán)在67°C5分鐘。二次擴增由1Pi的各首次PCR產物作為模板，0.4mMdATP、dTTP、dGTP和dCTP中的*—禾中，lOpmolAdaptor弓|2(ClontechLaboratories,Inc.，MountainView,CA,USA),lOpmol弓丨物MtCel6a_R5，IXADVANTAGEGC-MeltLABuffer和l.25單位的ADVANTAGEGC基因組聚合酶混合物組成，終體積為25yl。使用EPPENDORFMASTERCYCLER5333進行擴增，程序為94°C預變性1分鐘；5個循環(huán)，每個循環(huán)在94°c的變性溫度30秒；在72°C退火和延伸5分鐘；和20個循環(huán)，每個循環(huán)在67°C5分鐘。通過使用40mMTris堿-20mM乙酸鈉-lmMEDTA二鈉(TAE)緩沖液的1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離反應產物，其中將來自EcoRV文庫的3.5kb產物條帶從凝膠切下，使用QIAQUICK凝膠提取試劑盒(QIAGEN，Valencia，CA，USA)按照制造商的說明書純化，并測序。實施例3編碼家族6纖維二糖水解酶的嗜熱毀絲霉基因組序列的表征對3.5kbPCR片段的DNA測序使用染料終止物化學(Giesecke等，1992，JournalofVirologyMethods38:47_60)和引物步移策略以Perkin-ElmerAppliedBiosystemsModel377XL自動DNA測序儀(Perkin-Elmer/AppliedBiosystems,Inc.，FosterCity,CA,USA)進行。使用了以下基因特異性引物進行測序MtCel6a-F25，-GCTGTAAACTGCGAATGGGTTCAG-3‘(SEQIDNO5)MtCel6a-F35，-GGGTCCCACATGCTGCGCCT-3，(SEQIDNO6)MtCel6a-R85，-AAAATTCACGAGACGCCGGG-3，(SEQIDNO7)仔細檢查核苷酸序列數據的質量并且在PHRED/PHRAP軟件(UniversityofWashington,Seattle,WA，USA)的輔助下將全部序列相互比較。將3.5kb序列與來自嗜熱毀絲霉的部分家族6纖維二糖水解酶基因(cel6a)序列(W02004/056981)比較并比對。根據編碼的蛋白質與來自土生梭孢霉、嗜熱毛殼、特異腐質霉和里氏木霉的同源糖苷水解酶家族6蛋白的相似性構建了用于嗜熱毀絲霉序列的基因模型。所述核苷酸序列(SEQIDNO1)和推導的氨基酸序列(SEQIDNO2)示于圖1A和1B。該基因組片段編碼482個氨基酸的多肽，其被96、87、和180bp的3個內含子中斷。所述基因和成熟編碼序列的％6+(含量分別為61.6%和64%。使用SignalP軟件程序(Nielsen等，1997，ProteinEngineeringlO:1_6)，預測了17個殘基的信號肽。預測的成熟蛋白含有465個氨基酸，具有49.3kDa的分子量。使用如EMBOSS的Needle程序中執(zhí)行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48:443_453)，以缺口產生罰分10、缺口延伸罰分0.5和EBL0SUM62矩陣確定了氨基酸序列的比較型配對全局比對。所述比對顯示，編碼具有纖維二糖水解酶活性的CEL6A成熟多肽的嗜熱毀絲霉基因的推導氨基酸序列分別與來自嗜熱毛殼和特異腐質霉的兩種糖苷水解酶家族6蛋白的推導氨基酸序列(GeneSeqP登錄號分別為ADP84824和AAW44853)共享78.6%和77.6%同一性(不包括缺口)。實施例4嗜熱毀絲霉纖維二糖水解酶基因(cel6a)的克隆和米曲霉表達載體的構建設計了下文所示的兩種合成寡核苷酸引物以從實施例1中制備的基因組DNAPCR擴增嗜熱毀絲霉纖維二糖水解酶基因。使用InFusion克隆試劑盒(BDBiosciences,PaloAlto,CA，USA)直接將所述片段克隆到表達載體PAlLo2(W02004/099228)中，無需限制酶消化和連接。MtCel6a-F45，-ACTGGATTTACCATGGCCAAGAAGCTTTTCATCACC-3，(SEQIDNO8)MtCel6a-R95，-TACCCTCTAGTTAATTAATTAGAAGGGCGGGTTGGCGT-3，(SEQIDNO9)粗體字代表編碼序列。余下的序列與PAlLo2的插入位點同源。將50皮摩爾的以上各種引物用于PCR反應，所述PCR反應由lOOng嗜熱毀絲霉基因組DNA，2u1IXADVANTAGEGC-MeltLA緩沖液，0.4mMdATP、dTTP、dGTP和dCTP中的每一種，和l.25單位的ADVANTAGEGC基因組聚合酶混合物組成，終體積為25iil。所述擴增使用EPPENDORFMASTERCYCLER5333進行，程序為1個循環(huán)的94°c1分鐘；和30個循環(huán)，每個在94°C30秒，62°C30秒，和72°C2分鐘。然后使加熱塊(heatblock)轉到4°C浸漬循環(huán)(soakcycle)。將反應產物通過使用TAE緩沖液的1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離，其中將1842bp的產物條帶從凝膠切下，并使用qiAQUICK凝膠提取試劑盒按照制造商的說明書純化。將質粒pAlLo2(W02004/099228)用NcoI和PacI消化，通過使用TAE緩沖液的1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離，并使用qiAQUICK凝膠提取試劑盒按照制造商的說明書純化。將所述基因片段和消化的載體使用Infusion克隆試劑盒連接在一起得到pSMail80(圖2)，在pSMail80中纖維二糖水解酶基因的轉錄在來自黑曲霉中性a-淀粉酶基因和米曲霉丙糖磷酸異構酶基因的啟動子雜合體(NA2_tpi啟動子)的控制下。連接反應(50u1)由IXInFusion緩沖液(BDBiosciences,PaloAlto,CA,USA)、IXBSA(BDBiosciences,PaloAlto,CA,USA)>1U1Infusiong|(110##)(BDBiosciences,PaloAlto，CA，USA)、100ng用NcoI和PacI消化的pAlLo2和50ng嗜熱毀絲霉cel6a純化的PCR產物組成。將所述反應在室溫培育30分鐘。使用1yl的反應物轉化大腸桿菌XL10SOLOPACKGold超感受態(tài)細胞(Stratagene，LaJolla，CA，USA)。通過限制酶消化檢測到了含有pSMail80的大腸桿菌轉化體，并使用BIOROBOT9600(QIAGENInc.，Valencia,CA,USA)制備了質粒DNA。通過DNA測序確認了pSMail80中的嗜熱毀絲霉cel6a插入物。使用T0P0TACLONING試劑盒將同一1842bpPCR片段克隆到pCR2.1-T0P0載體(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)中，以產生pSMail82(圖2)。通過DNA測序確認了pSMail82中的嗜熱毀絲霉ce16a插入物。將大腸桿菌pSMail82于2007年9月6日保藏在農業(yè)研究機構專利培養(yǎng)物保藏中心(AgriculturalResearchServicePatentCultureCollection)，北區(qū)石if究中心(NorthernRegionalResearchCenter),Peoria,IL,USA。實施例6嗜熱毀絲霉家族6纖維二糖水解酶cel6a基因在米曲霉JaL355中的表達根據Christensen等，1988，Bio/Technology6:1419_1422的方法制備了米曲霉JaL355(W02002/40694)原生質體。使用3iigpSMail80轉化米曲霉JaL355。用pSMail80轉化米曲霉JaL355生成了約50個轉化體。將20個轉化體分離至單獨的基本培養(yǎng)基平板。用5ml0.01%TWEEN20洗滌20個轉化體的匯合的基本培養(yǎng)基平板，再分別接種至125ml玻璃搖瓶中的25mlMDU2BP培養(yǎng)基中，并在34°C、250rpm培育。培育5天之后，將來自各個培養(yǎng)物的5u1上清液在帶有CRITERIONCell(Bio-RadLaboratories,Hercules,CA,USA)的CRITERIONTris-HCl凝膠上(Bio-RadLaboratories,Hercules,CA,USA)按照制造商的說明書進行分析。所得凝膠用BI0-SAFE考馬斯染料(Bio-RadLaboratories,Hercules,CA,USA)來染色。培養(yǎng)物的SDS-PAGE譜顯示大部分轉化體具有約70kDa的主帶。將指名為轉化體14的一個轉化體的匯合平板用10ml0.01%TWEEN20洗滌并接種到含有500mlMDU2BP培養(yǎng)基的2升Fernbach中以產生用于表征酶的培養(yǎng)液。在第5天收獲培養(yǎng)物并使用0.22iimEXPRESSTMPlus膜(Millipore，Bedford,MA,USA)過濾。實施例7嗜熱毀絲霉CEL6A纖維二糖水解酶的表征在美國能源部國家可再生能源實驗室(U.S.DepartmentofEnergyNationalRenewableEnergyLaboratory)(NREL)，Boulder，C0，USA使用稀硫酸預處理玉米秸稈。使用以下條件進行預處理在190°C和25%w/w干固體條件下，每克干生物質0.048g硫酸，進行大約1分鐘。經預處理的玉米秸稈(PCS)中的水不溶性固體含有53.2%纖維素、3.6%半纖維素和29.8%木質素。使用NREL標準分析規(guī)程#002通過兩階段硫酸水解和后續(xù)的通過高效液相層析進行的糖類分析測定了纖維素和半纖維素。使用NREL標準分析規(guī)程#003在用硫酸水解纖維素和半纖維素級分之后以重量分析測定了木質素。在酶水解之前，用大量蒸餾水洗滌PCS直到pH高于4.0，然后從100目的篩子篩過，并最終在121°C高壓滅菌30分鐘。發(fā)現經洗滌并過篩的PCS的干內容物為6.54%。使用EC0N0-PAC10DG柱(Bio-RadLaboratories,Inc.，Hercules,CA,USA)對如實施例6中所述制備的嗜熱毀絲霉CEL6A纖維二糖水解酶的搖瓶培養(yǎng)液進行脫鹽。使用微量板BCA蛋白測定試劑盒(MicroplateBCAProteinAssayKit)(Pierce,Rockford,IL,USA)測定了蛋白濃度?？寺±锸夏久笴EL7B內切葡聚糖酶I并在米曲霉JaL250中表達，如TO2005/067531中所述。使用微量板BCA蛋白測定試劑盒測定了蛋白濃度。使用HIPREP26/10脫鹽柱(GEHealthcareLifeSciences,Piscataway,NJ,USA)按照制造商的說明書將里氏木霉CEL7B內切葡聚糖酶I脫鹽并緩沖液交換至150mMNaCl-20mM乙酸鈉pH5.0。如W02004/099228中所述重組制備了米曲霉Cel3A0-葡糖苷酶，并且如Langston等，2006，Biochim-Biophys.ActaProteinsProteomics1764:972_978所述進行了純化。使用微量板BCA蛋白測定試劑盒測定了蛋白質濃度。重組產生了巴西青霉(Penicilliumbrasilianum)IBT20888Cel3A3-葡糖苷酶并且使用HIPREP26/10脫鹽柱如上進行脫鹽，并使用AKTAFPLC系統(tǒng)(GEHealthcareLifeSciences,Piscataway,NJ,USA)按照制造商的說明書以Mono柱進一步純化。如W02005/056772中所述從里氏木霉RutC30分離了里氏木霉CEL6A纖維二糖水解酶基因。根據美國專利申請20060156437中所述步驟使用pEJG61作為表達載體在鑲片鐮孢中表達了所述里氏木霉CEL6A纖維二糖水解酶基因。如美國專利申請20060156437中所述進行發(fā)酵。使用微量板BCA蛋白測定試劑盒測定了蛋白質濃度。使用HIPREP26/10脫鹽柱按照制造商的說明書對里氏木霉CEL6A纖維二糖水解酶進行脫鹽并緩沖液交換至20mM乙酸鈉-150mMNaClpH5.0。PCS的水解在用平板密封物(ALPS-300，Abgene，Epsom,UK)密封的96深孔板(AxygenScientific,UnionCity，CA，USA)中進行，總反應體積為1.0ml。為了測試嗜熱毀絲霉纖維二糖水解酶的活性，以lmg纖維二糖水解酶每克纖維素連同0.5mg米曲霉葡糖苷酶每克纖維素加樣PCS。使用里氏木霉CEL6A纖維二糖水解酶(lmg每克纖維素)連同米曲霉0-葡糖苷酶(0.5mg每克纖維素)作為對照用于與嗜熱毀絲霉CEL6A纖維二糖水解酶比較。在TS自流C02夾套式溫箱(TSAutoflowC02JacketedIncubator)(FisherScientific,Pittsburgh,PA,USA)中在pH5.0，50°C進行PCS水解。反應以一式三份進行，并在水解過程期間取得等分試樣。通過將每種水解物的20u1等分試樣與180u10.1MNaOH(終止試劑)混合來終止PCS水解反應。為每種樣品生成適當的系列稀釋物，并使用適于96孔微量板形式的對羥基苯甲酸酰胼(para-hydroxybenzoicacidhydrazide)(PHBAH,Sigma,St.Louis,M0,USA)測定法測定了還原糖含量。將適當稀釋的樣品的100yl等分試樣置于96孔錐底微量板中。通過向各孔加入50iU2%NaOH中的1.5%(w/v)PHBAH來起始反應。將平板在95°C不加蓋加熱10分鐘，其后向各孔加入50yl蒸餾水。將來自各孔的100u1等分試樣轉移至平底96孔板，并使用SPECTRAMAX.微量板讀數器(MolecularDevices,Sunnyvale,CA,USA)測量410nm的吸光度。使用葡萄糖標準品(0.1-0.0125mg/ml，用0.4%氫氧化鈉稀釋)制作標準曲線以將獲得的A41(lnm值轉換成葡萄糖當量。使用得到的當量計算每個反應的PCS纖維素轉化的百分比。纖維素轉化成還原糖的程度(％轉化率)使用以下方程式計算%轉化率=RS(mg/ml)x100x162/(纖維素(mg/ml)X180)==RS(fflg/ffll)x100/(纖維素(mgM)X1.Ill)在這個方程式中，RS是以葡萄糖當量(mg/ml)測量的溶液中的還原糖濃度，而因子1.111反映了纖維素轉化為葡萄糖的重量增加。結果歸納在表1中。在米曲霉葡糖苷酶的存在下嗜熱毀絲霉CEL6A纖維二糖水解酶與里氏木霉CEL6A纖維二糖水解酶相比對PCS具有相似的或稍高的活性。表1.由嗜熱毀絲霉CEL6A纖維二糖水解酶或里氏木霉CEL6A纖維二糖水解酶加米曲霉葡糖苷酶進行的纖維素轉化使用AKTAFPLC系統(tǒng)通過PHENYLSUPEROSEHR16/10柱(GEHealthcareLifeSciences,Piscataway,NJ,USA)將脫鹽的嗜熱毀絲霉Cel6A進一步純化。樣品的SDS-PAGE顯示其為至少90%純的。下面使用的其它酶也如上使用AKTAFPLC系統(tǒng)進一步純化，其純度高于90%。PCS(反應中40g/L)的水解在96深孔板中進行并如上所述密封，其中總反應體積為1.0ml。在使用人工酶混合物于pH5，50和55°C(TS自流C02夾套式溫箱)進行的PCS水解中測試了嗜熱毀絲霉Cel6A纖維二糖水解酶(與里氏木霉Cel6A纖維二糖水解酶相比)。所述酶混合物由里氏木霉Cel7B內切葡聚糖酶(2mg/g纖維素)、巴西青霉GH3A0-葡糖苷酶(0.3mg/g纖維素)以及或者嗜熱毀絲霉Cel6A纖維二糖水解酶或者里氏木霉Cel6A纖維二糖水解酶(2mg/g纖維素)組成。通過將每種水解物的20u1等分試樣與180u10.1MNaOH(終止試劑)混合來終止PCS水解反應。水解反應分析和計算如上所述進行。纖維素轉化結果歸納在表2中。表2.由里氏木霉Cel7B內切葡聚糖酶(2mg/g纖維素)、巴西青霉GH3A0-葡糖苷酶(0.3mg/g纖維素)以及或者嗜熱毀絲霉Cel6A或者里氏木霉Cel6A纖維二糖水解酶(2mg/g纖維素)在pH5，50和55°C進行的纖維素轉化表1顯示了嗜熱毀絲霉6A纖維二糖水解酶在50和55°C的PCS水解中的表現都超過里氏木霉6A纖維二糖水解酶，并且特別是在55°C。生物材料的保藏依據布達佩斯條約的條款，下述的生物材料已經保藏于農業(yè)研究機構專利培養(yǎng)^UM^^^fe^lkff(AgriculturalResearchServicePatentCultureCollection)，北區(qū)石if究中心(NorthernRegionalResearchCenter),1815UniversityStreet,Peoria,Illinois，61604，并給予下述的登錄號保藏物登錄號保藏日期大腸桿菌pSMail82NRRLB-500592007年9月6日所述菌株已于下述條件下保藏確保在本專利申請未決期間，由外國專利法律決定授權的人能夠獲得所述培養(yǎng)物。所述保藏物為所保藏菌株的基本上純的培養(yǎng)物。在提交了題述申請的副本，或其后續(xù)文本的國家，依據該外國專利法律的要求，可以獲得所述保藏物。然而，應當理解，保藏物的獲得并不構成對實施題述發(fā)明的許可，實施題述發(fā)明是對政府行為所授予的專利權的侵犯。本文描述和要求保護的發(fā)明并不受限于本文所公開的具體方面的范圍，因為這些方面意欲作為本發(fā)明幾個方面的說明。任何等同的方面意欲在本發(fā)明的范圍之內。實際上，從前面的說明中，除本文所顯示和描述的之外，本發(fā)明的多種修改對于本領域的技術人員來說是顯而易見的。這些修改也意欲落入所附的權利要求的范圍內。在沖突的情況下，將以包括定義部分的本公開為準。權利要求具有纖維二糖水解酶活性的分離的多肽，選自下組(a)多肽，其包含與SEQIDNO2的成熟多肽具有優(yōu)選至少80％，更優(yōu)選至少85％，甚至更優(yōu)選至少90％，并且最優(yōu)選至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列；(b)由如下多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸在優(yōu)選至少高嚴緊條件下與以下雜交(i)SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列，(ii)包含SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全長互補鏈；(c)由如下多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸包含與SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列具有優(yōu)選至少80％，更優(yōu)選至少85％，甚至更優(yōu)選至少90％，并且最優(yōu)選至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％同一性的核苷酸序列；和(d)變體，其包含取代、缺失和/或插入一個或多個(幾個)氨基酸的SEQIDNO2的成熟多肽。2.權利要求1的多肽，其包含或其組成為SEQIDNO2的氨基酸序列；或其具有纖維二糖水解酶活性的片段。3.權利要求1的多肽，其由如下多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含或其組成為SEQIDNO1的核苷酸序列；或其編碼具有纖維二糖水解酶活性的片段的亞序列。4.權利要求1的多肽，其由大腸桿菌NRRLB-50059中所含質粒pSMail82中含有的多核苷酸編碼。5.分離的多核苷酸，其包含編碼權利要求1-4中任一項的多肽的核苷酸序列。6.核酸構建體，其包含權利要求5的多核苷酸，該多核苷酸與指導所述多肽在表達宿主中產生的一種或多種調控序列可操作地連接。7.重組宿主細胞，其包含權利要求6的核酸構建體。8.產生權利要求1-4中任一項的多肽的方法，包括(a)在用于產生所述多肽的條件下培養(yǎng)細胞，所述細胞以其野生型形式產生所述多肽；和(b)回收所述多肽。9.產生權利要求1-4中任一項的多肽的方法，包括(a)在有益于產生所述多肽的條件下培養(yǎng)包含核酸構建體的宿主細胞，所述核酸構建體包含編碼多肽的核苷酸序列；和(b)回收所述多肽。10.產生親本細胞的突變體的方法，包括破壞或缺失編碼權利要求1-4中任一項的多肽的核苷酸序列，這導致所述突變體產生的所述多肽少于親本細胞。11.產生權利要求1-4中任一項的多肽的方法，包括(a)在有益于產生所述多肽的條件下培養(yǎng)轉基因植物或植物細胞，所述轉基因植物或植物細胞包含編碼所述多肽的多核苷酸；和(b)回收所述多肽。12.用編碼權利要求1-4中任一項的多肽的多核苷酸轉化的轉基因植物、植物部分或植物細胞。13.雙鏈抑制性RNA(dsRNA)分子，其包含權利要求5的多核苷酸的亞序列，其中任選地所述dsRNA是siRNA或miRNA分子。14.抑制細胞中多肽表達的方法，包括向所述細胞施用或在所述細胞中表達權利要求13的雙鏈RNA(dsRNA)分子。15.核酸構建體，其包含編碼蛋白質的基因，該基因與編碼信號肽的核苷酸序列可操作地連接，所述信號肽包含SEQIDNO2的氨基酸1-16或由SEQIDNO2的氨基酸1_16組成，其中所述基因對于所述核苷酸序列是外源的。16.重組宿主細胞，其包含權利要求15的核酸構建體。17.產生蛋白質的方法，包括(a)在有益于產生所述蛋白質的條件下培養(yǎng)權利要求16的重組宿主細胞；和(b)回收所述蛋白質。18.用于降解或轉化纖維素材料的方法，包括在有效量的權利要求1-4中任一項的具有纖維二糖水解酶活性的多肽存在下，用有效量的包含一種或多種纖維素分解蛋白的組合物處理所述纖維素材料，其中所述具有纖維二糖水解酶活性的多肽的存在使纖維素材料的降解與不存在所述具有纖維二糖水解酶活性的多肽時相比增加。19.權利要求18的方法，還包括回收降解的纖維素材料。20.用于產生物質的方法，包括(a)在有效量的權利要求1-4中任一項的具有纖維二糖水解酶活性的多肽存在下，用有效量的包含一種或多種纖維素分解蛋白的組合物糖化纖維素材料，其中所述具有纖維二糖水解酶活性的多肽的存在使纖維素材料的降解與不存在所述具有纖維二糖水解酶活性的多肽時相比增加；(b)用一種或多種發(fā)酵微生物發(fā)酵步驟(a)的糖化的纖維素材料；和(c)從所述發(fā)酵回收物質。21.洗滌劑組合物，包含表面活性劑和權利要求1-4中任一項的具有纖維二糖水解酶活性的多肽。全文摘要本發(fā)明涉及具有纖維二糖水解酶活性的分離的多肽和編碼所述多肽的分離的多核苷酸。本發(fā)明還涉及包含所述多核苷酸的核酸構建體、載體和宿主細胞以及產生和使用所述多肽的方法。文檔編號C12N5/10GK101874109SQ200880117634公開日2010年10月27日申請日期2008年9月26日優(yōu)先權日2007年9月28日發(fā)明者丁晗澍,保羅·哈里斯,蘇欽德拉·梅尤蘭,金伯利·布朗申請人:諾維信公司