一種偏中性耐鹽性內(nèi)切葡聚糖酶GluE1及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種偏中性耐鹽性內(nèi)切葡聚糖酶GluEl 及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 纖維素是地球上最豐富的可再生資源，而來源于低成本的可再生纖維素資源的生 物制品和生物能源對(duì)于人類的可持續(xù)發(fā)展是很重要的。如果能充分的利用纖維素資源，將 對(duì)緩解全球的能源危機(jī)，食品和飼料資源緊張以及環(huán)境污染有重大意義。
[0003] 纖維素酶系廣泛存在于多種微生物中，由三種酶組成：內(nèi)切-l，4-0-D-葡 聚糖酶（end〇-l，4-0-D_glucanases，EC3.2.1.4，EG) ;1，4-0_D-纖維二糖水解 酶（l，4-0-D-cellobiohydrolases，EC3.2.1.91，CBH) ;1，4-0_D-葡萄糖昔酶 (l，4-0-D-glucosidases，EC3. 2. 1. 21，BGL)。纖維素通過這三種酶的協(xié)同作用，最終 降解為葡萄糖（OKSANENT,PEREJ,PAAVILAINENL,etal.Journalofbiotechnolo gy，2000,78(l) :39-48.)。其中內(nèi)切-l，4-0-D-葡聚糖酶是纖維素酶系最主要的成分， 它首先作用纖維素，隨機(jī)水解纖維素分子內(nèi)部的0-1，4_糖苷鍵，將纖維素鏈打斷，它對(duì) 整個(gè)纖維素的降解起到至關(guān)重要的作用。近年來，內(nèi)切葡聚糖酶的應(yīng)用已經(jīng)越來越廣 泛，如紡織，生物質(zhì)能，造紙和食品工業(yè)等（BE⑶INP，AUBERTJ-P.FEMS，microbiology reviews, 1994, 13(1) :25-58.)。目前，許多研究都集中在強(qiáng)耐熱性的纖維素酶上，原因在 于其在各種工業(yè)過程中潛在的應(yīng)用，如對(duì)木質(zhì)纖維性生物轉(zhuǎn)化成發(fā)酵性的產(chǎn)品，改善動(dòng) 物飼料的消化率和果汁的澄清，并減少在造紙工業(yè)所需的氯等（BHATM.Biotechnology advances, 2000, 18(5) : 355-383.)。
[0004] 現(xiàn)如今對(duì)纖維素酶研究的范圍越來越廣泛，但是，一直以來纖維素酶的降解速率 和高生產(chǎn)成本成了充分利用纖維素資源的限制因素；現(xiàn)如今所研究的纖維素酶難以滿足食 品、化工等工業(yè)快速發(fā)展，以及環(huán)境可持續(xù)、健康發(fā)展的需求，偏中性耐鹽性較強(qiáng)的內(nèi)切葡 聚糖酶目前研究的還很少，因此，開發(fā)有此種特性的內(nèi)切葡聚糖酶并將其應(yīng)用于工業(yè)領(lǐng)域， 將有很好的前景和價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種偏中性耐鹽性內(nèi)切葡聚糖酶GluEl及其制備方法，旨 在解決將纖維素酶更廣泛，更高效的應(yīng)用于各種工業(yè)領(lǐng)域。
[0006] 本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種偏中性耐鹽性內(nèi)切葡聚糖酶GluEl，該偏中性耐鹽性內(nèi) 切葡聚糖酶GluEl得自脂環(huán)酸芽孢桿菌D-1 ;
[0007] 內(nèi)切葡聚糖酶GluEl總共含339個(gè)氨基酸，理論分子量為40. 45kDa，GluEl不含 信號(hào)肽。GluEl可水解CMC-Na、可溶性淀粉、大麥葡聚糖、昆布多糖、燕麥木聚糖和微晶 纖維素，表觀最適pH為6. 5,在pH5.0-pH10.0的范圍內(nèi)穩(wěn)定并維持60 %以上的酶活性。 GluEl的表觀最適溫度為55°C，在37°C下穩(wěn)定。GluEl受Ag+、Hg2+及SDS抑制，-巰基乙 醇、Pb+、Mg2+、Ca2+和Na+對(duì)GluEl有微弱的促進(jìn)作用；其余金屬離子和有機(jī)試劑對(duì)GluEl的 影響不大。3%-30%的NaCl對(duì)GluEl的影響不大，加入30%的NaCl，仍有64%以上的酶 活性；經(jīng)3% -30%的NaCl在37°C下處理60min，仍能保持93%以上的活性；體現(xiàn)了較強(qiáng)的 耐鹽性，用中性內(nèi)切纖維素酶處理后的棉織物效果好，對(duì)織物損傷小，防沾色效果優(yōu)良；
[0008] GluEl具有良好的pH穩(wěn)定性和大部分的金屬離子抗性，因此，GluEl可作為良好的 出發(fā)材料，通過進(jìn)一步的突變等研究以提高高溫活性等，最終使其在中溫到高溫的生境和 加工過程中具一定的應(yīng)用潛力，纖維素是植物細(xì)胞壁的主要組成部分，利用纖維素酶能有 效的應(yīng)用于植物中有益營養(yǎng)成分的提取，GluEl表現(xiàn)出了較強(qiáng)的耐鹽性，這使得內(nèi)切葡聚糖 酶能應(yīng)用于從鹽含量較高的植物中提取有用物質(zhì)成為可能。
[0009] 進(jìn)一步，該偏中性耐鹽性內(nèi)切葡聚糖酶GluEl對(duì)CMC-Na、可溶性淀粉、大麥 0 _葡聚糖、昆布多糖、燕麥木聚糖和微晶纖維素的比活分別為5. 902±0. 331U/mg， 6. 362±0. 331U/mg，130. 655±0. 694U/mg，6. 117±0. 598U/mg，6. 974±0. 371U/mg和 11.384±1.5811]/1職，表觀最適口11為6.5，在口115.〇11110.0的范圍內(nèi)穩(wěn)定并維持60%以 上的酶活性。
[0010] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種一種偏中性耐鹽性內(nèi)切葡聚糖酶GluEl的制備 方法，該偏中性耐鹽性內(nèi)切葡聚糖酶GluEl的制備方法包括以下步驟：
[0011] 步驟一，用重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，宿主細(xì)胞為大腸桿菌細(xì)胞，將重組大腸桿菌表 達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞BL21，進(jìn)行陽性克隆子驗(yàn)證并送測(cè)序，得到重組菌株BL21 (DE3) / gluEl；
[0012] 步驟二，培養(yǎng)重組菌株，誘導(dǎo)內(nèi)切葡聚糖酶基因gluEl表達(dá)；取重組大腸桿菌菌株 BL21 (DE3)/gluEl，以0? 1%的接種量接種于LB(含lOOmg/mLAmp)培養(yǎng)液中，37°C快速振蕩 16h。然后將此活化的菌液以1%接種量接種到新鮮的LB(含100mg/mLAmp)培養(yǎng)液中，快 速振蕩培養(yǎng)約2 - 3h(0D6。。達(dá)到0. 6 - 1. 0)后，加入終濃度0. 7mmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，于 20°C繼續(xù)振蕩培養(yǎng)約20h。9500g離心5min，收集菌體；
[0013] 步驟三，回收并純化所表達(dá)的內(nèi)切葡聚糖酶GluEl。（用適量的pH7.OMcIlvaine buffer懸浮菌體后，于低溫水浴下超聲波破碎菌體。以上胞內(nèi)濃縮的初酶液經(jīng)12000r離 心10min，吸取上清并用Nickel-NTA樹脂純化目的蛋白。純化的蛋白進(jìn)行12%的SDS-聚 丙稀酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE)分析和Bradford法蛋白定量。）
[0014] 進(jìn)一步，內(nèi)切葡聚糖酶基因編碼的內(nèi)切葡聚糖酶以大麥葡聚糖為底物：最適 pH6. 5,最適溫度55°C;在pH為6. 0~7. 0的范圍內(nèi)酶活穩(wěn)定。
[0015] 進(jìn)一步，通過PCR的方法分離克隆了內(nèi)切葡聚糖酶GluEl的編碼基因gluEl，全長 1020bp，GC含量50. 5%，編碼339個(gè)氨基酸。
[0016] 進(jìn)一步，將重組載體優(yōu)選為pEASY-E2-gluEl。將本發(fā)明的內(nèi)切葡聚糖酶基因插入 到表達(dá)載體中，使其核苷酸序列與表達(dá)調(diào)控序列相連接。作為本發(fā)明的一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施 方案，將本發(fā)明的內(nèi)切葡聚糖酶基因和表達(dá)載體PEASY-E2通過T-A方式相連接，得到重組 大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒。
[0017] 本發(fā)明還提供了包含上述內(nèi)切葡聚糖酶基因gluEl的重組菌株，優(yōu)選所述菌株為 大腸桿菌、酵母菌、芽孢桿菌或乳酸桿菌，優(yōu)選為重組菌株BL21(DE3)/gluEl。
[0018] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種所述的偏中性耐鹽性內(nèi)切葡聚糖酶GluEl，其最 適pH為6.5;最適溫度為55°C;較強(qiáng)的耐鹽性和金屬離子抗性。本發(fā)明的內(nèi)切葡聚糖酶可 應(yīng)用于飼料、食品、洗滌等行業(yè)。
【附圖說明】
[0019] 圖1是本發(fā)明實(shí)施例提供的偏中性耐鹽性內(nèi)切葡聚糖酶GluEl的制備方法流程 圖；
[0020] 圖2是本發(fā)明實(shí)施例提供的在大腸桿菌中表達(dá)的重組內(nèi)切葡聚糖酶GluEl的 SDS-PAGE分析示意圖；
[0021] 圖中：1、蛋白質(zhì)Marker;2、500mM味唑洗脫親和于Nickel-NTAAgarose中的重組 內(nèi)切葡聚糖酶GluEl;
[0022] 圖3是本發(fā)明實(shí)施例提供的純化的重組內(nèi)切葡聚糖酶GluEl的pH活性示意圖
[0023] 圖4是本發(fā)明實(shí)施例提供的純化的重組內(nèi)切葡聚糖酶GluEl的pH穩(wěn)定性示意圖；
[0024] 圖5是本發(fā)明實(shí)施例提供的純化的重組內(nèi)切葡聚糖酶GluEl的最適溫度示意圖；
[0025] 圖6是本發(fā)明實(shí)施例提供的純化的重組內(nèi)切葡聚糖酶GluEl的熱穩(wěn)定性示意圖；
[0026] 圖7是本發(fā)明實(shí)施例提供的純化的重組內(nèi)切葡聚糖酶GluEl的NaCl抗性示意圖；
[0027] 圖8是本發(fā)明實(shí)施例提供的純化的重組內(nèi)切葡聚糖酶GluEl的NaCl穩(wěn)定性示意 圖；
[0028] 圖9是本發(fā)明實(shí)施例提供的純化的重組內(nèi)切葡聚糖酶GluEl在不同時(shí)間下水解大 麥0 _葡聚糖的產(chǎn)物分析示意圖；
[0029] 圖中：CK為大麥0 -葡聚糖和失活的GluEl(100°C下處理5min)。
【具體實(shí)施方式】
[0030] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明 進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于 限定本發(fā)明。
[0031] 下面結(jié)合附圖及具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的應(yīng)用原理作進(jìn)一步描述。
[0032] 本發(fā)明的目的是提供一種偏中性耐鹽性較強(qiáng)的內(nèi)切葡聚糖酶GluEl。
[0033] 本發(fā)明的再一目的是提供編碼上述內(nèi)切葡聚糖酶的基因。
[0034] 本發(fā)明的另一目的是提供包含上述基因的重組載體。
[0035] 本發(fā)明的另一目的是提供包含上述基因的重組菌株。
[0036] 本發(fā)明從脂環(huán)酸芽抱桿菌0_1(厶1：[05^1(^&(3；[11118七61^(31101^61181806]\0^1504) 的基因組中克隆到內(nèi)切葡聚糖酶基因gluEl，屬于GH5家族的內(nèi)切葡聚糖酶。gluEl與表達(dá) 載體PEASY-E2連接后，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中誘導(dǎo)表達(dá)并對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了初步 研究。
[0037] 本發(fā)明所述內(nèi)切葡聚糖酶GluEl可得自脂環(huán)酸芽孢桿菌D-UAlicyclobacillus sp.)。GluEl的氨基酸序列如SEQIDNO. 1所示。
[0038] 本發(fā)明的內(nèi)切葡聚糖酶GluEl總共含339個(gè)氨基酸，理論分子量為40. 45kDa， GluEl不含信號(hào)肽。該酶對(duì)CMC-Na、可溶性淀粉、大麥葡聚糖、昆布多糖、燕麥木聚糖 和微晶纖維素的比活分別為 5. 902±0. 331U/mg，6. 362±0. 331U/mg，130. 655±0. 694U/mg， 6. 117±0. 598U/mg，6. 974±0. 371U/mg和 11. 384±1