本發(fā)明涉及一種奶牛金黃色葡萄球菌乳房炎的亞單位疫苗組合物及其制備方法和應(yīng)用。屬于獸用疫苗技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

奶牛乳房炎(mastitis)是成年奶牛最普遍的感染性疾病之一，主要是奶牛乳腺組織受到微生物感染后而引起的一種炎癥，多發(fā)生于產(chǎn)后哺乳期，該病廣泛存在于世界各地，為奶牛常見病、多發(fā)病，是造成乳制品業(yè)經(jīng)濟損失最為嚴(yán)重的疾病之一。引起奶牛乳房炎的病原微生物大約有150多種，主要以金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、無乳鏈球菌為主，這三種細(xì)菌引起的奶牛乳房炎占總發(fā)病率的90％以上，其中尤以金黃色葡萄球菌為最。

當(dāng)前奶牛乳房炎的治療主要是抗生素治療。抗生素用于治療奶牛乳房炎已有50多年的歷史，其在奶牛乳房炎的防治中起了一定的作用，但由于長期單一的、大劑量、不科學(xué)使用抗生素，造成了敏感性細(xì)菌消除，耐藥性細(xì)菌逐漸占了主流，尤其是金黃色葡萄球菌的耐藥問題日益嚴(yán)重，導(dǎo)致了抗生素治療收效甚微；另一方面，隨著生活水平的提高，牛奶中抗生素殘留是一個非常嚴(yán)重的健康問題。

用疫苗防治奶牛乳房炎具有很好的前景，首先，疫苗可以預(yù)防奶牛感染病原菌而引起乳房炎；其次，疫苗有助于降低乳腺感染的嚴(yán)重程度，控制亞臨床型乳房炎；第三，使用疫苗防治乳房炎不會存在乳汁中抗生素殘留問題；最后是操作簡便，費用低廉。當(dāng)前，研制成功的疫苗很少，且大都數(shù)為弱毒活菌苗或滅活菌苗，在生產(chǎn)實踐中，對乳房炎的防治有一定作用，然而隨著大規(guī)模集約化養(yǎng)殖的發(fā)展，人工致弱菌株存在著同源重組、自身毒力返強等潛在可能，而滅活疫苗也存在使用劑量大、滅活不徹底等不足，為提高傳統(tǒng)疫苗的安全性與免疫保護力，高效、廉價的新型疫苗研制極為重要。

金黃色葡萄球菌(staphylococcusaureus,簡稱sa)，也稱“金葡菌”，是一種革蘭氏染色陽性的球菌，直徑0.8μm，在顯微鏡下排列成葡萄串狀，并可以產(chǎn)生金黃色的色素，因此而得名。金葡菌是引起慢性/隱性奶牛乳房炎的主要病原菌之一，可以極大的影響牛奶的產(chǎn)量和質(zhì)量，給奶制品產(chǎn)業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失。

α-溶血素(α-hemolysin)，亦稱α-toxin，是由金葡菌分泌的一種外毒素，是其主要毒力因子之一，具有良好的免疫原性。α-溶血素屬于中空形狀的β-桶狀結(jié)構(gòu)細(xì)菌毒素家族，相對分子質(zhì)量為33,200，由297個氨基酸組成，其結(jié)構(gòu)基因為hla。α-溶血素對多種哺乳動物紅細(xì)胞具有溶血作用，其機理為毒素分子插入紅細(xì)胞的細(xì)胞膜疏水區(qū)，形成微孔，破壞了膜的完整性，造成細(xì)胞溶解。將α-溶血素第35位組氨酸突變?yōu)楸彼岷?，突變體就失去了溶血活性，不具有毒性，但仍然保留完好的免疫原性，可直接用來免疫動物，是金葡菌亞單位疫苗的重要候選蛋白之一。

β溶血素(亦稱β-toxin)就是其毒素之一，它具有白細(xì)胞毒性、溶血活性等特性。β溶血素是由330個氨基酸組成的單鏈多肽，分子量為37～39kda，其等電點(pi)高于9。β溶血素是一種鎂依賴神經(jīng)酯酶，具有磷脂酶c(phospholipasec，plc)活性，可以分解甘油磷酸膽堿，β溶血素依靠這種酶活性，水解組成細(xì)胞膜的磷脂雙分子層，從而破壞細(xì)胞膜的完整性，導(dǎo)致細(xì)胞裂解，引起溶血。將β溶血素進行定點突變后，突變體就失去了溶血活性，不具有毒性，但仍然保留完好的免疫原性，可直接用來免疫動物，是金葡菌亞單位疫苗的重要候選蛋白之一。

panton-valentine殺白細(xì)胞素(panton-valentineleukocidin，pvl)是由金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的細(xì)胞外毒素之一，也是其主要的致病因子之一。pvl由vandeleld于1894年首先發(fā)現(xiàn)，并在1932年由pantonandvalentine將其從溶血素中分離出來。pvl由兩種蛋白質(zhì)組成，即pvl-s蛋白和pvl-f蛋白，其分子量分別為34kda和33kda，且f蛋白和s蛋白之間的氨基酸序列同源性有36％。pvl屬于膜鉆孔毒素家族，能誘導(dǎo)pmns壞死或調(diào)亡，首先是pvl-s與pmns細(xì)胞膜上的特異性高親和力的受體結(jié)合，其次pvl-f與之結(jié)合形成二聚體，再依次pvl-s和pvl-f結(jié)臺，最后形成一個環(huán)狀結(jié)構(gòu)的雜聚體。此雜聚體內(nèi)徑為3nm，外徑為9nm，分子量大約200kda，其中所含的pvl-s和pvl-f的分子比為1:1，此環(huán)狀結(jié)構(gòu)的雜聚體插入在pmns細(xì)胞膜上，形成一個直徑大約2nm的膜穿孔，其他的pvl分子通過該孔進入細(xì)胞，并在線粒體外膜上建立孔道，從而破壞線粒體的內(nèi)環(huán)境，并激活caspase9、caspase3和釋放殺白細(xì)胞素c，誘導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡。因此，pvl是金葡菌亞單位疫苗的重要候選蛋白之一，但是當(dāng)pvl-s和pvl-f都存在時，可能會造成細(xì)胞毒性，本實驗室對其做了小鼠安全性實驗，結(jié)果與預(yù)期相同，在免疫同時含有pvl-s蛋白和pvl-f蛋白的疫苗時，小鼠在免疫后3-4天就死亡，但是僅免疫相同劑量的pvl-s蛋白或pvl-f蛋白，在免疫后跟蹤的14天內(nèi)，小鼠都正常，未出現(xiàn)任何異常，所以，在亞單位疫苗的選擇時，僅能選擇其中一種蛋白作為亞單位疫苗的候選蛋白。

本實驗室從全國各地分離了40多種金黃色葡萄球菌，并對其外毒素進行了分析研究，一是發(fā)現(xiàn)同種金黃色葡萄球菌株不僅僅分泌一種外毒素，可能分泌2種、3種甚至更多種的外毒素；二是發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)分離得到的金黃色葡萄球菌分泌的外毒素水平都不是完全一樣，有的分泌的主要是α-溶血素，有的分泌的主要是β溶血素。因此，使用單一一種外毒素蛋白作為亞單位疫苗不僅可能在保護奶牛免受金黃色葡萄球菌的感染時效果不甚理想，也不能提供廣譜的免疫保護效果。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題：一是提供一種由金黃色葡萄球菌造成的奶牛乳房炎的亞單位疫苗組合物及其制備方法；二是克服單一外毒素的亞單位疫苗在保護奶牛免受金黃色葡萄球菌感染方面廣譜性差的問題；三是克服現(xiàn)有弱毒苗和滅活苗可能存在的同源重組、自身毒力返強等潛在風(fēng)險。

本發(fā)明提供了一種奶牛金黃色葡萄球菌乳房炎亞單位疫苗組合物，該組合物包含α-溶血素蛋白、β-溶血素蛋白、pvl-s蛋白以及藥學(xué)上可接受的佐劑，或α-溶血素蛋白、β-溶血素蛋白、pvl-f蛋白以及藥學(xué)上可接受的佐劑。

本發(fā)明的技術(shù)方案中，優(yōu)選地，所述pvl-s蛋白的編碼基因如seqidno.1所示。

本發(fā)明的技術(shù)方案中，優(yōu)選地，所述pvl-f蛋白的編碼基因如seqidno.2所示。

本發(fā)明的技術(shù)方案中，優(yōu)選地，所述α-溶血素蛋白是經(jīng)過處理的喪失溶血活性但保留免疫原性的蛋白，所述處理方法有蛋白滅活和基因突變處理。優(yōu)選地，所述α-溶血素蛋白是經(jīng)過基因突變處理的喪失溶血活性但保留免疫原性的蛋白。

本發(fā)明的技術(shù)方案中，優(yōu)選地，所述β-溶血素蛋白是經(jīng)過處理的喪失溶血活性但保留免疫原性的蛋白，所述處理方法有蛋白滅活和基因突變處理。優(yōu)選地，所述β-溶血素蛋白是經(jīng)過突變處理的喪失溶血活性但保留免疫原性的蛋白。

本發(fā)明的技術(shù)方案中，優(yōu)選地，所述α-溶血素蛋白、β-溶血素蛋白、pvl-s蛋白按照等質(zhì)量比混合。

本發(fā)明的技術(shù)方案中，優(yōu)選地，所述α-溶血素蛋白、β-溶血素蛋白、pvl-f蛋白按照等質(zhì)量比混合。

本發(fā)明的技術(shù)方案中，優(yōu)選地，所述α-溶血素蛋白、β-溶血素蛋白、pvl-s蛋白均為100μg/頭份。

本發(fā)明的技術(shù)方案中，優(yōu)選地，所述α-溶血素蛋白、β-溶血素蛋白、pvl-f蛋白均為100μg/頭份。

本發(fā)明的技術(shù)方案中，優(yōu)選地，所述藥學(xué)上可接受的佐劑可以為水性佐劑(如鋁膠佐劑等)，也可以為水包油佐劑(如白油等)，也可以為水包油包水佐劑(如isa206v等)，優(yōu)選地，所述藥學(xué)上可接受的佐劑為isa201vg佐劑。

本發(fā)明的技術(shù)方案中，優(yōu)選地，所述組合物還含有防腐劑。

本發(fā)明的技術(shù)方案中，優(yōu)選地，所述的防腐劑為硫柳汞，所述硫柳汞的含量為2μg/頭份。

本發(fā)明還提供了一種制備該亞單位疫苗組合物的方法，所述方法包括以下步驟：1)分別制備α-溶血素蛋白、β-溶血素蛋白、pvl-f蛋白、pvl-s蛋白；2)將步驟1)中按照等質(zhì)量比混合制備的α-溶血素蛋白、β-溶血素蛋白、pvl-f蛋白，或按照等質(zhì)量比混合制備的α-溶血素蛋白、β-溶血素蛋白、pvl-s蛋白制備成組合物抗原液；3)根據(jù)步驟2)中制備的組合物抗原液的體積，準(zhǔn)備好硫柳汞，并將準(zhǔn)備好的硫柳汞加入到步驟2)抗原液中制備成水相；4)將所述水相與isa201vg佐劑按照體積比46:55混合乳化。優(yōu)選地，步驟4)中所述乳化的溫度為32-35℃。

本發(fā)明再提供了一種所述組合物在制備用于預(yù)防和治療奶牛金黃色葡萄球菌乳房炎的疫苗中的應(yīng)用。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明第一次明確提供了一種新型的奶牛金黃色葡萄球菌乳房炎亞單位疫苗組合物及其制備方法和應(yīng)用。首先該組合物不含有核酸，不會導(dǎo)致同源重組和自身毒力返強等潛在危險；能誘發(fā)機體產(chǎn)生特異性抗體，可促進細(xì)胞免疫，誘導(dǎo)免疫記憶和引起廣泛的免疫應(yīng)答，產(chǎn)生很好的交叉保護反應(yīng)，因此該疫苗更加安全穩(wěn)定、制備簡單、應(yīng)用方便、價格低廉，且省時省力。其次，該組合物由于含有多種金黃色葡萄球菌毒素，因此能夠?qū)Σ煌貐^(qū)分泌不同外毒素的金黃色葡萄球菌都有很好的中和作用，達到保護奶牛免受分泌不同外毒素的金黃色葡萄球菌的感染；最后，該組合物比單一外毒素制備的亞單位疫苗在保護奶牛免受金黃色葡萄球菌感染方面的能力更強。

附圖說明

圖1表示瓊脂糖凝膠電泳pcr擴增pvl-f，pvl-s結(jié)果。pvl-f基因pcr結(jié)果，大小約為906bp；pvl-s基因基因pcr結(jié)果，大小約為849bp；m：dna分子量標(biāo)準(zhǔn)dl2,000。

圖2表示pet28a-pvl-f，pvl-s酶切驗證結(jié)果。pet28a-pvl-f：質(zhì)粒pet28a-pvl-fxhoi和ndei酶切鑒定結(jié)果，酶切片段大小為5,369bp和904bp；pet28a-pvl-s：質(zhì)粒pet28a-pvl-fxhoi和ndei酶切鑒定結(jié)果，酶切片段大小為5,369bp和849bp；m：dna分子量標(biāo)準(zhǔn)dl5,000。

圖3表示pvl-f蛋白和pvl-s蛋白純化結(jié)果。

圖4a表示免疫后組合物中α-溶血素的效價檢測結(jié)果；

圖4b表示免疫后組合物中β-溶血素的效價檢測結(jié)果；

圖4c表示免疫后組合物中pvl-f的效價檢測結(jié)果；

圖4d表示免疫后組合物中pvl-s的效價檢測結(jié)果。

圖5免疫后攻毒實驗結(jié)果。

具體實施方式

以下將結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明做進一步說明，本發(fā)明的實施例僅用于說明本發(fā)明的技術(shù)方案，并非限定本發(fā)明。

本發(fā)明試劑及藥品的來源列單如下：

化學(xué)試劑和生物試劑全部為市售產(chǎn)品；

防腐劑硫柳汞購自lifesciences；

isa201vg購自法國賽比克公司。

實施例1：α-溶血素蛋白、β-溶血素蛋白、pvl-s蛋白、pvl-f蛋白制備

1.1：α-溶血素蛋白制備

參照本申請人提交的專利號為201610068723.4的發(fā)明專利制備突變的α-溶血素蛋白。

1.2：β-溶血素蛋白制備

參照本申請人提交的專利號為201610068816.7的發(fā)明專利制備突變的β-溶血素蛋白。

1.3：pvl-s蛋白、pvl-f蛋白制備

1.3.1表達載體pet28a-pvl-s和pet28a-pvl-f的構(gòu)建(兩種載體構(gòu)建方法相同)

以臨床分離到的奶牛金黃色葡萄球菌基因組為模板，進行pcr，引物如下表所示，結(jié)果如圖1所示：pvl-f基因pcr結(jié)果，大小約為906bp；pvl-s基因基因pcr結(jié)果，大小約為849bp；都與預(yù)期大小一致。

1.3.1.1加樣體系為(50μl):

1.3.1.2pcr擴增程序:

1.3.1.3膠回收dna片段:

(1)將步驟1.3.1.2的反應(yīng)液進行0.8％瓊脂糖凝膠電泳(110v30min)；

(2)在紫外燈下，切膠回收dna片段于1.5mlep管中；

(3)向步驟(2)中的1.5mlep管中加入500μlpcbuffer，50℃，水浴10min；

(4)將步驟(3)中溶液移至吸附柱中心，靜置2min，離心，12,000rpm，30s；

(5)棄廢液，向吸附柱中心加入600μlpwbuffer，靜置3min，12,000rpm，30s；

(6)重復(fù)步驟(5)；

(7)空吸附柱離心，12,000rpm，1min；

(8)向吸附柱中心加入30μlddh2o，靜置3min，離心(12,000rpm，2min)；

(9)收集步驟(8)dna樣品進行電泳。

1.3.1.4雙酶切反應(yīng)(50μl體系)：

在1.5mlep管中按照上述體系進行加樣、混勻，而后將這兩個50μl反應(yīng)液置于37℃恒溫水浴鍋中，水浴3h。

1.3.1.5膠回收dna片段：

(1)將步驟1.3.1.4的反應(yīng)液進行0.8％瓊脂糖凝膠電泳(110v30min)；

(2)在紫外燈下，切膠回收dna片段于1.5mlep管中；

(3)向步驟(2)中的1.5mlep管中加入500μlpcbuffer，50℃，水浴10min；

(4)將步驟(3)中溶液移至吸附柱中心，靜置2min，離心，12,000rpm，30s；

(5)棄廢液，向吸附柱中心加入600μlpwbuffer，靜置3min，12,000rpm，30s；

(6)重復(fù)步驟(5)；

(7)空吸附柱離心，12,000rpm，1min；

(8)向吸附柱中心加入30μlddh2o，靜置3min，離心(12,000rpm，2min)；

(9)收集步驟(8)dna樣品進行電泳。

1.3.1.6連接反應(yīng)(10μl體系)：

在1.5mlep管中按照上述體系進行加樣、混勻，而后將上述反應(yīng)液置于16℃，水浴16h后取出，65℃，水浴15min后進行滅活，將樣品4℃保存。

1.3.1.7轉(zhuǎn)化實驗：

(1)取出步驟1.3.1.6的連接反應(yīng)液，向其中添加100μle.colidh5α感受態(tài)細(xì)胞，混勻；

(2)冰浴30min；

(3)42℃，水浴100s；

(4)冰浴2min；

(5)取出，向ep管中加入600μl液體lb培養(yǎng)基，37℃，水浴1h；

(6)取出樣品管，離心(8,000rpm，2min)，去掉600μl，剩余100μllb重懸菌體；

(7)取菌液鋪板于lk平板中(kan濃度為50μg/ml)，將lk平板置于生化恒溫培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)12h。

1.3.1.8重組質(zhì)粒提取及酶切鑒定：

(1)從轉(zhuǎn)化平板中挑取單克隆至3mllk液體培養(yǎng)基中，37℃，260rpm搖菌過夜；

(2)取1ml菌液至1.5mlep管中，離心(12,000rpm，2min)，棄上清；

(3)向步驟(2)中的ep管中加入250μlp1buffer，重懸菌體；

(4)向步驟(3)溶液中加入250μlp2buffer，溫和混勻，靜置2min；

(5)向步驟(4)溶液中加入350μlp3buffer，溫和混勻；

(6)將步驟(5)溶液，離心(12,000rpm，10min)；

(7)將步驟(6)中的上清溶液移至吸附柱中心，離心(8,000g，30s)；

(8)棄廢液，向吸附柱中心加入500μlwashbuffer，離心(9,000g，30s)；

(9)重復(fù)步驟(8)；

(10)空吸附柱離心(9,000g，1min)；

(11)向吸附柱加入30μlelutionbuffer，靜置2min，離心(12,000rpm，2min)；

(12)收集步驟(11)dna樣品進行電泳；

(13)如步驟1.3.1.4所示，對提取到的質(zhì)粒進行酶切鑒定，而后進行0.8％瓊脂糖凝膠電泳。

(14)重組質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果如圖2所示：pet28a-pvl-f：質(zhì)粒pet28a-pvl-fxhoi和ndei酶切鑒定結(jié)果，酶切片段大小為5,369bp和904bp；pet28a-pvl-s：質(zhì)粒pet28a-pvl-fxhoi和ndei酶切鑒定結(jié)果，酶切片段大小為5,369bp和849bp。

1.3.2轉(zhuǎn)化大腸桿菌bl21

吸取1μl質(zhì)粒加入100μlbl21感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴30min；

42℃熱激90s；

冰浴2min；

在超凈臺內(nèi)加入900μl無抗性的lb培養(yǎng)液；

37℃180rpm搖1h；

吸取100μl菌液涂卡那抗性lb平板，37℃過夜培養(yǎng)。

1.3.3大量誘導(dǎo)表達

挑菌：挑取單克隆至50ml卡那抗性lb培養(yǎng)液中，37℃過夜培養(yǎng)；

轉(zhuǎn)接：按1:100比例轉(zhuǎn)接菌液至500ml卡那抗性lb培養(yǎng)液，共搖3.5l，37℃220rpm培養(yǎng)2-2.5h至od600值到0.6；

誘導(dǎo)：菌液od600值到0.6后，加入500μliptg(1m)至iptg終濃度為1mmol/l,37℃220rpm誘導(dǎo)培養(yǎng)4h；

菌體收集：菌液6,000rpm離心10min，收集菌體；用40mlpbs清洗菌體，6,000rpm離心10min，收集菌體，置于-20℃保存；

1.3.4pvl-s蛋白或pvl-f蛋白純化(兩種蛋白純化過程相同)

(1)菌體破碎：向1.3.3中的得到的菌體中加入裂解液(8ml/g濕重)(50mmnah2po4(ph8.0)，500mmnacl，20mm咪唑；使用0.8μm的濾膜過濾)，用50ml注射器吹打均勻至無顆粒狀菌塊；將菌體樣品倒入到細(xì)胞均質(zhì)儀樣品槽中，出樣口用燒杯準(zhǔn)備收集樣品；以樣品的90％流出出樣口為一個循環(huán)，一個循環(huán)完成后，將出樣口燒杯收集的樣品倒回樣品槽，繼續(xù)重復(fù)5個循環(huán)。

(2)將步驟(1)中破碎完全的樣品分裝到250mlbeckman離心管中，12,000rpm，4℃離心30min，上清樣品過0.8μm膜后作為上樣樣品，預(yù)留80μl樣品用于sds-page檢測；

(3)柱平衡：用超純水平衡2～3柱體積(cv)，排出20％的乙醇保存液；然后用裂解液平衡2～3柱體積(cv)，5ml/min。控制壓力小于0.5mpa。

(4)上樣：2ml/min進行上樣，收集流穿液(flowthrough)，取80μl用于sds-page檢測。

(5)沖洗1：用清洗緩沖液組分1(washingbuffer1：50mmnah2po4(ph7.4)，500mmnacl，20mm咪唑，0.1％tritonx-114，使用0.8μm的濾膜過濾)洗柱，5ml/min，沖洗80個柱體積。

(6)沖洗2：用10倍柱體積(cv)的洗脫緩沖液組分1(elutionbuffer1：50mmnah2po4(ph7.4)，500mmnacl，使用0.8μm的濾膜過濾)洗柱，減少tritonx-114的殘留。

(7)洗脫：50％洗脫緩沖液組分2(50％elutionbuffer2：50mmnah2po4(ph7.4)，500mmnacl，250mm咪唑，使用0.8μm的濾膜過濾)洗脫目的蛋白，至基線洗平，速度5ml/min,收集，混合后取80μl用于sds-page分析；100％脫緩沖液2組分清洗柱子(100％elutionbuffer2：50mmnah2po4(ph7.4)，500mmnacl，500mm咪唑，使用0.8μm的濾膜過濾)，至基線洗平，5ml/min,收集，混合后取80μl用于sds-page分析。

(8)hiprepdesalting脫鹽柱柱平衡：用超純水平衡2～3柱體積(cv)，排出20％的乙醇保存液；然后用洗脫緩沖液組分1平衡3-4柱體積(cv)，速度10ml/min。

(9)上樣：速度10ml/min進行注入(inject)，最大注入(inject)量為13ml。

(10)收集：停止上樣后，進入load模式，10ml/min，uv上升至1mau開始收集，即蛋白樣品開始出峰，10ml/管收集，待uv降至5mau以下，停止收集。

(11)平衡：流速10ml/min，平衡2-3cv。

(12)循環(huán)7.10～7.12，直至上樣完成。

(13)除菌過濾：收集的蛋白溶液在4℃，12,000rpm離心15min，收集上清，移至生物安全柜，過0.2μm蛋白結(jié)合率低的針頭濾器，過濾后置于-80℃冰箱保存。

(14)純化結(jié)果如圖3所示：純化后的pvl-s蛋白和pvl-f蛋白的純度均能達到90％以上。

實施例2：組合物制備(以制備1ml/頭份為例說明)

所用制備疫苗的耗材和材料都需預(yù)先經(jīng)過無菌處理，制備過程是在生物安全柜或其他可以保證整個制備過程都無菌的儀器或環(huán)境中完成。

(1)按照實驗需要，計算組合物溶液各成分的量，使組合物中α-溶血素蛋白、β-溶血素蛋白、pvl-s蛋白或α-溶血素蛋白、β-溶血素蛋白、pvl-f蛋白終濃度均為100μg/ml，使組合物中硫柳汞的終濃度為2μg/ml，再將稱量好的重組蛋白與稱量好的硫柳汞混合作為水相，根據(jù)水相與佐劑isa201vg體積比為46:55，量取佐劑；

(2)將量好的水相和佐劑放置在恒溫水浴鍋內(nèi)加熱至33℃±1℃，待溫度穩(wěn)定后將抗原加入到佐劑管中，震蕩器震蕩10min進行預(yù)乳化；

(3)將預(yù)乳化完的疫苗放置于盛滿冰的燒杯中，固定在預(yù)先處理好的超聲波細(xì)胞破碎儀上進行乳化；

(4)乳化結(jié)束后，觀察乳化效果：取部分疫苗置于離心管中，3,000rpm離心15min，疫苗不分層為合格；

(5)檢測合格的疫苗分裝到15ml離心管中，標(biāo)記，封口膜封口，置于4℃保存。

實施例3：小鼠免疫攻毒實驗

3.1：按照實施例2的方法制備如下疫苗及組合物

3.2：免疫實驗

購買80只20g左右的balb/c雌性小鼠，將其分為8組，每組10只，其中一組作為對照組免疫pbs，另外7組作為免疫組，分別免疫3.1中制備的7種組合物；免疫時用1ml注射器吸取1ml疫苗，然后用75％酒精棉球給小鼠后腿肌肉消毒，在肌肉塊中部進針，左右后腿各注射50μl疫苗，共注射100μl疫苗。

在一免后14天進行二免，二免后7天進行三免，并在一免前、二免前、三免前及三免后14天采集血清，檢測抗體效價。

效價檢測結(jié)果如圖4a、圖4b、圖4c、圖4d所示，其中含有α-溶血素的組合物(組合物1、組合物5、組合物6、組合物7)中的α-溶血素的相對效價在攻毒前均能達到544,000以上，但是組合物6的相對效價在4個組合物中最低，為544,000，其他3個組合物的相對效價達到928,000以上，這也與攻毒結(jié)果一致(組合物7的存活率比組合物6的存活率高10％)；含有β-溶血素的組合物(組合物2、組合物5、組合物6、組合物7)中的β-溶血素的相對效價在攻毒前均能達到77,778以上；含有pvl-f的組合物(組合物3、組合物6、組合物7)中的pvl-f的相對效價在攻毒前均能達到80,000以上；含有pvl-s的組合物(組合物4、組合物6、組合物7)中的pvl-s的相對效價在攻毒前均能達到80,000以上。

3:3：攻毒實驗(三免后14天進行攻毒)

(1)挑取sa單菌落(菌株為本實驗室保存的cq339菌株)于5ml液體肉湯培養(yǎng)基中中，220rpm、37℃搖菌過夜；

(2)按百分之一的體積(1ml)將搖過夜的細(xì)菌接種于100ml新鮮液體肉湯培養(yǎng)基中，220rpm、37℃搖菌過夜；

(3)將100ml菌液裝入到500ml離心瓶中，8,000rpm離心10min，吸去培養(yǎng)基，菌體用100mlpbs重懸，重復(fù)上述步驟3次，最后將所有的菌體用5mlpbs重懸混勻；

(4)將菌液做10,000倍稀釋后計數(shù)。根據(jù)菌液的濃度，將原菌液稀釋到1.5×10⁸cfu/ml(2mld50)；

(5)用1ml注射器吸取菌液，按照各濃度細(xì)菌對應(yīng)的小鼠進行尾靜脈注射，注射量為200μl/20g小鼠。

(6)連續(xù)觀察小鼠的生存狀況，記錄每一只小鼠的死亡時間：早中晚各檢查一次。

(7)攻毒后小鼠存活率結(jié)果如圖2所示，攻毒后500h內(nèi)對照組小鼠全部死亡；在跟蹤的987.5h之內(nèi)，7組免疫組存活率都高于50％，其中，組合物1-組合物4的存活率均在50％-60％，組合物5的存活率比組合物1-組合物4的高20％-30％，達到70％，組合物6的存活率達到80％，組合物7的存活率達到90％，都遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于組合物1-組合物4的存活率，也比組合物5的存活率要高，組合物7的存活率比組合物6的存活率高10％，這與組合物中α-溶血素效價檢測結(jié)果相一致(組合物7中的α-溶血素效價比組合物6中的α-溶血素的效價高一個稀釋比)；這說明單一組分的外毒素制備疫苗的免疫保護效果遠(yuǎn)不如多種外毒素制備疫苗的免疫保護效果。

實施例4：elisa抗體效價檢測

(1)包被：用包被液(50mm碳酸鹽緩沖液，ph9.5)稀釋純化的檢測用蛋白(α-溶血素蛋白、β-溶血素蛋白、pvl-s蛋白或pvl-f蛋白)至0.5μg/ml，在酶標(biāo)板上每孔加入100μl，封口膜封好后4℃冰箱放置過夜；

(2)洗滌：從冰箱取出酶標(biāo)板后，放入洗板機中洗滌，洗滌液用pbst；

(3)封閉：每孔加入200μl封閉液(5％脫脂奶)，封口膜封好后37℃孵育2h；

(4)樣品準(zhǔn)備：按已知的信息和需要用量，用封閉液將血清進行適度稀釋；

(5)洗滌：同(2)；

(6)加樣：加入稀釋血清，同時用封閉液做陰性對照，37℃孵育1h；

(7)洗滌：同(2)；

(8)加二抗：每孔加入適度稀釋的hrp標(biāo)記的二抗100μl，37℃孵育0.5h；

(9)洗滌：同(2)；

(10)顯色：避光條件下每孔加入100μl的tmb顯色液，37℃孵育10min；

(11)終止：每孔加入50μl終止液(2m的h2so4)，終止反應(yīng)；

(12)檢測：于450nm波長測定樣品od值，分析數(shù)據(jù)；

(13)結(jié)果分析：判斷抗體陽性的標(biāo)準(zhǔn)：p/n≥2.1，od450≥0.1。

本發(fā)明通過上面的實施例進行舉例說明，但是，應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明并不限于這里所描述的特殊實例和實施方案。在這里包含這些特殊實例和實施方案的目的在于幫助本領(lǐng)域中的技術(shù)人員實踐本發(fā)明。任何本領(lǐng)域中的技術(shù)人員很容易在不脫離本發(fā)明精神和范圍的情況下進行進一步的改進和完善，因此本發(fā)明只受到本發(fā)明權(quán)利要求的內(nèi)容和范圍的限制，其意圖涵蓋所有包括在由附錄權(quán)利要求所限定的本發(fā)明精神和范圍內(nèi)的備選方案和等同方案。

序列表

<110>浙江海隆生物科技有限公司

<120>奶牛金黃色葡萄球菌乳房炎亞單位疫苗及其制備方法和應(yīng)用

<160>4

<170>patentinversion3.3

<210>4

<211>879

<212>dna

<213>重組金黃色葡萄球菌pvl-s蛋白編碼基因序列

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