專利名稱：采用花生粕同步酶解發(fā)酵生產(chǎn)高濃度d-乳酸的方法及其專用培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種采用花生粕同步酶解發(fā)酵生產(chǎn)高 濃度D-乳酸的方法及其專用培養(yǎng)基。
背景技術(shù)：
乳酸(lacticacid)，學(xué)名為 α-羥基丙酸(d-hydroxy-propionic acid)，乳酸的 化學(xué)分子式子為C2H5OCOOH,是一種簡單的羥基酸。乳酸分子中有一個不對稱的碳原子，因此 乳酸具有旋光性。L-乳酸為左旋性，D-乳酸為右旋性，DL-乳酸為消旋性。近年來，乳酸的 衍生物聚乳酸引起了人們廣泛關(guān)注，其物理性能與聚苯乙烯非常相似，它除了具有以石油 化學(xué)品為原料的塑料材料的優(yōu)異特性外，還有最大的特點是生物可降解性，即在自然界中 可自然降解，不造成環(huán)境污染，解決了為世界環(huán)保所困擾的白色污染問題。但是純聚L-乳 酸(PLLA)的許多性能不穩(wěn)定，而加入適當比例的聚D-乳酸進行聚合，可以提高性能，拓寬 了聚乳酸的應(yīng)用范圍。D-乳酸作為一個手性中心，是合成多種手性物質(zhì)的前體，在低毒農(nóng) 藥、除草劑和化妝品等領(lǐng)域的手性物質(zhì)合成中具有重要的應(yīng)用。丁子建等(丁子建等，生物加工過程，第2卷，第3期，30-36頁，2004)首次報道了 采用芽孢乳桿菌(Sporolactobacillus sp.)從葡萄糖發(fā)酵制備D-乳酸，發(fā)酵72小時可 產(chǎn)40. 7克/升的D-乳酸，葡萄糖轉(zhuǎn)化率67. 8%。中國專利CN200610097453. 6公開了一 種組合發(fā)酵生產(chǎn)D-乳酸的工藝，產(chǎn)酸7. 5% 13. 1%。中國專利CN 200710176056. 2報道 了利用菊糖芽孢乳桿菌(Sporolactobacillusinulinus)半連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)D-乳酸，該發(fā)明 方法獲得的D-乳酸的濃度最高可達162克/升。中國專利CN200810098908. 5報道了芽 孢乳桿菌Sporolactobacillus sp. Y2-8菌株及其發(fā)酵生產(chǎn)D-乳酸的工藝，發(fā)酵液中D-乳 酸含量達9. 16. 5%，D-乳酸光學(xué)純度達99. 1%。中國專利CN200810116194. 6報 道了植物乳桿菌生產(chǎn)D-乳酸，發(fā)酵液中總?cè)樗釢舛葹?8%，D-乳酸光學(xué)純度84 86%。 目前報道的發(fā)酵法生產(chǎn)L-乳酸濃度可達190克/升，光學(xué)純度可達99%以上(中國專利 CN200710176060. 9)。與L-乳酸相比，發(fā)酵法生產(chǎn)D-乳酸的濃度和光學(xué)純度還需要進一步 提尚。由于乳酸發(fā)酵生產(chǎn)通常采用酵母抽提物作為氮源，在一定程度上提高了乳酸的生 產(chǎn)成本。針對這一問題，目前國內(nèi)有采用較為廉價的玉米漿、豆粕水解液等作為氮源替代酵 母抽提物。豆粕等廉價大分子蛋白通常不能直接用作乳酸發(fā)酵的氮源，而需經(jīng)過酸解等預(yù) 處理，使大分子蛋白分解為短肽和氨基酸等小分子，以利于乳酸生產(chǎn)菌株的利用。酸解過程 不僅需要耐酸的設(shè)備，還需要在較高溫度下進行，消耗大量能量。同時高溫和酸性環(huán)境對氨 基酸等營養(yǎng)物質(zhì)有一定的破壞作用。蛋白酶能夠?qū)⒋蠓肿拥鞍捉到鉃樾》肿与暮桶被帷?與酸解過程相比，酶解過程條件更加溫和，有利于保存蛋白水解液中的有效成分。通常情況 下，作為發(fā)酵氮源的蛋白水解預(yù)處理過程與發(fā)酵過程分離，水解過程需要單獨的場地、設(shè)備 和操作，增加了整個發(fā)酵生產(chǎn)過程的設(shè)備投入和操作復(fù)雜程度。如果能將蛋白水解過程與
3發(fā)酵過程相整合，使蛋白酶解和乳酸發(fā)酵同時在發(fā)酵罐中進行，就能夠省去單獨的蛋白酶 解操作，從而節(jié)省場地和設(shè)備投資，有利于降低D-乳酸生產(chǎn)成本?；ㄉ墒菑幕ㄉ式?jīng)壓榨提煉油料后的產(chǎn)品，富含植物蛋白。我國花生的分布非 常廣泛，在世界上我國花生產(chǎn)量位居前列?；ㄉ勺鳛榱硪环N分布廣泛、高產(chǎn)量、含氮量豐 富的廉價氮源，還沒有用于D-乳酸發(fā)酵生產(chǎn)的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了利用花生粕同步酶解發(fā)酵生產(chǎn)高濃度D-乳酸的專用培養(yǎng)基。本發(fā)明所提供的專用培養(yǎng)基，是以花生粕作為有機氮源的發(fā)酵培養(yǎng)基。在所述專用培養(yǎng)基中還添加有蛋白酶，以將花生粕中的蛋白酶解為小分子肽和氨 基酸，并使花生粕酶解過程與發(fā)酵生產(chǎn)D-乳酸同步進行。具體來講，所述專用培養(yǎng)基包括工業(yè)葡萄糖135 150克/升，花生粕20 40 克/升，中性蛋白酶或風(fēng)味蛋白酶或復(fù)合蛋白酶0 0. 5克/升，余量為水；所述培養(yǎng)基的 pH 為 5. 5 6. 5。所述專用培養(yǎng)基中還可添加有PH調(diào)節(jié)劑，優(yōu)選為碳酸鈣，其在發(fā)酵培養(yǎng)基中含量 為70士2克/升。本發(fā)明的第二個目的是提供一種操作簡便、純度較高的利用花生粕同步酶解發(fā)酵 生產(chǎn)高濃度D-乳酸的方法。本發(fā)明所提供的高濃度D-乳酸的生產(chǎn)方法，是將菊糖芽孢乳桿菌 (Sporolactobacillus inulinus)CASD CGMCC No. 2185 接種到上述發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā) 酵，得到高濃度D-乳酸。在上述采用花生粕同步酶解發(fā)酵生產(chǎn)D-乳酸的方法中，所述接種量為5 10 %體 積比；發(fā)酵條件為37 47°C培養(yǎng)42 70小時；優(yōu)選為42°C培養(yǎng)48小時。在發(fā)酵培養(yǎng)進行到30 36小時，葡萄糖濃度降至約50克/升，還需補加葡萄糖， 使發(fā)酵液中葡萄糖濃度達到120 130克/升。為提高發(fā)酵效率，所述發(fā)酵過程采用間歇攪拌，三角瓶中發(fā)酵，每隔8 12小時振 動攪拌一次；發(fā)酵罐中發(fā)酵，每6 8小時攪拌一次，每次攪拌5 10分鐘，轉(zhuǎn)數(shù)優(yōu)選為100
轉(zhuǎn)/分鐘。此外，為獲得更好的發(fā)酵效果，在上述發(fā)酵方法實施前，所述菊糖芽孢乳桿菌 (Sporolactobacillus inulinus)CASD CGMCC No. 2185菌種在發(fā)酵前還需進行斜面培養(yǎng)和
種子培養(yǎng)。所述斜面培養(yǎng)，是將菊糖芽孢乳桿菌(Sporolactobacillus inulinus) CASDCGMCC No. 2185接入斜面培養(yǎng)基中，在37 47°C下培養(yǎng)48 72小時；所述斜面培養(yǎng)基配方為葡 萄糖10克/升，酵母粉5克/升，碳酸鈣1克/升，瓊脂20克/升，溶劑為水，所述斜面培 養(yǎng)基的PH為6. 5，初始pH為6 7。所述種子培養(yǎng)，是將經(jīng)斜面培養(yǎng)的菊糖芽孢乳桿菌 (Sporolactobacillusinulinus)CASD CGMCC No. 2185 再接入種子培養(yǎng)基中，在 37 47V 下培養(yǎng)30 36小時；所述種子培養(yǎng)基配方為所述種子培養(yǎng)基配方為葡萄糖40克/升， 酵母粉5克/升，碳酸鈣3克/升，余量為水；所述種子培養(yǎng)基pH為6 7。
用上述方法獲得的高濃度D-乳酸以及花生粕在同步酶解發(fā)酵生產(chǎn)高濃度D-乳酸 中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護范圍。本發(fā)明首次實現(xiàn)了將花生粕作為廉價氮源同步酶解發(fā)酵生產(chǎn)D-乳酸，本發(fā)明方 法與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點1.發(fā)酵培養(yǎng)基成分簡單，所選氮源花生粕為生產(chǎn)花生油的副產(chǎn)物，價格低廉，資源 豐富，大大降低了生產(chǎn)成本。2.酶解花生粕和發(fā)酵生產(chǎn)乳酸同時進行，省去了有機氮源預(yù)處理的步驟，有效的 節(jié)省了場地占用和設(shè)備投入。3.采用本發(fā)明方法，可以顯著提高D-乳酸的產(chǎn)量，與目前報道(中國專利 CN200810116194.6報道發(fā)酵液中乳酸濃度為180克/升)相比，D-乳酸產(chǎn)量有了明顯的提 高，可達200克/升以上，糖酸轉(zhuǎn)化率達到98. 5% ( 丁子建等報道采用芽孢乳桿菌發(fā)酵制備 D-乳酸，糖酸轉(zhuǎn)化率67. 8% )，光學(xué)純度達到99. 3%0綜上所述，本發(fā)明高濃度D-乳酸的生產(chǎn)方法明顯優(yōu)于現(xiàn)有的高濃度D-乳酸生產(chǎn) 方法，具有純度高、生產(chǎn)效率高、對儀器設(shè)備要求低和成本低廉等優(yōu)點，適合大面積推廣和 應(yīng)用。下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步詳細說明。
具體實施例方式本發(fā)明所使用的菊糖芽孢乳桿菌(Sporolactobacillus inulinus)CASD來源于 中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為北京市朝陽區(qū)大屯 路，中國科學(xué)院微生物研究所)，申請人先前已經(jīng)保藏，保藏登記號為CGMCC No. 2185 ；該菌 株已在申請人發(fā)表的論文和申請的專利中公開。本發(fā)明發(fā)酵培養(yǎng)基中所使用的工業(yè)葡萄糖購自淄博虹宇工業(yè)糖有限公司，花生粕 購自北京康明威培養(yǎng)基技術(shù)有限責(zé)任公司，中性蛋白酶購自北京諾維信生物技術(shù)有限公司 (5萬活力單位/克，滅菌后添加)，風(fēng)味蛋白酶購自北京諾維信生物技術(shù)有限公司(2萬活 力單位/克，滅菌后添加)，復(fù)合蛋白酶購自北京諾維信生物技術(shù)有限公司(2萬活力單位/ 克，滅菌后添加)。本發(fā)明所述利用花生粕同步酶解發(fā)酵生產(chǎn)D-乳酸的基本步驟如下(1)斜面培養(yǎng)將菊糖芽孢乳桿菌(Sporolactobacillus inulinus)CASDCGMCC No. 2185接入斜面培養(yǎng)基，將斜面放置在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度37 47°C，培養(yǎng)時間 48 72小時，斜面培養(yǎng)基的初始pH值為6 7。(2)種子培養(yǎng)將培養(yǎng)好的菌種轉(zhuǎn)入種子培養(yǎng)基，在培養(yǎng)箱中進行靜置培養(yǎng)，培養(yǎng) 溫度37 47V，培養(yǎng)時間30 36小時，種子培養(yǎng)基初始pH值為6 7。(3)發(fā)酵培養(yǎng)以5 10%體積比的接種量，將培養(yǎng)好的種子液轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基進 行發(fā)酵培養(yǎng)。發(fā)酵溫度37 47°C，發(fā)酵時間42 70小時，發(fā)酵罐中發(fā)酵過程中可進行間 歇性攪拌，每6 8小時攪拌一次，每次攪拌5 10分鐘，轉(zhuǎn)數(shù)優(yōu)選100轉(zhuǎn)/分鐘。三角瓶 中發(fā)酵每隔8 12小時振動攪拌一次。(4)發(fā)酵罐葡萄糖補料上述步驟(3)中發(fā)酵培養(yǎng)進行到30 36小時，葡萄糖濃 度降至約50克/升，補加葡萄糖，使發(fā)酵液中葡萄糖濃度達到120 130克/升。
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(5)樣品測定取發(fā)酵液以6，000轉(zhuǎn)/分鐘的速度離心5分鐘，取上清液稀釋適 當倍數(shù)，檢測葡萄糖含量，D-乳酸含量和L-乳酸含量。葡萄糖濃度用生物傳感分析儀 SBA-40C(山東省科學(xué)院生物研究所)測定。L-乳酸和D-乳酸含量采用Agilent 1100液 相色譜儀(安捷倫科技有限公司)測定，手性分離柱(日本三菱化學(xué)公司，MCI GEL-CRS10 W(3 μ ) 4. 6IDX 50mm,光學(xué)異體分離用)，0. 002mol/L硫酸銅為流動相，流量0. 5mL/min,進 樣量20 μ L，紫外檢測器，檢測波長254nm，操作溫度25°C。D-乳酸標準品為Sigma-Aldrich 公司產(chǎn)品，貨號為L0625，L-乳酸標準品為Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品，貨號為L1750。在該 色譜條件下，D-乳酸標準品的保留時間為9. 724分鐘。D-乳酸光學(xué)純度計算方法D-乳酸光學(xué)純度(％) = (D-乳酸濃度(克/ 升)+ [D-乳酸濃度(克 / 升)+L-乳酸濃度(克 / 升)])X 100 % [Bioresource Technology 101(2010)6494 6498]糖酸轉(zhuǎn)化率計算方法轉(zhuǎn)化率(％ ) = (D-乳酸濃度(克/升)+葡萄糖消耗量 (克/升))X100%下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。其目的是為了更好的理解本 發(fā)明的內(nèi)容，因此，所舉例的實例并不限制本發(fā)明的保護范圍。實施例1 利用菊糖芽孢乳桿菌(Sporolactobacillus inulinus) CASD CGMCCNo. 2185在37°C下發(fā)酵生產(chǎn)D-乳酸，50mL發(fā)酵液/IOOmL三角瓶，發(fā)酵時間42小時。本實施例中所使用的各培養(yǎng)基的組成如下斜面培養(yǎng)基葡萄糖10克/升，酵母粉5克/升，碳酸鈣1克/升，瓊脂20克/升， 溶劑為水，所述斜面培養(yǎng)基的PH為6. 5，121°C滅菌20分鐘。種子培養(yǎng)基葡萄糖40克/升，酵母粉5克/升，碳酸鈣3克/升，溶劑為水，所述 種子培養(yǎng)基的PH為6. 5，121°C滅菌20分鐘。發(fā)酵培養(yǎng)基工業(yè)葡萄糖135克/升，花生粕40克/升，中性蛋白酶0. 1克/升， 碳酸鈣70克/升，余量為水，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的pH為6. 5，115°C滅菌20分鐘。該發(fā)酵生產(chǎn)D-乳酸的方法包括以下步驟(1)斜面培養(yǎng)將菊糖芽孢乳桿菌(Sporolactobacillus inulinus)CASDCGMCC No 2185接種于斜面培養(yǎng)基上，42°C培養(yǎng)72小時；(2)種子培養(yǎng)將步驟(1)培養(yǎng)的菌株在無菌條件下用接種環(huán)接2環(huán)于裝有30mL 種子培養(yǎng)基的IOOmL三角瓶中，42°C靜置培養(yǎng)36小時，然后以10%體積比的接種量接種到 新的種子培養(yǎng)基中，42°C靜止培養(yǎng)36小時，即活化種子一次，制得種子培養(yǎng)液；(3)發(fā)酵培養(yǎng)將上述種子培養(yǎng)基以10%體積比的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基 (50mL發(fā)酵液/IOOmL三角瓶)中，放置在37°C靜止培養(yǎng)，每隔12小時振蕩攪拌一次，培養(yǎng) 42小時，結(jié)束發(fā)酵。發(fā)酵結(jié)束后，根據(jù)上述具體實施方式
中所述的檢測和計算方法，檢測發(fā)酵結(jié)束后 發(fā)酵液中D-乳酸含量、葡萄糖含量，計算轉(zhuǎn)化率、D-乳酸光學(xué)純度。該實驗共設(shè)3次重復(fù)。 D-乳酸含量112 士 3克/升，葡萄糖含量20 士 1克/升，糖酸轉(zhuǎn)化率97.4%，D-乳酸光學(xué)純 度達到99. 2%。實施例2 利用菊糖芽孢乳桿菌(Sporolactobacillus inulinus)CASD CGMCCNo. 2185在42°C下發(fā)酵生產(chǎn)D-乳酸，50mL發(fā)酵液/IOOmL三角瓶，發(fā)酵時間42小時。
本實施例中所使用的各培養(yǎng)基的組成如下斜面培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基同實施例1。該發(fā)酵生產(chǎn)D-乳酸的方法包括以下步驟(1)斜面培養(yǎng)同實施例1 ；(2)種子培養(yǎng)同實施例1 ；(3)發(fā)酵培養(yǎng)將上述種子培養(yǎng)基以10%體積比的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基 (50mL發(fā)酵液/IOOmL三角瓶)中，放置在42°C靜置培養(yǎng)，每隔12小時振蕩攪拌一次，培養(yǎng) 42小時，結(jié)束發(fā)酵。發(fā)酵結(jié)束后，根據(jù)上述具體實施方式
中所述的檢測和計算方法，檢測發(fā)酵結(jié)束后 發(fā)酵液中D-乳酸含量、葡萄糖含量，計算轉(zhuǎn)化率、D-乳酸光學(xué)純度。該實驗共設(shè)3次重復(fù)。 D-乳酸含量129士2克/升，葡萄糖含量0. 3士0. 2克/升，糖酸轉(zhuǎn)化率96. 0%，D-乳酸光 學(xué)純度達到99. 1%。實施例3 利用菊糖芽孢乳桿菌(Sporolactobacillus inulinus) CASD CGMCCNo. 2185在47°C下發(fā)酵生產(chǎn)D-乳酸，50mL發(fā)酵液/IOOmL三角瓶，發(fā)酵時間42小時。本實施例中所使用的各培養(yǎng)基的組成如下斜面培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基同實施例1。該發(fā)酵生產(chǎn)D-乳酸的方法包括以下步驟(1)斜面培養(yǎng)同實施例1 ；(2)種子培養(yǎng)同實施例1 ；(3)發(fā)酵培養(yǎng)將上述種子培養(yǎng)基以10%體積比的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基 (50mL發(fā)酵液/IOOmL三角瓶)中，放置在47°C靜置培養(yǎng)，每隔12小時振蕩攪拌一次，培養(yǎng) 42小時，結(jié)束發(fā)酵。發(fā)酵結(jié)束后，根據(jù)上述具體實施方式
中所述的檢測和計算方法，檢測發(fā)酵結(jié)束后 發(fā)酵液中D-乳酸含量、葡萄糖含量，計算轉(zhuǎn)化率、D-乳酸光學(xué)純度。該實驗共設(shè)3次重復(fù)。 D-乳酸含量128士2克/升，葡萄糖含量3. 7士0. 6克/升，糖酸轉(zhuǎn)化率97. 5%，D-乳酸光 學(xué)純度達到99.3%。實施例4 利用菊糖芽孢乳桿菌(Sporolactobacillus inulinus)CASD CGMCCNo. 2185在20克/升花生粕濃度下發(fā)酵生產(chǎn)D-乳酸，50mL發(fā)酵液/IOOmL三角瓶，發(fā) 酵溫度42 °C，發(fā)酵時間48小時。本實施例中所使用的各培養(yǎng)基的組成如下斜面培養(yǎng)基和種子培養(yǎng)基同實施例1 ；發(fā)酵培養(yǎng)基花生粕濃度為20克/升，同時添加工業(yè)葡萄糖135克/升，中性蛋白 酶0. 5克/升，碳酸鈣70克/升，余量為水，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的pH為6. 5，115°C滅菌20分鐘。該發(fā)酵生產(chǎn)D-乳酸的方法包括以下步驟(1)斜面培養(yǎng)同實施例1 ；(2)種子培養(yǎng)同實施例1 ；(3)發(fā)酵培養(yǎng)將上述種子培養(yǎng)基以10%體積比的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基 (50mL發(fā)酵液/IOOmL三角瓶)中，42°C靜置培養(yǎng)，每隔12小時振蕩攪拌一次，培養(yǎng)48小時，結(jié)束發(fā)酵。發(fā)酵結(jié)束后，根據(jù)上述具體實施方式
中所述的檢測和計算方法，檢測發(fā)酵結(jié)束后 發(fā)酵液中D-乳酸含量、葡萄糖含量，計算轉(zhuǎn)化率、D-乳酸光學(xué)純度。該實驗共設(shè)3次重復(fù)， 結(jié)果表明，D-乳酸含量102. 0士4克/升，葡萄糖含量30士2克/升，糖酸轉(zhuǎn)化率97. 0%， D-乳酸光學(xué)純度達到99. 4%。實施例5 利用菊糖芽孢乳桿菌(Sporolactobacillus inulinus)CASD CGMCCNo. 2185在30克/升花生粕濃度下發(fā)酵生產(chǎn)D-乳酸，50mL發(fā)酵液/IOOmL三角瓶，發(fā) 酵溫度42 °C，發(fā)酵時間48小時。本實施例中所使用的各培養(yǎng)基的組成如下斜面培養(yǎng)基和種子培養(yǎng)基同實施例1。發(fā)酵培養(yǎng)基花生粕濃度為30克/升，同時添加工業(yè)葡萄糖135克/升，中性蛋白 酶0. 5克/升，碳酸鈣70克/升，余量為水，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的pH為6. 5，115°C滅菌20分鐘。該發(fā)酵生產(chǎn)D-乳酸的方法包括以下步驟(1)斜面培養(yǎng)同實施例1 ；(2)種子培養(yǎng)同實施例1 ；(3)發(fā)酵培養(yǎng)同實施例4。發(fā)酵結(jié)束后，根據(jù)上述具體實施方式
中所述的檢測和計算方法，檢測發(fā)酵結(jié)束后 發(fā)酵液中D-乳酸含量、葡萄糖含量，計算轉(zhuǎn)化率、D-乳酸光學(xué)純度。該實驗共設(shè)3次重復(fù)，結(jié) 果表明，D-乳酸含量128士5克/升，葡萄糖含量3士0. 5克/升，糖酸轉(zhuǎn)化率96. 5%,D-乳 酸光學(xué)純度達到99. 2%。實施例6 利用菊糖芽孢乳桿菌(Sporolactobacillus inulinus)CASD CGMCCNo. 2185在40克/升花生粕濃度下發(fā)酵生產(chǎn)D-乳酸，50mL發(fā)酵液/IOOmL三角瓶，發(fā) 酵溫度42 °C，發(fā)酵時間48小時。本實施例中所使用的各培養(yǎng)基的組成如下斜面培養(yǎng)基和種子培養(yǎng)基同實施例1。發(fā)酵培養(yǎng)基花生粕濃度為40克/升，同時添加工業(yè)葡萄糖135克/升，中性蛋白 酶0. 5克/升，碳酸鈣70克/升，余量為水，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的pH為6. 5，115°C滅菌20分鐘。該發(fā)酵生產(chǎn)D-乳酸的方法包括以下步驟(1)斜面培養(yǎng)同實施例1 ；(2)種子培養(yǎng)同實施例1 ；(3)發(fā)酵培養(yǎng)同實施例4。發(fā)酵結(jié)束后，根據(jù)上述具體實施方式
中所述的檢測和計算方法，檢測發(fā)酵結(jié)束后 發(fā)酵液中D-乳酸含量、葡萄糖含量，計算轉(zhuǎn)化率、D-乳酸光學(xué)純度。該實驗共設(shè)3次重復(fù)， 結(jié)果表明，D-乳酸含量129士5克/升，葡萄糖含量4士3克/升，糖酸轉(zhuǎn)化率97. 8%，光學(xué) 純度達到99. 2%。實施例7 利用菊糖芽孢乳桿菌(Sporolactobacillus inulinus)CASD CGMCCNo. 2185添加不同種類的蛋白酶發(fā)酵生產(chǎn)D-乳酸，50mL發(fā)酵液/IOOmL三角瓶，溫度
842°C靜置發(fā)酵60小時。本實施例中所使用的各培養(yǎng)基的組成如下斜面培養(yǎng)基和種子培養(yǎng)基同實施例1。發(fā)酵培養(yǎng)基設(shè)計3種培養(yǎng)基，分別添加中性蛋白酶0. 5克/升，風(fēng)味蛋白酶0. 5 克/升，復(fù)合蛋白酶0. 5克/升，同時添加工業(yè)葡萄糖135克/升，花生粕40克/升，碳酸 鈣70克/升，余量為水，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的pH為6. 5，115°C滅菌20分鐘。該發(fā)酵生產(chǎn)D-乳酸的方法包括以下步驟(1)斜面培養(yǎng)同實施例1 ；(2)種子培養(yǎng)同實施例1 ；(3)發(fā)酵培養(yǎng)將上述種子培養(yǎng)基以5%體積比的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基(50mL 發(fā)酵液/IOOmL三角瓶)中，42°C靜置培養(yǎng)，每隔12小時振蕩攪拌一次，培養(yǎng)60小時，結(jié)束 發(fā)酵。發(fā)酵結(jié)束后，根據(jù)上述具體實施方式
中所述的檢測和計算方法，檢測發(fā)酵結(jié)束后 發(fā)酵液中D-乳酸含量、葡萄糖含量，計算轉(zhuǎn)化率、D-乳酸光學(xué)純度。該實驗共設(shè)3次重復(fù)， 結(jié)果表明，添加風(fēng)味蛋白酶，復(fù)合蛋白酶，中性蛋白酶的培養(yǎng)基分別產(chǎn)D-乳酸108士 1克/ 升，112士 1克/升，129士3克/升，糖酸轉(zhuǎn)化率最高達98. 0%，D-乳酸光學(xué)純度最高達到 99. 2%。實施例8 利用菊糖芽孢乳桿菌(Sporolactobacillus inulinus) CASD CGMCCNo. 2185在不添加中性蛋白酶的情況下發(fā)酵生產(chǎn)D-乳酸，50mL發(fā)酵液/IOOmL三角 瓶，溫度42 V，發(fā)酵時間48小時。本實施例中所使用的各培養(yǎng)基的組成如下斜面培養(yǎng)基和種子培養(yǎng)基同實施例1。發(fā)酵培養(yǎng)基工業(yè)葡萄糖135克/升，花生粕40克/升，碳酸鈣70克/升，余量為 水，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的PH為6. 5，115°C滅菌20分鐘。該發(fā)酵生產(chǎn)D-乳酸的方法包括以下步驟(1)斜面培養(yǎng)同實施例1 ；(2)種子培養(yǎng)同實施例1 ；(3)發(fā)酵培養(yǎng)將上述種子培養(yǎng)基以10%體積比的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基 (50mL發(fā)酵液/IOOmL三角瓶)中，42°C靜止培養(yǎng)，每隔12小時振蕩攪拌一次，培養(yǎng)48小時 結(jié)束發(fā)酵。發(fā)酵結(jié)束后，根據(jù)上述具體實施方式
中所述的檢測和計算方法，檢測發(fā)酵結(jié)束后 發(fā)酵液中D-乳酸含量、葡萄糖含量，計算轉(zhuǎn)化率、D-乳酸光學(xué)純度。該實驗共設(shè)3次重復(fù)， 結(jié)果表明，D-乳酸含量58士3克/升，葡萄糖含量75士3克/升，糖酸轉(zhuǎn)化率96. 6%，D_乳 酸的光學(xué)純度99.3%。實施例9 利用菊糖芽孢乳桿菌(Sporolactobacillus inulinus)CASD CGMCCNo. 2185在5升全自動發(fā)酵罐中發(fā)酵生產(chǎn)D-乳酸，發(fā)酵溫度42 V，發(fā)酵時間66小時。本實施例中所使用的各培養(yǎng)基的組成如下(1)斜面培養(yǎng)基同實施例1 ；(2)種子培養(yǎng)基同實施例1 ；
(3)發(fā)酵培養(yǎng)基工業(yè)葡萄糖150克/升，花生粕40克/升，中性蛋白酶0. 5克/ 升，碳酸鈣70克/升，余量為水，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的pH為6. 5，115°C滅菌20分鐘。再配制 糖母液和碳酸鈣粉末，115°C滅菌20分鐘。該發(fā)酵生產(chǎn)D-乳酸的方法包括以下步驟(1)斜面培養(yǎng)同實施例1 ；(2)種子培養(yǎng)將步驟1培養(yǎng)的菌株，在無菌條件下用接種環(huán)接2環(huán)于裝有30mL種 子培養(yǎng)基的IOOmL三角瓶中，42°C靜置培養(yǎng)36小時，然后將30mL種子培養(yǎng)液接種到300mL 新的種子培養(yǎng)基中，42°C靜置培養(yǎng)36小時，制得種子培養(yǎng)液；(3)發(fā)酵培養(yǎng)將300mL步驟⑵制得的種子培養(yǎng)液在無菌條件下接入裝有3. 7 升發(fā)酵培養(yǎng)基的5升全自動發(fā)酵罐(上海保興BIOTECH)中，42°C靜置培養(yǎng)，每隔6小時攪 拌一次，每次以100轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速攪拌5分鐘，培養(yǎng)30小時，此時發(fā)酵液中葡萄糖濃度約為 50克/升，補加葡萄糖280克，補加碳酸鈣160克，使發(fā)酵液中葡萄糖濃度達到120 130 克/升。66小時結(jié)束發(fā)酵。發(fā)酵結(jié)束后，根據(jù)上述具體實施方式
中所述的檢測和計算方法，檢測發(fā)酵液中 D-乳酸含量、葡萄糖含量，計算轉(zhuǎn)化率和D-乳酸光學(xué)純度。結(jié)果表明D-乳酸含量205士3 克/升，葡萄糖含量1. 0士0. 6克/升，糖酸轉(zhuǎn)化率98. 5%，D-乳酸的光學(xué)純度99. 3%。實施例10 利用菊糖芽孢乳桿菌(Sporolactobacillus inulinus)CASD CGMCC No 2185在50升全自動發(fā)酵罐中發(fā)酵生產(chǎn)D-乳酸，發(fā)酵溫度42V，發(fā)酵時間70小時。本實施例中所使用的各培養(yǎng)基的組成如下(1)斜面培養(yǎng)基同實施例1 ；(2)種子培養(yǎng)基同實施例1 ；(3)發(fā)酵培養(yǎng)基同實施例9 ；該發(fā)酵生產(chǎn)D-乳酸的方法包括以下步驟(1)斜面培養(yǎng)同實施例1 ；(2)種子培養(yǎng)將步驟1培養(yǎng)的菌株，在無菌條件下用接種環(huán)接2環(huán)于裝有30mL種 子培養(yǎng)基的IOOmL三角瓶中，42°C靜置培養(yǎng)36小時，然后將30mL種子培養(yǎng)液接種到300mL 新的種子培養(yǎng)基中，42°C靜置培養(yǎng)36小時，然后將300mL種子培養(yǎng)液接種到3000mL新的種 子培養(yǎng)基中，42°C靜置培養(yǎng)36小時，制得種子培養(yǎng)液；(3)發(fā)酵培養(yǎng)將3000mL步驟2制得的種子培養(yǎng)液在無菌條件下接入裝有37升 發(fā)酵培養(yǎng)基的50升全自動發(fā)酵罐(上海保興BIOTECH)中，42°C靜置培養(yǎng)，每隔8小時攪拌 一次，每次以100轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速攪拌5分鐘，培養(yǎng)36小時，此時發(fā)酵液中葡萄糖濃度約為50 克/升，補加葡萄糖2800克和1600克碳酸鈣，使發(fā)酵液中葡萄糖濃度達到120 130克/ 升。70小時結(jié)束發(fā)酵。發(fā)酵結(jié)束后，根據(jù)上述具體實施方式
中所述的檢測和計算方法，檢測發(fā)酵液中 D-乳酸含量、葡萄糖含量，計算轉(zhuǎn)化率和D-乳酸光學(xué)純度。結(jié)果表明D-乳酸含量203士3 克/升，葡萄糖含量2士 1克/升，糖酸轉(zhuǎn)化率97.8%，D-乳酸的光學(xué)純度99. 2%。
權(quán)利要求
利用花生粕同步酶解發(fā)酵生產(chǎn)高濃度D-乳酸的專用培養(yǎng)基，是以花生粕作為有機氮源的發(fā)酵培養(yǎng)基。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的專用培養(yǎng)基，其特征在于所述培養(yǎng)基中還添加有蛋白酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的專用培養(yǎng)基，其特征在于所述培養(yǎng)基包括工業(yè)葡萄糖 135 150克/升，花生粕20 40克/升，中性蛋白酶或風(fēng)味蛋白酶或復(fù)合蛋白酶0 0. 5 克/升，余量為水；所述培養(yǎng)基的pH為5. 5 6. 5。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的專用培養(yǎng)基，其特征在于所述培養(yǎng)基中還添加有 PH調(diào)節(jié)劑，優(yōu)選為碳酸鈣，其在發(fā)酵培養(yǎng)基中含量為70士2克/升。
5.一種利用花生粕同步酶解發(fā)酵生產(chǎn)高濃度D-乳酸的方法，是將菊糖芽孢乳桿菌 (Sporolactobacillus inulinus) CASD CGMCC No. 2185 接種到權(quán)利 1-4 任一項所述的專用 培養(yǎng)基中進行發(fā)酵，得到高濃度D-乳酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述接種量為5 10%體積比；所述發(fā)酵 條件為37 47°C培養(yǎng)42 70小時；優(yōu)選為42°C培養(yǎng)48小時。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于在發(fā)酵培養(yǎng)進行到30 36小時，葡萄糖 濃度降至約50克/升，還需補加葡萄糖，使發(fā)酵液中葡萄糖濃度達到120 130克/升。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵過程采用間歇攪拌，三角瓶中發(fā) 酵，每隔8 12小時振動攪拌一次；發(fā)酵罐中發(fā)酵，每6 8小時攪拌一次，每次攪拌5 10分鐘，轉(zhuǎn)數(shù)優(yōu)選為100轉(zhuǎn)/分鐘。
9.根據(jù)權(quán)利要求5-8任一項所述的方法，其特征在于所述菊糖芽孢乳桿菌 (Sporolactobacillus inulinus)CASD CGMCC No. 2185 菌種在發(fā)酵前還需進行斜面培養(yǎng) 和種子培養(yǎng)；所述斜面培養(yǎng)，是將菊糖芽孢乳桿菌(Sporolactobacillusinulinus)CASD CGMCC No. 2185接入斜面培養(yǎng)基中，在37 47°C下培養(yǎng)48 72小時；所述斜面培養(yǎng)基配 方為葡萄糖10克/升，酵母粉5克/升，碳酸鈣1克/升，瓊脂20克/升，溶劑為水，所述 斜面培養(yǎng)基的PH為6. 5，初始pH為6 7 ；所述種子培養(yǎng)，是將經(jīng)斜面培養(yǎng)的菊糖芽孢乳 桿菌(Sporolactobacillus inulinus)CASDCGMCC No. 2185 再接入種子培養(yǎng)基中，在 37 47°C下培養(yǎng)30 36小時；所述種子培養(yǎng)基配方為所述種子培養(yǎng)基配方為葡萄糖40克/ 升，酵母粉5克/升，碳酸鈣3克/升，余量為水；所述種子培養(yǎng)基pH為6 7。
10.花生粕在同步酶解發(fā)酵生產(chǎn)高濃度D-乳酸中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種采用花生粕同步酶解發(fā)酵生產(chǎn)高濃度D-乳酸的方法及其專用培養(yǎng)基。所述專用培養(yǎng)基是以花生粕作為有機氮源的發(fā)酵培養(yǎng)基。此外，所述專用培養(yǎng)基中還添加有蛋白酶。所述高濃度D-乳酸的生產(chǎn)方法是將菊糖芽孢乳桿菌(Sporolactobacillus inulinus)CASD CGMCC No.2185接種到所述專用培養(yǎng)基中進行發(fā)酵，得到高濃度D-乳酸。本發(fā)明高濃度D-乳酸的生產(chǎn)方法明顯優(yōu)于現(xiàn)有的高濃度D-乳酸生產(chǎn)方法，具有純度高、生產(chǎn)效率高、對儀器設(shè)備要求低和成本低廉等優(yōu)點，適合大面積推廣和應(yīng)用。
文檔編號C12R1/01GK101886095SQ201010208148
公開日2010年11月17日 申請日期2010年6月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月13日
發(fā)明者唐鴻志, 李峰嵩, 李慶剛, 王麗敏, 許平, 趙博, 馬延和, 馬翠卿 申請人:天津工業(yè)生物技術(shù)研究所