專利名稱：采用重組大腸桿菌生產(chǎn)手性β－(R)－羥基丁酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于工業(yè)微生物，發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種采用生物發(fā)酵法直接生產(chǎn)β-(R)-羥基丁酸的方法。
β-(R)-羥基丁酸可用化學(xué)合成并拆分或降解聚-β-(R)-羥基丁酸(PHB)得到。這兩種方法工藝復(fù)雜，生產(chǎn)成本較高。
本發(fā)明的目的在于為克服已有技術(shù)的不足之處提出采用重組大腸桿菌生產(chǎn)手性β-(R)-羥基丁酸的方法，通過構(gòu)建帶有phbA和phbB基因的質(zhì)粒并用此質(zhì)粒轉(zhuǎn)化得到重組大腸桿菌，用該大腸桿菌進行發(fā)酵得到β-(R)-羥基丁酸。具有生產(chǎn)工藝簡化，生產(chǎn)污染低，產(chǎn)品成本低的優(yōu)點。
本發(fā)明提出一種生產(chǎn)β-(R)-羥基丁酸的方法，由構(gòu)建的帶有phbA和phbB基因的質(zhì)粒并用此質(zhì)粒轉(zhuǎn)化得到重組大腸桿菌和發(fā)酵該重組大腸桿菌生產(chǎn)β-(R)-羥基丁酸組成，其特征在于所說的發(fā)酵過程包括(1)將基因phbA和phbB克隆到質(zhì)粒中構(gòu)建出新質(zhì)粒。(2)將構(gòu)建質(zhì)粒轉(zhuǎn)到大腸桿菌中。(3)發(fā)酵該重組大腸桿菌獲取β-(R)-羥基丁酸。
本發(fā)明方法所說的質(zhì)粒構(gòu)建與傳統(tǒng)的質(zhì)粒構(gòu)建方法相同，包括將含基因phbA和phbB的DNA片段和所用的質(zhì)粒進行相關(guān)酶切；利用連接酶進行連接；利用常規(guī)轉(zhuǎn)化手段進行質(zhì)粒轉(zhuǎn)化及篩選。篩選出的含連接好的質(zhì)粒的菌株即為所需發(fā)酵用的菌株。
本發(fā)明所用的發(fā)酵方法為常規(guī)的工業(yè)發(fā)酵方法，均可采用傳統(tǒng)微生物發(fā)酵的工藝設(shè)備。
本發(fā)明利用的是基因重組大腸桿菌直接發(fā)酵生產(chǎn)β-(R)-羥基丁酸，簡化了傳統(tǒng)化學(xué)合成對設(shè)備的復(fù)雜要求和工藝流程的繁瑣。省去了手性分離的復(fù)雜過程，并降低了由于化學(xué)合成和手性分離帶來的環(huán)境損害。并可能實現(xiàn)生產(chǎn)成本降低。
實施例用重組大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)β-(R)-羥基丁酸菌種大腸桿菌E.coli HB101基因來源phbA和phbB來自菌種Ralstonia eutropha的基因組，基因片段連接在質(zhì)粒pBHR68上。
(1)質(zhì)粒構(gòu)建用限制性內(nèi)切酶Pst I酶切質(zhì)粒pBHR68得到基因phbB和phbA。并將其插入到質(zhì)粒pUC18的Pst I酶切位點。所得到的質(zhì)粒pUCAB含有位于啟動子lac下游的基因phbB和phbA。
(2)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化用電轉(zhuǎn)化將質(zhì)粒轉(zhuǎn)到菌株E.coli HB101中。篩選出的含連接好的質(zhì)粒的菌株即為所需發(fā)酵用的重組大腸桿菌菌株。
(3)發(fā)酵培養(yǎng)利用所得的基因重組菌發(fā)酵培養(yǎng)36-48小時后離心(4000g)得上清液，濃縮干燥后以氣相色譜檢測β-(R)-羥基丁酸，產(chǎn)量為1.2g/l。
培養(yǎng)基為0.5g/L硫酸銨，0.2g/L硫酸鎂，9.65g/L十二水磷酸氫二鈉，2.65g/L磷酸二氫鉀，60mg/L氨卞青霉素，50g/L葡萄糖和1ml/L微量元素?？傮w積約3L。
微量元素的配制1升1mol/L鹽酸中(g)20六水氯化鐵，10氯化鈣，0.03五水硫酸銅，0.05四水氯化錳，0.1七水硫酸鋅，pH 6.8。
權(quán)利要求
1.一種采用重組大腸桿菌生產(chǎn)手性β-(R)-羥基丁酸的方法，其特征在于，包括以下步驟(1)將合成聚-β-(R)-羥基丁酸(PHB)的前體基因phbA和phbB克隆到質(zhì)粒載體中構(gòu)建出重組質(zhì)粒；(2)將將含phbA和phbB基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)到大腸桿菌中獲得重組大腸桿菌；(3)對該重組大腸桿菌發(fā)酵獲取β-(R)-羥基丁酸。
全文摘要
本發(fā)明屬于工業(yè)微生物,發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域。包括以下步驟:(1)將合成聚－β－(R)－羥基丁酸(PHB)的前體基因phbA和phbB克隆到質(zhì)粒載體中構(gòu)建出重組質(zhì)粒;(2)將將含phbA和phbB基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)到大腸桿菌中獲得重組大腸桿菌;(3)對該重組大腸桿菌發(fā)酵獲取β－(R)－羥基丁酸。本發(fā)明生產(chǎn)工藝簡單,容易操作,開創(chuàng)了一種新型生物法生產(chǎn)β－(R)－羥基丁酸的道路。
文檔編號C12P7/42GK1357629SQ01118668
公開日2002年7月10日 申請日期2001年6月8日 優(yōu)先權(quán)日2001年6月8日
發(fā)明者陳國強, 席建忠, 吳瓊, 張廣 申請人:清華大學(xué)