專利名稱：重組人肌鈣蛋白i在大腸桿菌中的表達(dá)及其在抗腫瘤中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及人快速骨骼肌型肌鈣蛋白I(簡(jiǎn)稱人肌鈣蛋白)英文簡(jiǎn)稱(TnI)基因的克隆含有該基因的大腸桿菌表達(dá)載體的構(gòu)建以及將該基因產(chǎn)物在大腸桿菌中的表達(dá)，純化及其在抑制血管形成和抗腫瘤治療中的應(yīng)用。
發(fā)明目的TnI在軟骨、血液中的含量甚微。直接分離純化顯然有相當(dāng)難度，也無(wú)法滿足作為臨床治療藥物的需要。本發(fā)明的目的在于提供一個(gè)高效的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)以生產(chǎn)具有抑制血管形成與生長(zhǎng)作用的重組人TnI，該表達(dá)系統(tǒng)與現(xiàn)有技術(shù)相比具有優(yōu)良的表達(dá)率，易于純化，產(chǎn)品純度高，抑瘤效果好，本發(fā)明的制造的產(chǎn)品作為一種生物制劑可應(yīng)用于實(shí)體瘤的治療。
用pET3b-TnI-His6表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)/pLysS，并篩選表達(dá)TnI-His6的表達(dá)株，稱為BL21(DE3)/pLysS/pET3b-TnI-His6。BL21(DE3)/pLysS/pET3b-TnI-His6的培養(yǎng)與IPTG誘導(dǎo)將單菌落接種于含200ug/ml Ampicillin(氨芐青霉素)的LB培養(yǎng)液，37℃振搖培養(yǎng)過(guò)夜，次日以1∶100稀釋轉(zhuǎn)種于較大體積的固種培養(yǎng)液，37℃繼續(xù)培養(yǎng)至OD600≈0.5-0.6，加入誘導(dǎo)劑IPTG至最終濃度0.5-1.0mM，37℃誘導(dǎo)培養(yǎng)3-4小時(shí)后，離心收集細(xì)胞。重組人肌鈣蛋白TnI-His融合蛋白的分離與純化由于本系統(tǒng)所表達(dá)的TnI-His融合蛋白大部分以不溶形成存在于包涵體內(nèi)，因此純化的大致流程為包涵體分離→蛋白變性溶解→Ni柱純化→柱內(nèi)復(fù)活→洗脫，詳細(xì)過(guò)程見(jiàn)實(shí)施例本發(fā)明所生產(chǎn)的人肌鈣蛋白TnI對(duì)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUV-EC)生長(zhǎng)的抑制作用。
將所純化的重組人肌鈣蛋白TnI加入含有人血管內(nèi)皮細(xì)胞HUV-EC的培養(yǎng)液中，三天后，用3H-胸腺嘧啶摻入法，測(cè)量人肌鈣蛋白TnI對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的抑制活性。如圖4所示，本發(fā)明所生產(chǎn)的人肌鈣蛋白TnI對(duì)HUV-EC呈劑量依賴性抑制，其IC50為5μg/ml。這一結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)的結(jié)果相似(proceedingsof the National Academy of Sciences)。本發(fā)明所純化的重組人肌鈣蛋白TnI對(duì)動(dòng)物腫瘤血管的抑制作用。
將純化后重組人肌鈣蛋白TnI對(duì)荷S180小鼠給藥，連續(xù)給藥7天后，脫頸處死動(dòng)物，稱體重，剖瘤稱重，計(jì)算腫瘤抑制率，如表1所示，本發(fā)明所生產(chǎn)的人肌鈣蛋白對(duì)腫瘤呈劑量依賴性抑制，其腹腔給藥5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg組抑制率分別達(dá)到31％、46.6％、60.3％，皮下給藥5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg組抑制率分別達(dá)到32.9％、45％、56.4％。
本發(fā)明的內(nèi)容還包括制備一種TnI蛋白為活性成分的藥物制劑，該藥物制劑主要以非胃腸道途徑給藥，如普通注射劑、冷凍干燥注射劑、脂質(zhì)體注射劑、靶向給藥的注射劑等，也可制成胃腸道途徑給藥的制劑，如片劑、膠囊劑、噴霧劑、凝膠劑、凝膠吸入劑、口服液、混懸劑、沖劑、貼劑、丸劑、散劑、注射劑、輸液劑、栓劑、緩釋制劑、控釋制劑等。
本發(fā)明的藥物制劑其中TnI蛋白的含量為1-99％，其他為藥物可接受的載體。這些藥物可接受的載體可以是，淀粉、糊精、蔗糖、乳糖、纖維素類、硬脂酸鎂、吐溫-80、卡波姆、甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、海藻酸鈉、甘油、明膠、聚乙二醇、硫柳汞、尼泊金丙酯、尼泊金甲酯、尼泊金乙酯、三氯叔丁醇、苯甲酸鈉、硼砂、新潔爾滅、山梨醇、丙二醇異丙醇，月桂氮桌酮，異丙醇/丙二醇(1∶1)，異丙醇/(1∶2)和異丙醇/丙二醇(2∶1)、三乙醇胺、氫氧化鈉凡士林、硬脂酸、液狀石蠟、羊毛脂、十八醇、十六醇。單硬脂酸甘油酯、月桂醇硫酸鈉、司盤60、平平加0、甘露醇、山梨醇等。
本發(fā)明的藥物制劑可以通過(guò)本領(lǐng)域通常的方法制備。
以下為圖表說(shuō)明序列表本發(fā)明克隆的人肌鈣蛋白TnI的DNA序列及由它所編碼的氨基酸序列，以及本發(fā)明所生產(chǎn)的人肌鈣蛋白TnI-His融合蛋白的氨基酸序列。

圖1、大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建過(guò)程示意2、本發(fā)明表達(dá)純化的人肌鈣蛋白TnI-His融合蛋白的聚丙烯酰胺電泳3、本發(fā)明生產(chǎn)的重組TnI-His融合蛋白對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用依次用20毫升緩沖液B，50毫升緩沖液C(8M Urea，0.1M NaH2PO4，0.01MTris pH8.0)，50毫升緩沖液D[8M Urea，0.1M NaH2PO4，0.01M Tris pH6.5]，和40毫升緩沖液E(0.1M NaH2PO4pH6.5)以2毫升/每分鐘的速度洗柱。然后用以下梯度溶液洗柱使柱內(nèi)已變性的TnI-His融合蛋白在被洗脫下來(lái)之前在柱內(nèi)復(fù)性，速度為2毫升/每分鐘。
緩沖液D 緩沖液E25毫升 5毫升20 1015 1510 20525030030用15-20毫升緩沖液F(0.1M NaH2PO4，300mM-600mM imdizale，2mM DTT，pH6.0)洗脫層析柱。
最后用centricon脫鹽和濃縮蛋白樣品，并用15％SDS-PAGE檢測(cè)所純化的人肌鈣蛋白TnI-His的分子量和純度(見(jiàn)圖4)。
實(shí)施例二重組人肌鈣蛋白TnI對(duì)體外人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用。
將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUV-EC以1×104cell/well的密度培養(yǎng)于96孔平板，培養(yǎng)液為Hams F-12K含生長(zhǎng)因子bFGF(3ng/ml)。將不同濃度的本發(fā)明所生產(chǎn)的人肌鈣蛋白TnI加入細(xì)胞培養(yǎng)液共同培養(yǎng)三天，再加入1μci/每孔的3H-胸腺嘧啶，繼續(xù)培養(yǎng)6-12小時(shí)后，收集細(xì)胞，檢測(cè)3H-胸腺嘧啶在多個(gè)處理組細(xì)胞內(nèi)的摻入量，結(jié)果見(jiàn)圖5。如圖5A所示，重組人肌鈣蛋白TnI對(duì)HUV-EC細(xì)胞呈劑量依賴性抑制。其IC50值為5μg/ml，遠(yuǎn)低于文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)的12μg/ml的濃度(Microvacular Research，63∶41-49，2002)，說(shuō)明本發(fā)明所生產(chǎn)的人重組肌鈣蛋白TnI的生物活性還優(yōu)于文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)的結(jié)果。
測(cè)試結(jié)果還進(jìn)一步顯示，重組人肌鈣蛋白的TnI對(duì)人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制是特異的，它對(duì)其他細(xì)胞如人乳腺癌細(xì)胞如MCF-1僅在高濃度下(25μg/ml)呈極弱的抑制作用(見(jiàn)圖3B)。
根據(jù)已知人肌鈣蛋白TnI的cDNA序列，設(shè)計(jì)了人肌鈣蛋白I與6聚組氨酸的融合蛋白。
采用PCR法從人乳腺cDNA文庫(kù)中獲得肌鈣蛋白I的編碼序列，并在其C末斷導(dǎo)入6聚組氨酸的編碼序列，經(jīng)PCR擴(kuò)增，合成了編碼人肌鈣蛋白I與6聚組氨酸的融合基因片斷。
構(gòu)建了人TnI的原核表達(dá)載體pET3b-TnI，轉(zhuǎn)化含T7RNA聚合酶的大腸桿菌宿主細(xì)胞，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)可表達(dá)人TnI。
構(gòu)建的工程菌E.coli BL21(DE3)pLysS/pET3b-TnI，可高效地表達(dá)人TnI。該菌種現(xiàn)已保藏于武漢大學(xué)內(nèi)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，編號(hào)為CCTCCNo.M202027。
建立了人TnI簡(jiǎn)便的純化和復(fù)性工藝，純化和復(fù)性同時(shí)進(jìn)行，純化蛋白的SDS-PAGE圖譜灰度掃描顯示純度大于90％。
體外活性實(shí)驗(yàn)顯示人TnI具有明顯抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖活性；體內(nèi)活性實(shí)驗(yàn)顯示人TnI具有明顯抑制動(dòng)物腫瘤生長(zhǎng)活性。
表1重組TnI對(duì)動(dòng)物腫瘤的實(shí)驗(yàn)治療作用實(shí)驗(yàn)材料(1)動(dòng)物昆明小鼠、體重18-22g由重慶市中藥研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究室提供，合格證號(hào)醫(yī)動(dòng)字310103001(2)瘤株S180引自重慶醫(yī)科大學(xué)病生教研室。
(3)受試物TnI兩批，腹腔給藥組0.5mg/ml，皮下給藥組1mg/ml。純度≥90％表1結(jié)果一

表1結(jié)果二

序列表<110>重慶康爾威藥業(yè)股份有限公司<120>重組人快速骨骼肌型肌鈣蛋白I在大腸桿菌中的表達(dá)及其在抗腫瘤治療中的應(yīng)用<160>3<210>1<211>546<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<220><221>CDS<222>(1)…(546)<400>1atg gga gat gag gag aag cgg aac agg gcc atc acg gcc cgc agg cag 48Met Gly Asp Glu Glu Lys Arg Asn Arg Ala Ile Thr Ala Arg Arg Gln15 10 15cac ctg aag agc gtg atg ctg cag ata gcg gcc acg gag ctg gag aag 96His Leu Lys Ser Val Met Leu Gln Ile Ala Ala Thr Glu Leu Glu Lys20 25 30gag gag agc cgc cgt gag gca gag aag cag aac tac ctg gcg gag cac 144Glu Glu Ser Arg Arg Glu Ala Glu Lys Gln Asn Tyr Leu Ala Glu His35 40 45tgc ccg ccg ctg cat atc ccg ggc tcc atg tct gaa gtg cag gag ctc 192Cys Pro Pro Leu His Ile Pro Gly Ser Met Ser Glu Val Gln Glu Leu50 55 60tgc aaa cag ctg cac gcc aag atc gat gcg gct gaa gag gag aag tac 240Cys Lys Gln Leu His Ala Lys Ile Asp Ala Ala Glu Glu Glu Lys Tyr65 70 75 80gac atg gag gtg agg gtg cag aag acc agc aag gag ctg gag gac 288Asp Met Glu Val Arg Val Gln Lys Thr Ser Lys Glu Leu Glu Asp85 90 95atg aac cag aag cta ttt gat ctg cgg ggc aag ttc aag cgg ccc cca ctg 336Met Asn Gln Lys Leu Phe Asp Leu Arg Gly Lys Phe Lys Arg Pro Pro Leu100 105 110cgg agg gtg cgc atg tcg gcc gat gcc atg ctc aag gcc ctg ctg ggc 384Arg Arg Val Arg Met Ser Ala Asp Ala Met Leu Lys Ala Leu Leu Gly115 120 125tcg aag cac aag gtg tgc atg gac ctg agg gcc aac ctg aag cag gtc 432Ser Lys His Lys Val Cys Met Asp Leu Arg Ala Asn Leu Lys Gln Val130 135 140aag aag gag gac aca gag aag gag cgg gac ctg cga gac gtg ggt gac 480Lys Lys Glu Asp Thr Glu Lys Glu Arg Asp Leu Arg Asp Val Gly Asp145 150 155 160tgg agg aag aac atc gag gag aag tct ggc atg gag ggc cgg aag aag 528Trp Arg Lys Asn Ile Glu Glu Lys Ser Gly Met Glu Gly Arg Lys Lys165 170 175atg ttt gag tcc gag tcc 546Met Phe Glu Ser Glu Ser180<210>2<211>182<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>2Met Gly Asp Glu Glu Lys Arg Asn Arg Ala Ile Thr Ala Arg Arg Gln15 10 15His Leu Lys Ser Val Met Leu Gln Ile Ala Ala Thr Glu Leu Glu Lys20 25 30Glu Glu Ser Arg Arg Glu Ala Glu Lys Gln Asn Tyr Leu Ala Glu His35 40 45Cys Pro Pro Leu His Ile Pro Gly Ser Met Ser Glu Val Gln Glu Leu50 55 60Cys Lys Gln Leu His Ala Lys Ile Asp Ala Ala Glu Glu Glu Lys Tyr65 70 75 80Asp Met Glu Val Arg Val Gln Lys Thr Ser Lys Glu Leu Glu Asp85 90 95Met Asn Gln Lys Leu Phe Asp Leu Arg Gly Lys Phe Lys Arg Pro Pro Leu100 105 110Arg Arg Val Arg Met Ser Ala Asp Ala Met Leu Lys Ala Leu Leu Gly115 120 125Ser Lys His Lys Val Cys Met Asp Leu Arg Ala Asn Leu Lys Gln Val130 135 140Lys Lys Glu Asp Thr Glu Lys Glu Arg Asp Leu Arg Asp Val Gly Asp145 150 155 160Trp Arg Lys Asn Ile Glu Glu Lys Ser Gly Met Glu Gly Arg Lys Lys165 170 175Met Phe Glu Ser Glu Ser180<210>3<211>188<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>3Met Gly Asp Glu Glu Lys Arg Asn Arg Ala Ile Thr Ala Arg Arg Gln15 10 15His Leu Lys Ser Val Met Leu Gln Ile Ala Ala Thr Glu Leu Glu Lys20 25 30Glu Glu Ser Arg Arg Glu Ala Glu Lys Gln Asn Tyr Leu Ala Glu His35 40 45Cys Pro Pro Leu His Ile Pro Gly Ser Met Ser Glu Val Gln Glu Leu50 55 60Cys Lys Gln Leu His Ala Lys Ile Asp Ala Ala Glu Glu Glu Lys Tyr65 70 75 80Asp Met Glu Val Arg Val Gln Lys Thr Ser Lys Glu Leu Glu Asp85 90 95Met Asn Gln Lys Leu Phe Asp Leu Arg Gly Lys Phe Lys Arg Pro Pro Leu
100 105 110Arg Arg Val Arg Met Ser Ala Asp Ala Met Leu Lys Ala Leu Leu Gly115 120 125Ser Lys His Lys Val Cys Met Asp Leu Arg Ala Asn Leu Lys Gln Val130 135 140Lys Lys Glu Asp Thr Glu Lys Glu Arg Asp Leu Arg Asp Val Gly Asp145 150 155 160Trp Arg Lys Asn Ile Glu Glu Lys Ser Gly Met Glu Gly Arg Lys Lys165 170 175Met Phe Glu Ser Glu Ser His His His His His His180 18權(quán)利要求
1一種大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒，pET3b-TnI。
2.權(quán)利要求1的大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒，其特征是該質(zhì)粒含有人肌鈣蛋白I的編碼基因并且該基因與六個(gè)組氨酸編碼序列融合。
3.由權(quán)利要求2所述的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的能表達(dá)人肌鈣蛋白I的大腸桿菌株BL21(DE3)/pLysS/pET3b-TnI，其保藏編號(hào)為，CCTCC No.202027。
4.用權(quán)利要求3所述的大腸桿菌株BL21(DE3)/pLysS/pET3b-TnI生產(chǎn)人肌鈣蛋白I的方法，步驟為(1)菌種培養(yǎng)將單個(gè)新鮮菌落接種于LB/Ampicillin培養(yǎng)液中，37℃振搖，培養(yǎng)過(guò)夜。次日接種于較大體積培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)至OD600≈0.5-0.6。(2)IPTG誘導(dǎo)加入IPTG至最終濃度0.5mM，繼續(xù)振蕩保溫3小時(shí)。(3)表達(dá)產(chǎn)物純化，離心收集細(xì)胞，包涵體分離，蛋白質(zhì)變性。親和層析純化，柱中復(fù)性或透析復(fù)性。
5.按照權(quán)利要求4所述方法制備的人肌鈣蛋白I。
6.權(quán)利要求5的人肌鈣蛋白I在制備治療腫瘤藥物中的應(yīng)用。
7.含有權(quán)利要求5的人肌鈣蛋白I的藥物組合物。
8.權(quán)利要求7的藥物組合物是注射劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種人肌鈣蛋白I(TnI)的表達(dá)、純化以及應(yīng)用該蛋白作為抗血管生成藥物的方法。采用PCR方法，從人乳腺cDNA文庫(kù)中獲得人肌鈣蛋白I的編碼序列，構(gòu)建了含有該編碼序列的大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒，pET3b－TnI及其轉(zhuǎn)化的大腸桿菌工程菌株BL21(DE3)pLysS/pET3b－TnI，并利用此工程菌表達(dá)生產(chǎn)重組人肌鈣蛋白I。本系統(tǒng)具有表達(dá)水平高、易擴(kuò)大生產(chǎn)和成本低的特點(diǎn)。由本發(fā)明新生產(chǎn)的重組人肌鈣蛋白I經(jīng)體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均證明具有明顯的抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和抑制腫瘤生長(zhǎng)的生物活性，可作為一種抗血管生成藥物用于實(shí)體腫瘤等的治療。
文檔編號(hào)A61P35/00GK1412313SQ0212940
公開(kāi)日2003年4月23日 申請(qǐng)日期2002年8月21日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月21日
發(fā)明者周益群, 黎波 申請(qǐng)人:重慶康爾威藥業(yè)股份有限公司