提高l-半胱氨酸生產(chǎn)能力的屬于腸桿菌科的細(xì)菌的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種在硫酸鹽存在下提高k半脫氨酸生產(chǎn)能力的屬于腸桿菌科的細(xì) 菌、W及使用該細(xì)菌制造k半脫氨酸的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 半脫氨酸、脫氨酸類被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥品、化妝品、食品等多個領(lǐng)域。由于半脫氨 酸是主要由人類和動物的毛發(fā)較多含有的氨基酸，因此過去是通過水解運(yùn)些毛發(fā)來制造半 脫氨酸。然而從進(jìn)一步提高產(chǎn)品的安全性W及減少對環(huán)境影響的觀點(diǎn)出發(fā)，人們期待與其 他很多氨基酸相同的發(fā)酵法進(jìn)行制造。
[0003] 目前已報告了多種通過使用屬于腸桿菌科的細(xì)菌的發(fā)酵法制造半脫氨酸的方法 (專利文獻(xiàn)1和2)。對于屬于腸桿菌科的細(xì)菌，如大腸桿菌，作為生物合成半脫氨酸的途徑 存在兩種途徑，即硫酸鹽作為硫源使用的途徑（硫酸途徑）和硫代硫酸鹽作為硫源使用的 途徑（硫代硫酸途徑）（非專利文獻(xiàn)1)。
[0004] 已知使用屬于腸桿菌科的細(xì)菌制造半脫氨酸時，一般作為硫源使用僅包含硫酸鹽 的培養(yǎng)基也不能有效制造半脫氨酸，但是作為硫源使用硫酸鹽的基礎(chǔ)上還包含硫代硫酸鹽 的培養(yǎng)基，則更有效制造半脫氨酸。 陽〇化]然而作為硫源使用的硫代硫酸鹽，相比于硫酸鹽非常昂貴。因此人們尋求研發(fā)出 作為硫源使用廉價的硫酸鹽且有效制造半脫氨酸的方法。
[0006] 現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0007] 專利文獻(xiàn)
[0008] 專利文獻(xiàn) 1 :W02009/104731
[0009] 專利文獻(xiàn)2 :特開2010-193788號公報
[0010] 非專利文獻(xiàn)
[0011] 非專利文獻(xiàn) 1:Nakatanietal. ,(Enhancementofthioredoxin/ glutaredoxin-mediatedL-cysteinesynthesisfromS-sulfocysteineincreases L-cysteineproductioninEscherichiacolo',MicrobialCellFactories, 2012, 11:62

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 本發(fā)明的目的在于提供一種在硫酸鹽存在下提高k半脫氨酸生產(chǎn)能力的屬于腸 桿菌科的細(xì)菌、W及使用該細(xì)菌廉價且有效地制造k半脫氨酸的方法。
[0013] 本發(fā)明人經(jīng)過深入研究發(fā)現(xiàn)，0-乙酷絲氨酸硫化氨解酶B缺乏且硫代硫酸結(jié)合蛋 白質(zhì)的C末端區(qū)域缺失的大腸桿菌突變株在僅含硫酸鹽作為硫源的培養(yǎng)基中也發(fā)揮很高 的k半脫氨酸生產(chǎn)能力。基于運(yùn)些認(rèn)識進(jìn)一步研究后完成了本發(fā)明。
[0014] 目P，本發(fā)明包含W下方面。
[0015] 項(xiàng)1、一種屬于腸桿菌科的細(xì)菌，所述屬于腸桿菌科的細(xì)菌被改造W降低0-乙酷 絲氨酸硫化氨解酶B的活性，其特征在于，
[0016] 所述屬于腸桿菌科的細(xì)菌被改造，w使硫代硫酸結(jié)合蛋白質(zhì)的C末端區(qū)域缺失， 且在硫酸鹽存在下提高k半脫氨酸生產(chǎn)能力。
[0017] 項(xiàng)2、根據(jù)項(xiàng)1所述的細(xì)菌，其特征在于，所述硫代硫酸結(jié)合蛋白質(zhì)是下述（a)或 化）中記載的蛋白質(zhì)： 陽01引 （a)由序列號1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；或者
[0019] 化）由與序列號1所示的氨基酸序列具有85%W上同一性的氨基酸序列組成，且 具有硫代硫酸結(jié)合活性的蛋白質(zhì)。
[0020] 項(xiàng)3、根據(jù)項(xiàng)2所述的細(xì)菌，其特征在于，所述C末端區(qū)域是下述（C)或（d)中記載 的區(qū)域：
[0021] (C)包含由序列號1所示的氨基酸序列中第274~300位的氨基酸組成的區(qū)域的 區(qū)域；或者
[0022] (d)在與序列號1所示的氨基酸序列具有85%W上同一性的氨基酸序列中，與包 含由序列號1所示的氨基酸序列中第274~300位的氨基酸組成的區(qū)域的區(qū)域相對應(yīng)的區(qū) 域。
[002引項(xiàng)4、根據(jù)項(xiàng)1~3中任一項(xiàng)所述的細(xì)菌，其特征在于，所述0-乙酷絲氨酸硫化氨 解酶B是下述（e)或（f)中記載的蛋白質(zhì)：
[0024] (e)由序列號3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；或者
[00巧](f)由與序列號3所示的氨基酸序列具有85%W上同一性的氨基酸序列組成，且 具有0-乙酷絲氨酸硫化氨解酶B活性的蛋白質(zhì)。
[0026] 項(xiàng)5、根據(jù)項(xiàng)1~4中任一項(xiàng)所述的細(xì)菌，其特征在于，對所述0-乙酷絲氨酸硫化 氨解酶B編碼的基因被破壞。
[0027] 項(xiàng)6、根據(jù)項(xiàng)1~5中任一項(xiàng)所述的細(xì)菌，其特征在于，所述屬于腸桿菌科的細(xì)菌是 埃希氏菌屬細(xì)菌。
[0028] 項(xiàng)7、一種k半脫氨酸的制造方法，其特征在于，從培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求1~6 中任一項(xiàng)所述的細(xì)菌所得的培養(yǎng)物中采集k半脫氨酸。
[0029] 項(xiàng)8、根據(jù)項(xiàng)7所述的制造方法，所述培養(yǎng)基包含硫酸鹽作為硫源。
[0030] 項(xiàng)9、根據(jù)項(xiàng)8所述的制造方法，所述培養(yǎng)基還包含硫代硫酸鹽作為硫源。
[00川發(fā)明效果
[0032] 根據(jù)本發(fā)明，能夠提供一種在硫酸鹽存在下提高k半脫氨酸生產(chǎn)能力的屬于腸 桿菌科的細(xì)菌。通過使用該細(xì)菌，即使是僅含硫酸鹽作為硫源的培養(yǎng)基，也能很有效地制 造k半脫氨酸。由于硫酸鹽相比硫代硫酸鹽非常廉價，因此該制造方法在成本方面優(yōu)異。 此外，在作為硫源除硫酸鹽外還包含硫代硫酸鹽的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，從而能夠更高效地制造 k半脫氨酸。由于本發(fā)明的制造方法使用微生物發(fā)酵，因此從所得產(chǎn)品的安全性或環(huán)境影 響的觀點(diǎn)出發(fā)，也是優(yōu)異的方法。
【附圖說明】
[0033] 圖1是表示半脫氨酸的生物合成途徑的示意圖；
[0034] 圖2表示由硫代硫酸鹽阻礙（硫代硫酸阻遏）W硫酸途徑進(jìn)行的半脫氨酸生物合 成；
[0035] 圖3表示不發(fā)生硫代硫酸阻遏的突變株（抑制基因突變株）的增殖曲線；
[0036] 圖4表示僅含硫酸鹽作為硫源的培養(yǎng)基中的抑制基因突變株的半脫氨酸生產(chǎn)能 力；
[0037] 圖5表示除硫酸鹽外還包含硫代硫酸鹽作為硫源的培養(yǎng)基中的抑制基因突變株 的半脫氨酸生產(chǎn)能力。 具體實(shí)施例
[0038] 1、細(xì)蔭
[0039] 本發(fā)明設(shè)及一種屬于腸桿菌科的細(xì)菌，為被改造W降低0-乙酷絲氨酸硫化氨解 酶B活性的屬于腸桿菌科的細(xì)菌，其特征在于，所述屬于腸桿菌科的細(xì)菌被改造W使硫代 硫酸結(jié)合蛋白質(zhì)的C末端區(qū)域缺失，且在硫酸鹽存在下提高k半脫氨酸生產(chǎn)能力。
[0040] 沒有特別限定屬于腸桿菌科的細(xì)菌，只要具有k半脫氨酸生產(chǎn)能力，可W是野生 株，也可W是改造株。在運(yùn)里，本發(fā)明中的k半脫氨酸生產(chǎn)能力是指在含有硫源的培養(yǎng)基 中培養(yǎng)時，在培養(yǎng)基中積累心半脫氨酸的能力。具體地，可列舉國家生物技術(shù)信息中屯、 (NCBI:化tionalCenterforBiotechnologyInformation)數(shù)據(jù)庫中記載的按分類屬于 腸桿菌科的埃希氏菌屬細(xì)菌、腸桿菌屬細(xì)菌、泛菌屬細(xì)菌、克雷伯氏菌屬細(xì)菌、沙雷氏菌屬 細(xì)菌，歐文氏菌屬細(xì)菌，沙口氏菌屬細(xì)菌，摩根氏菌屬細(xì)菌等、W及運(yùn)些細(xì)菌的改造株（或 突變株）化ttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/T曰xonomy/Browser/wwwt曰X.cgi?id= 91347)， 優(yōu)選可列舉埃希氏菌屬細(xì)菌及其改造株（或突變株）。
[0041] 沒有特別限定埃希氏菌屬細(xì)菌，具體可使用奈德哈特（Nei化ar化）等人的著作 (Backmann,B.J. 1996.DerivationsandGenotypesofsomemutantderivativesof EscherichiacoliK-12,p. 2460-2488.Table1.InF.D.Neidhardt(ed.),Escherichia coliandSalmonellaCellularandMolecularBiology/SecondEdition,American SocietyforMicrobiologyPress,Washington,D.C.)中列舉的埃希氏菌屬細(xì)菌。其中， 列舉有大腸桿菌。大腸桿菌具體可列舉來自原形野生株K12株的大腸桿菌W3110(ATCC 27325)、大腸桿菌MG1655(ATCC47076)等。
[0042] 屬于腸桿菌科的細(xì)菌的改造株中，優(yōu)選進(jìn)行改造W增強(qiáng)k半脫氨酸生產(chǎn)能力?？?根據(jù)公知的方法進(jìn)行運(yùn)種改造。
[0043] 對于細(xì)菌增強(qiáng)k半脫氨酸生產(chǎn)能力時，可應(yīng)用現(xiàn)有的育種棒狀桿菌細(xì)菌或埃希 氏菌屬細(xì)菌等時采用的方法，例如，獲取營養(yǎng)缺陷型突變株、類似物抗性株、代謝調(diào)控突變 株、或創(chuàng)制k半脫氨酸的生物合成基酶的表達(dá)增強(qiáng)的重組菌株等（參照氨基酸發(fā)酵，學(xué)會 出版中屯、有限公司，1986年5月30日初版發(fā)行，第77~100頁）。在運(yùn)里，在k半脫氨酸 生產(chǎn)菌的育種中所提供的營養(yǎng)缺陷型、類似物抗性、代謝調(diào)控突變等性質(zhì)可W是一種，也可 W是兩種或S種W上。此外，表達(dá)增強(qiáng)的k半脫氨酸生物合成基酶也可W是一種，還可W 是兩種或=種W上。進(jìn)一步地，還可W將提供營養(yǎng)缺陷型、類似物抗性、代謝調(diào)控突變等性 質(zhì)與生物合成基酶增強(qiáng)組合。
[0044] 對于獲取具有k半脫氨酸生產(chǎn)能力的營養(yǎng)