一種生產(chǎn)3-羥基丙酸的重組大腸桿菌及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種3-羥基丙酸的制備方法，特別涉及一種生產(chǎn)3-羥基丙酸的重組大 腸桿菌及其制備方法和應(yīng)用。 (二)
【背景技術(shù)】
[0002] 由于煤炭石油等不可再生資源日益減少，潛力巨大的燃油生物煉制技術(shù)受到越來(lái) 越多的關(guān)注，其中，生物柴油產(chǎn)業(yè)更是在近幾年內(nèi)迅速發(fā)展。然而，每生產(chǎn)10噸生物柴油就 會(huì)產(chǎn)生1噸甘油。甘油的生產(chǎn)增長(zhǎng)迅速，致使甘油價(jià)格一路走低。充分利用來(lái)源豐富、價(jià)格低 廉的甘油，可以帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)效益和環(huán)境效益。
[0003] 3-羥基丙酸(3-HP，C3H603)與乳酸為同分異構(gòu)體，是一種重要的平臺(tái)化合物，它無(wú) 色、無(wú)味，可以與水、醇、醚等多種溶劑互溶。由于具有羥基和羧基兩個(gè)活性基團(tuán)，因而在化 學(xué)反應(yīng)中是多種化工原料的合成前體，也是構(gòu)成很多高分子的單體，例如3-HP能夠脫水生 成丙烯酸，氧化即成丙二酸，還原生成1，3_丙二醇，而這些都是重要的化工和日用品原料。 由于3-HP顯著的市場(chǎng)價(jià)值及工業(yè)應(yīng)用前景，2004年美國(guó)能源部報(bào)告將3-HP列為當(dāng)今世界上 12種最具有開(kāi)發(fā)潛力的化工產(chǎn)品之一。
[0004] 目前，3-羥基丙酸的生產(chǎn)方法是化學(xué)合成法，主要有水合丙烯酸法和β-丙烯氰轉(zhuǎn) 化法。但在碳末端引入功能團(tuán)有很大的難度，且其產(chǎn)品不易分離提純，生產(chǎn)成本較高，生產(chǎn) 過(guò)程存在不安全因素，而微生物發(fā)酵方法生產(chǎn)3-ΗΡ可以有效的避免這些不利因素。相比化 學(xué)合成法，生物合成具有操作簡(jiǎn)便、條件溫和、綠色環(huán)保的優(yōu)點(diǎn)，因而越來(lái)越多的科研工作 者將研究重點(diǎn)放在了生物合成途徑上。
[0005] 微生物產(chǎn)3-ΗΡ早在上世紀(jì)60年代就有報(bào)道，但是天然存在的菌株所需底物價(jià)格高 且3-ΗΡ產(chǎn)率都比較低，因此長(zhǎng)期處于實(shí)驗(yàn)室階段。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，大 量研究開(kāi)始集中于對(duì)天然菌株進(jìn)行途徑改造，利用重組菌以甘油或葡萄糖等廉價(jià)碳源為底 物生產(chǎn)3-ΗΡ?；蚬こ叹臉?gòu)建按照底物的不同主要分為以葡萄糖為底物和以甘油底物兩 種。葡萄糖為底物的轉(zhuǎn)化路線(xiàn)以美國(guó)Cargill公司的研究最為成熟，該公司構(gòu)建了多條從葡 萄糖到3-HP的路徑，其中最具有代表性的過(guò)程為:葡萄糖經(jīng)酵解途徑到丙酮酸，丙酮酸還原 生成乳酸，乳酸在丙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶的作用下生成乳酰輔酶A，后者在乳酰輔酶A脫水酶作用 下生成丙酰輔酶A，進(jìn)而在3-羥基丙酰脫水酶的作用下，生成3-羥基丙酰輔酶A，最終生成3-HP〇
[0006] 以甘油為底物生成3-ΗΡ通常有兩步反應(yīng)組成:甘油先在甘油脫水酶及輔酶維生素 Β12的作用下脫水生成3-羥基丙醛(3-ΗΡΑ)，然后3-ΗΡΑ經(jīng)醛脫氫酶脫氫生成3-ΗΡ，在此過(guò)程 需要輔酶NAD+。同以葡萄糖為底物的路徑相比，甘油到3-ΗΡ生成途徑短，構(gòu)建和調(diào)控更加簡(jiǎn) 單有效。
[0007] 迄今為止，構(gòu)建基因工程菌制備3-ΗΡ的研究取得了一定的進(jìn)展，但是還存在諸多 問(wèn)題:⑴途徑改造本身需要繁瑣的分子生物學(xué)操作，后期培養(yǎng)往往還需要額外加入抗生素 和誘導(dǎo)劑等，增加操作難度，提高了生產(chǎn)成本;⑵以大腸桿菌為宿主，3-ΗΡ產(chǎn)量相對(duì)較高，但 其自身不具有甘油脫水酶酶活，構(gòu)建過(guò)程復(fù)雜，并且大腸桿菌自身不能生成甘油脫水酶的 輔酶維生素 B12，需要在發(fā)酵體系中額外加入，因其價(jià)格昂貴，從而使發(fā)酵成本大增;⑶代謝 過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生各種副產(chǎn)物，分離純化困難;⑷重組菌中甘油脫水酶和醛脫氫酶的活性平衡 問(wèn)題也影響了 3-HP產(chǎn)量的提高；(5)生成3-HP的過(guò)程中，醛脫氫酶的輔因子不能及時(shí)生成也 是制約3-HP產(chǎn)量的重要原因。 (三)
【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明目的是針對(duì)現(xiàn)有問(wèn)題，提供了一株敲除菌，用于解除甘油進(jìn)出細(xì)胞的抑制， 同時(shí)再生醛脫氫酶的輔因子NAD+，從而提高3-HP產(chǎn)量。
[0009] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：
[0010] 本發(fā)明提供一種生產(chǎn)3-羥基丙酸的重組大腸桿菌，所述重組大腸桿菌是將甘油脫 水酶基因 dhaB123、甘油脫水酶再激活因子基因 gdrA(甘油脫水酶基因 dhaB123和甘油脫水 酶再激活因子基因 gdrA的核苷酸序列為SEQ ID NO. 1所示）、α-酮戊二酸半醛脫氫酶突變體 編碼基因 TUkgsadh(核苷酸序列為SEQ ID如.3所示）和甘油三磷酸脫氫酶編碼基因8?(11 (核苷酸序列為SEQ ID N0.4所示）導(dǎo)入宿主菌中構(gòu)建而成;所述宿主菌為敲除甘油抑制因 子基因 glpR(Gene ID:947926)的大腸桿菌（即E.coli W3110_A glpR)，所述α-酮戊二酸半 醛脫氫酶突變體是將α-酮戊二酸半醛脫氫酶(編碼基因 kgsadh核苷酸序列為SEQ ID NO. 2 所示)的120位谷氨酸突變?yōu)樘於彼幔?19位脯氨酸突變?yōu)楸彼岖@得的。
[0011] 進(jìn)一步，所述甘油脫水酶基因 dhaB123和甘油脫水酶再激活因子基因 gdrA通過(guò)重 組質(zhì)粒pACYCDuet-tac-dhaBl 23-gdrA導(dǎo)入宿主菌中。
[0012] 進(jìn)一步，所述α-酮戊二酸半醛脫氫酶突變體基因 TUkgsadh通過(guò)重組質(zhì)粒 pCDFDuet-tac-gpdl-TUkgsadh 導(dǎo)入宿主菌中。
[0013] 進(jìn)一步，所述甘油三磷酸脫氫酶編碼基因 gpdl通過(guò)重組質(zhì)粒pCDFDuet-tac-gpdl- TUkgsadh導(dǎo)入宿主菌中。
[0014] 進(jìn)一步，所述大腸桿菌為E.coli W3110。
[0015] 本發(fā)明還提供一種所述生產(chǎn)3-羥基丙酸的重組大腸桿菌在合成3-羥基丙酸中的 應(yīng)用，具體所述的應(yīng)用：將重組大腸桿菌接種至含50mg/L氯霉素和50mg/L硫酸鏈霉素的發(fā) 酵培養(yǎng)基中（以甘油為底物），在37°C、150rpm條件下振蕩培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.4~0.8時(shí)，向發(fā) 酵液中加入終濃度0.01~0.5mM的IPTG，同時(shí)加入終濃度5g/L的VB 12，在28 °C、150rpm條件下 誘導(dǎo)發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束，獲得含3-羥基丙酸的發(fā)酵液;所述發(fā)酵培養(yǎng)基濃度組成為:甘油10-30g/L(優(yōu)選30g/L)，NaCl lg/L，MgS〇4.7H20 0.25g/L，Na2HP〇4.12H20 22.7g/L，KH2P〇43g/ L，酵母膏4g/L，（NH4)2S〇43.2g/L，溶劑為去離子水，pH值為7.00。
[0016] 進(jìn)一步，優(yōu)選所述IPTG終濃度為0.0 lmM。
[0017] 進(jìn)一步，所述重組大腸桿菌在發(fā)酵培養(yǎng)前先進(jìn)行斜面活化和種子培養(yǎng)，所述斜面 活化為:將重組大腸桿菌接種至含50mg/L氯霉素和50mg/L硫酸鏈霉素的LB固體培養(yǎng)基，在 37°C培養(yǎng)16h，獲得活化后的重組大腸桿菌;所述種子培養(yǎng)為:將活化后的重組大腸桿菌接 種至含50mg/L氯霉素和50mg/L硫酸鏈霉素的LB液體培養(yǎng)基，在37°C培養(yǎng)10h，獲得種子液。 所述種子液按體積濃度6 %的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基。
[0018] 本發(fā)明所述甘油脫水酶基因 dhaB123及甘油脫水酶再激活因子基因 gdrA來(lái)自克雷 伯氏菌Klebsiella pneumoniae DSM 2026。本發(fā)明所使用的α-酮戊二酸半醛脫氫酶 (KGSADH)來(lái)自巴西固氮螺菌A.brasilense。本發(fā)明所使用的甘油三磷酸脫氫酶基因 gpdl來(lái) 自釀酒酵母S. cerevisiae。
[0019] 本發(fā)明不僅克隆了來(lái)自K.penumoniae DSM 2026的甘油脫水酶基因 dhaB123及甘 油脫水酶激活因子基因 gdrA構(gòu)建重組質(zhì)粒pACY⑶uet-tac_dhaB123-gdrA，而且還克隆了 A.brasilense的α-酮戊二酸半醛脫氫酶基因 kgsadh篩選突變體編碼基因 TUkgsadh與來(lái)自 釀酒酵母的甘油三磷酸脫氫酶編碼基因 gpdl構(gòu)建了重組質(zhì)粒pCDFDuet-tac-gpdl-TUkgsadh。
[0020] 本發(fā)明所述宿主E.coli W3110,是敲除了控制甘油進(jìn)出細(xì)胞的甘油抑制因子 GlpR，達(dá)到加大甘油輸入細(xì)胞的量，從而加大甘油的代謝，從而提高目的產(chǎn)物3-羥基丙酸的 產(chǎn)量。本發(fā)明通過(guò)將重組質(zhì)?？?0￥0〇1161：-七&(3-(111&13123-8(1^和口00?〇1161：-七&(3-8口(11-TUkgsadh導(dǎo)入到E · coli W3110_ Δ glpR中實(shí)現(xiàn)3-HP的生產(chǎn)。
[0021] 本發(fā)明所述缺失基因的方法采取Red系統(tǒng)同源重組，在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范 圍之內(nèi)。所述重組載體導(dǎo)入重組宿主菌的方法采用化學(xué)轉(zhuǎn)化法。
[0022]本發(fā)明以大腸桿菌E.coli W3110_AglpR為宿主菌，在合成產(chǎn)物時(shí)需要添加適量 的維生素也2;敲除了宿主菌中抑制甘油代謝的相關(guān)基因，提高了甘油進(jìn)入細(xì)胞的效率。
[0023] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明有益效果主要體現(xiàn)在:通過(guò)利用基因敲除技術(shù)解除甘油 進(jìn)出細(xì)胞的抑制，同時(shí)再生醛脫氫酶的輔因子NAD+，從而提高3-HP產(chǎn)量，提高了 12倍。 (四）【附圖說(shuō)明】
[0024] 圖1.利用甘油合成3-羥基丙酸的代謝途徑示意圖；
[0025] 圖2 ·重組質(zhì)粒 pACYCDuet-tac_dhaB123-gdrA 構(gòu)建不意圖；
[0026] 圖3 ·重組質(zhì)粒pCDFDuet-tac-TUkgsadh構(gòu)建不意圖；
[0027] 圖4.重組質(zhì)粒 pCDFDuet-tac-gpdl-TUkgsadh 構(gòu)建不意圖；
[0028] 圖5.甘油在大腸桿菌中的代謝途徑；
[0029]圖6. IPTG誘導(dǎo)濃度對(duì)重組大腸桿菌中蛋白表達(dá)量的影響示意圖；（Maker表示標(biāo)準(zhǔn) 蛋白分子量，泳道 1 的菌株為E.coli W3110_A glpR(pACYCDuet-tac_dhaB123-gdrA/ pCDFDuet-tac-gpdl-TUkgsadh)，0 · 5mM IPTG誘導(dǎo)；泳道2 ~5為菌株E.coli W3110 (pACYCDuet-tac-dhaB123-gdrA/pCDFDuet-tac_TUkgsadh)，IPTG誘導(dǎo)濃度依次為0、 0·01mM、0 · 25mM及0 · 5mM，泳道6~9為菌株E. coli W3110_Δ glpR(pACYCDuet-tac-dhaB123-gdrA/pCDFDuet-tac-gpdl-TUkgsadh)，IPTG誘導(dǎo)濃度依次為0、0 · 01mM、0 · 25mM及0 · 5mM，箭 頭指示目的蛋白。）
[0030]圖7.重組大腸桿菌發(fā)酵合成3-羥基丙酸的高效液相色譜圖；（A~D為標(biāo)準(zhǔn)品，E、F 為E · coli W3110(pACYCDuet-tac-dhaB123-gdrA/pCDFDuet-tac_TUkgsadh)發(fā)酵產(chǎn)物的不 差檢測(cè)圖和紫外檢測(cè)圖，G、H為 E.coli W3110_A glpR(pACYCDuet-tac-dhaB123-gdrA/