一種提高大腸桿菌中可溶性重組蛋白質(zhì)表達(dá)水平的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及基因工程生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體涉及一種有效提高大腸桿菌中可溶性重組蛋白質(zhì)表達(dá)水平的工藝方法。
【背景技術(shù)】
[0002]大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)具有遺傳背景清晰、生長周期短、培養(yǎng)成本低、表達(dá)水平高及操作簡便等優(yōu)點，是目前基因工程生物技術(shù)領(lǐng)域最優(yōu)先考慮的的重組蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)。由于重組目的基因存在結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性和分配不穩(wěn)定性，使得重組大腸桿菌難以進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)。為了解決這一問題，人們把重組大腸桿菌的培養(yǎng)分為種子生長階段和誘導(dǎo)表達(dá)階段。種子生長階段用于菌種的增殖和重組基因的擴(kuò)增；誘導(dǎo)表達(dá)階段需要向種子生長階段獲得的培養(yǎng)物中加入誘導(dǎo)物，誘導(dǎo)重組基因的表達(dá)和重組蛋白質(zhì)的合成。大腸桿菌的最適生長溫度是37°C，重組大腸桿菌通常也用這一溫度進(jìn)行種子培養(yǎng)和誘導(dǎo)表達(dá)，或者為了提高重組蛋白質(zhì)的活性，也可以采用較低的生長溫度(方宏清.影響重組大腸桿菌培養(yǎng)的因素及其培養(yǎng)方式.生物工程進(jìn)展.1992.第12卷第6期.第21-24頁.)。此外，溫敏型調(diào)控的重組大腸桿菌則不需要添加誘導(dǎo)物，是一個例外。
[0003]但是，大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生的重組蛋白質(zhì)往往不能正確折疊，最終形成不溶性、無生物活性的包涵體。包涵體中蛋白質(zhì)必須經(jīng)過后期變復(fù)性操作來獲得可溶性，這一過程操作復(fù)雜且收率低，顯著增加了蛋白質(zhì)純化的成本。尋找簡便、易行、通用性強(qiáng)的提高重組蛋白質(zhì)可溶性表達(dá)的方法是目前大腸桿菌表達(dá)體系的一個難點和瓶頸環(huán)節(jié)。
[0004]目前科學(xué)家們主要嘗試以下策略來提高重組蛋白質(zhì)的可溶性:(I)采用低溫培養(yǎng)及優(yōu)化的培養(yǎng)基等條件；(2)共表達(dá)分子伴侶蛋白質(zhì)、二硫鍵異構(gòu)酶、脯氨酸異構(gòu)酶等蛋白質(zhì)；(3)將重組蛋白質(zhì)與溶解性很好的金黃色葡萄球菌蛋白A、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、大腸桿菌麥芽糖結(jié)合蛋白malE、大腸桿菌硫氧還蛋白等蛋白質(zhì)以融合蛋白質(zhì)的形式表達(dá)，借助這些融合伙伴蛋白使所需要的重組蛋白質(zhì)亦獲得可溶性的大量表達(dá)，從而避免包涵體產(chǎn)物的生成。其中，第(I)類策略需要經(jīng)較多嘗試以摸索適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基配方及工程菌培養(yǎng)條件；第
(2)類策略需要選定合適的分子伴侶蛋白，再利用基因工程技術(shù)構(gòu)建相應(yīng)表達(dá)載體，將表達(dá)載體導(dǎo)入工程菌，過程復(fù)雜，操作繁瑣；第(3)類策略在獲得重組融合蛋白質(zhì)后，必須再用價格昂貴的蛋白酶加工后才能獲得所需的目的蛋白質(zhì)，后期純化成本較高。(參考:一種高效原核表達(dá)載體(授權(quán)公告號:CN 1189565C);一種在大腸桿菌中生產(chǎn)可溶性重組蛋白質(zhì)的方法及其應(yīng)用(授權(quán)公告號:CN 100334216C);一種有效改善重組蛋白在大腸桿菌中可溶性表達(dá)的方法(申請公布號:CN 104561200 A)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種有效提高大腸桿菌中可溶性重組蛋白質(zhì)表達(dá)水平的工藝方法，具有簡便有效、成本低廉、易于規(guī)模放大的特點，有助于豐富和增強(qiáng)研究人員提高外源基因可溶性表達(dá)的的認(rèn)識與手段，適用于生物工程及基因工程中用大腸桿菌表達(dá)各種可溶性重組蛋白質(zhì)。
[0006]為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施:
(1)將表達(dá)重組蛋白的工程菌凍存液接種到表達(dá)用LB液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)過夜獲得種子液；
(2)隨后將種子液按接種到表達(dá)用LB液體培養(yǎng)基中，37°C繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，然后將培養(yǎng)溫度升高至40°C繼續(xù)培養(yǎng)；
(3)待培養(yǎng)液0D_達(dá)預(yù)設(shè)誘導(dǎo)起點后，向培養(yǎng)液中添加誘導(dǎo)物，繼續(xù)培養(yǎng)，菌體內(nèi)可以產(chǎn)生顯著的可溶性重組蛋白質(zhì)。
[0007]其中，步驟(I)中所述接種凍存液的比例為0.1% ；
其中，步驟(2)中所述接種種子液的比例為1% ;所述37°C振蕩培養(yǎng)至培養(yǎng)液0D_達(dá)到預(yù)設(shè)誘導(dǎo)起點的75%?90% ;所述40°C培養(yǎng)0.5?1.5hr ；
其中，步驟(3)中所述添加誘導(dǎo)物后繼續(xù)培養(yǎng)條件為以37°C或者40°C振蕩培養(yǎng)6hr。
[0008]本發(fā)明具有以下優(yōu)點:
(O本發(fā)明使用現(xiàn)有培養(yǎng)及發(fā)酵設(shè)備，無需增添新復(fù)雜設(shè)備；所用工藝操作非常簡單易行，易于放大規(guī)模生產(chǎn)；采用本發(fā)明所述工藝，基于利用大腸桿菌自身的熱激蛋白促進(jìn)重組蛋白質(zhì)的折疊，提高重組蛋白質(zhì)的可溶性，這一機(jī)理對于各種在大腸桿菌中表達(dá)的重組蛋白質(zhì)均是適用的。
[0009](2)本發(fā)明以溫和熱休克誘導(dǎo)大腸桿菌工程菌表達(dá)自身具有的熱激蛋白，以熱激蛋白為伴侶分子增強(qiáng)重組蛋白質(zhì)可溶性表達(dá)，無需以基因工程等手段構(gòu)建分子伴侶蛋白質(zhì)載體或融合表達(dá)載體，無需采用后續(xù)轉(zhuǎn)化及共表達(dá)等繁瑣手段。
[0010](3)本發(fā)明采用加入誘導(dǎo)物之前對大腸桿菌工程菌進(jìn)行溫和熱休克，激發(fā)大腸桿菌工程菌適度表達(dá)自身的熱激蛋白，有利于重組蛋白質(zhì)的折疊，從而穩(wěn)定后續(xù)誘導(dǎo)中產(chǎn)生的重組蛋白質(zhì)，改善重組蛋白質(zhì)在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)。這是一種通用性較強(qiáng)的提高可溶性重組蛋白質(zhì)表達(dá)量的新工藝，而且無需【背景技術(shù)】中所述的復(fù)雜嘗試及繁瑣操作。
【附圖說明】
[0011]圖1為一種有效提高大腸桿菌中可溶性重組蛋白質(zhì)表達(dá)水平的工藝方法流程示意圖。
[0012]圖2為十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測可溶性重組PK2 β所得結(jié)果。其中，泳道1:蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；泳道2:樣品組工程菌；泳道3:對照組工程菌I ;泳道4:對照組工程菌2 ;泳道5:對照重組ΡΚ2 β。
[0013]圖3為十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測可溶性重組ΡΚ2 β所得結(jié)果。其中，泳道1:對照重組ΡΚ2 β ;泳道2:對照組工程菌I ;泳道3:樣品組工程菌；泳道4:蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；泳道5:對照組工程菌2。
【具體實施方式】
[0014]以下結(jié)合實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的描述:
實施例1:
所用演示菌株A cWi BL21 (DE3)pET-PK2i3 (聞崇煒等.響應(yīng)面分析法優(yōu)化重組原動蛋白2β誘導(dǎo)條件的研究.生物技術(shù)通報.2012.第173-178頁)工程菌為自主構(gòu)建。所用LB液體培養(yǎng)基為每升含有蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化鈉10g。配制好的LB培養(yǎng)基在高壓滅菌鍋內(nèi)以121°C滅菌20min。向滅菌好的LB培養(yǎng)基中再加入卡那霉素至終濃度為50 μ g/mL即得實施例所用的表達(dá)用新鮮LB培養(yǎng)基。同時以乳糖為誘導(dǎo)物，實施例中加乳糖至終濃度為 lg/L。EDTA 碎菌液含有 0.05 mol.L 1 Tris.HCl pH 8.0,0.10 mol.L1NaCl，0.025 mol.L 1 EDTA ;高滲液為0.02 mol.L 1 Tris*HCl,0.025 mol.L 1 EDTA，pH 8.0，35% (w/v)蔗糖，低滲液為 0.02 mol.L1 Tris.HCl，0.025 mol.L1 EDTA，pH 8.0。
[0015]樣品組工程菌培養(yǎng)過程如下:(I)將_70°C凍存的E.coli BL21 (DE3) ρΕΤ_ΡΚ2 β工程菌在無菌環(huán)境下按照0.1% (ν/ν)的比例接種到3mL表達(dá)用新鮮LB培養(yǎng)基中，37°C，250rpm培養(yǎng)過夜獲得種子液；(2)在無菌環(huán)境下，按照1% (ν/ν)的比例將種子液加入250mL表達(dá)用新鮮LB培養(yǎng)基中，于37°C，250rpm繼續(xù)培養(yǎng)。當(dāng)培養(yǎng)液的0D_達(dá)到1.05時，將培養(yǎng)溫度升高至40°C，250rpm繼續(xù)培養(yǎng)1.5hr，此時培養(yǎng)液的0D_達(dá)到預(yù)設(shè)的1.40，然后加入誘導(dǎo)物，繼續(xù)以37°C，250rpm繼續(xù)培養(yǎng)4.5hr后結(jié)束誘導(dǎo)，將培養(yǎng)液以10000 rpm離心5min，棄上清，菌體保存于_20°C備用。
[0016]對照組工程菌I培養(yǎng)過程如下:(I)將_70°C凍存的E.coli BL21(DE3)pET_PK2 β工程菌在無菌環(huán)境下按照0.1%(ν/ν)的比例接種到3mL表達(dá)用新鮮LB培養(yǎng)基中，于37°C，250rpm培養(yǎng)過夜獲得種子液；(2)在無菌環(huán)境下，按照1% (ν/ν)的比例將種子液加入250mL表達(dá)用新鮮LB培養(yǎng)基中，于37°C，250rpm繼續(xù)培養(yǎng)，至培養(yǎng)液的0D_達(dá)到1.40，然后加入誘導(dǎo)物，然后以37°C，250rpm繼續(xù)培養(yǎng)4.5hr后結(jié)束誘導(dǎo)，將培養(yǎng)液以1000rpm離心5min，棄上清，菌體保存于_20°C備用。
[0017]對照組工程菌2培養(yǎng)過程如下:(I)將_70°C凍存的E.coli BL21(DE3)pET_PK2 β工程菌在無菌環(huán)境下按照0.1%(ν/ν)的比例接種到3mL表達(dá)用新鮮LB培養(yǎng)基中，于37°C，250rpm培養(yǎng)過夜獲得種子液；(2)在無菌環(huán)境下，按照1% (ν/ν)的比例將種子液加入250mL表達(dá)用新鮮LB培養(yǎng)基中，于37°C，250rpm繼續(xù)培養(yǎng)，至培養(yǎng)液的0D_達(dá)到0.60，然后加入誘導(dǎo)物，然后以37°C，250rpm繼續(xù)培養(yǎng)6hr后結(jié)束誘導(dǎo)，將培養(yǎng)液以1000rpm離心5min，棄上清，菌體保存于_20°C備用。
[0018]重組蛋白質(zhì)表達(dá)分析過程如下:(1)稱取12mg工程菌及對照菌體，分別加ImLEDTA破菌緩沖液重懸，隨后顛倒混勻過夜，8000rpm離心5min離心，棄上清，收集菌體；(2)菌體中加入ImL高滲液重懸2