專利名稱：一種大腸桿菌高效表達重組人源超氧化物歧化酶的方法
技術領域：
本發(fā)明提供了一種大腸桿菌高效表達重組人源超氧化物歧化酶的方法，屬于發(fā)酵工程技術領域。
背景技術：
超氧化物歧化酶(SOD)是具有專一清除生物體內(nèi)的超氧離子，平衡機體的氧自由基，保護人體細胞免受有毒化學物質(zhì)、幅射、紫外等環(huán)境因素破壞，SOD酶在抗衰老，抗輻射性，消炎，抑制腫瘤和癌癥，以及自身免疫疾病的治療方面有重要的作用；目前SOD酶已作為一種保健醫(yī)藥產(chǎn)品廣泛應用于食品飲料、化妝品等行業(yè)，具有非常廣闊的市場。目前國內(nèi)的SOD大多是從動物血液中提取的，由于含有各種難以消除的病毒及外源污染，歐盟已于 1999年頒布法令，禁止從動物血液中提取的SOD用于人類；而從植物中提取SOD的方法往往受到原材料的制約，且成本較高；因此開發(fā)其他更安全、更經(jīng)濟的提取或合成方法取代傳統(tǒng)SOD生產(chǎn)方法將是一個趨勢。利用工程微生物制備SOD的工藝具有工藝簡單，生產(chǎn)成本低，對環(huán)境友好等特點，已成為SOD產(chǎn)業(yè)化的發(fā)展方向；目前日本、加拿大等國家也開始研究采用基因重組等新的生物工程技術來合成SOD ；國內(nèi)已有企業(yè)利用生物工程技術來生產(chǎn) S0D，但產(chǎn)量遠不能滿足日益增長的市場需求，隨著人們對超氧化物歧化酶(SOD)逐漸認識并應用，超氧化物歧化酶市場具備較好的機遇。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是為了提供了一種重組大腸桿菌高效表達人源重組超氧化物歧化酶的方法。本發(fā)明的技術方案是這樣實現(xiàn)的本發(fā)明為一種重組大腸桿菌高效表達人源重組超氧化物歧化酶的方法；利用大腸桿菌作為菌種，以酵母粉、蛋白胨、葡萄糖、KHP04、(NH4)2HP04、MgS04 ·7Η20、檸檬酸、檸檬酸鐵為原料，進行液體深層次發(fā)酵生產(chǎn)超氧化物歧化酶，發(fā)酵液經(jīng)管式離心機進行固液分離，得到菌體及發(fā)酵液上清液；所得到的菌體再經(jīng)過均質(zhì)機破碎，熱處理，離心收集上清液，超濾， 微濾和噴霧干燥得到粉狀超氧化物歧化酶產(chǎn)品；具體包括下述步驟1、菌種及種子液擴大培養(yǎng)1. 1本發(fā)明所用菌種為大腸桿菌BL21 (hS0D-pET-28a)重組菌株。1. 2將大腸桿菌試管斜面菌種在無菌條件下轉入已制備好的裝在3L三角瓶600mL 一級種子培養(yǎng)基中(pH 6.8 7.2;滅菌條件1211滅菌301^11) ；250rpm、37士 1 °C培養(yǎng) 12 14小時備用。1. 3用100L種子罐對菌種進行擴大培養(yǎng)將工業(yè)級的酵母粉480g，蛋白胨900g，IM磷酸緩沖液(pH = 6. 8) 6L，生物素2%ig， 葡萄糖600g分別投入100L種子罐內(nèi)，用自來水定容到60L ；攪拌均勻；然后用蒸汽直接滅菌，115度保溫30分鐘，再降溫至37度，接入按步驟1. 2所得的600mL —級種子菌液；在通氣量0. 6 1 ；溫度37 士 1°C;罐壓力0. 03 0. 05MPa的條件下培養(yǎng)他，得擴大培養(yǎng)的大腸桿菌二級種子液。2、用1000L發(fā)酵罐發(fā)酵生產(chǎn)超氧化物歧化酶將工業(yè)級的葡萄糖5kg、6. 65kg 的 KH2P04、2kg 的(NH4)2HP04、6kg 的 MgSO4 ·7Η20、檸檬酸1. ^g、檸檬酸鐵(111)0. 05kg分別投入1000L發(fā)酵罐內(nèi)，用自來水定容到500L，攪拌均勻；然后用蒸汽直接滅菌，115度保溫30分鐘，再降溫至37度，滅菌后由NH4OH調(diào)整 PH 到 7. 0，再添加 0. 8L 的微量元素液(2. 5mg/L 的 KIU. 5mg/L 的 MnCl2 · 4H20、1. 5mg/L 的 CuCl2 ·2Η20、3· Omg/L 的 H3BO3,2. 5mg/L 的 Na2MoO4 · 2H20U. 3mg/L 的 Zn (CH3COO) 2 ·2Η20 鹽酸硫銨4. 5mg/L) ； IOOg的CuS04*5H20、50g ZnSO4接入60L—級種子培養(yǎng)液；在風量1 0. 6 0. 8、溫度37士 1°C、罐壓力0. 03 0. 05MPa的條件下培養(yǎng)，一段時間以后補葡萄糖，到OD6tltl 達到40左右開始用IPTG誘導，誘導2小時后，向發(fā)酵罐中流加微量元素CuSO4 · 5H20和 ZnSO4,共誘導10小時，得到發(fā)酵液，利用管式離心機將發(fā)酵液進行固液分離，所得到的菌體再經(jīng)過均質(zhì)機破碎，熱處理，離心收集上清液，得到超氧化物歧化酶清液；所謂風量比是一立方米發(fā)酵液與每分鐘所需要的進氣量之比。3、將步驟2得到的超氧化物歧化酶清液采用0. 22 μ m的超濾膜和故的微濾膜對粗酶液進行過濾和濃縮；然后采用離心式噴霧干燥塔進行噴霧干燥；進口溫度130 1400C，出口 50 60°C，得到粉狀超氧化物歧化酶包埋產(chǎn)品。4、超氧化物歧化酶活性測定在一般情況下，SOD酶活性測定只能應用間接活性測定法；本實驗采用鄰苯三酚自氧化方法；鄰苯三酚在堿性條件下，能迅速自氧化，釋放出02_，生成帶色的中間產(chǎn)物，反應開始后反應液先變成黃棕色，幾分鐘后轉綠，幾小時后又轉變成黃色，這是因為生成的中間物不斷氧化的結果；這里測定的是鄰苯三酚自氧化過程中的初始階段，中間物的積累在滯留30 4 后，與時間成線性關系，一般線性時間維持在^iin的范圍內(nèi)，中間物在 325nm波長出有強烈光吸收；當有SOD存在時，由于它能催化02_與H+結合生成仏和H2O2， 從而阻止了中間產(chǎn)物的積累，因此，通過計算即可求出SOD的酶活性。酶活力單位定義在25°C恒溫條件下，每毫升反應液中，每分鐘抑制鄰苯酚自氧化率達50%的酶量定義為1個酶活力單位。具體操作如下測自氧化速率(1)取PH8. 2的SOD buffer 4. 5ml于石英比色杯325nm測光密度值，調(diào)零。(2)取 PH8. 2 的 SOD buffer4. 5ml 于 IOmL 印管中(25°C水浴保溫)，加入 45mmol/ L鄰苯三酚溶液IOul混勻后迅速于石英比色杯325nm波長測光密度值。(3)每隔30s測一次，若測anin，求出鄰苯三酚的自氧化率ODA，(ODA/min在 0. 06士0. 002最好)，因為這時得誤差較小，如果自氧化速率高則加濃Hcl，看情況而定，自氧化速率低加SOD buffer)測酶活(1)取調(diào)整好的SOD buffer 4. 5ml于IOml EP管中(于25°C水浴中保溫)，分別加入待測酶液IOul和45mmol/L鄰苯三酚溶液IOul，混勻后迅速于石英比色杯中，325nm波
長測光密度值。
(2)每隔30s測一次，共測2min，求出光密度值變化速率0DB。計算酶活力
權利要求
1.一種大腸桿菌高效表達重組人源超氧化物歧化酶的方法，利用大腸桿菌作為菌種， 以酵母粉、蛋白胨、葡萄糖、KH2PO4, (NH4)2HPO4, MgSO4 · 7H20、檸檬酸、檸檬酸鐵為原料，進行液體深層次發(fā)酵生產(chǎn)人源超氧化物歧化酶，其特征在于通過改進發(fā)酵方式及原料，實現(xiàn)了人源超氧化物歧化酶的高產(chǎn)率發(fā)酵，大大降低人源超氧化物歧化酶的生產(chǎn)成本，具有很好的社會經(jīng)濟效益。
2.根據(jù)權利要求1所述的，一種大腸桿菌高效表達重組人源超氧化物歧化酶的方法， 其特征在于將大腸桿菌試管斜面菌種在無菌條件下轉入已制備好的裝在3L三角瓶600mL 一級種子培養(yǎng)基中(pH6. 8 7. 2 ；滅菌條件121°C滅菌30min)，250rpm、37 士 1°C培養(yǎng)12 14小時備用。
3.根據(jù)權利要求1所述的，一種大腸桿菌高效表達重組人源超氧化物歧化酶的方法， 其種子培養(yǎng)液的特征在于將工業(yè)級的酵母粉480g，蛋白胨900g，IM磷酸緩沖液(pH = 6. 8)6L，生物素2%ig，葡萄糖600g分別投入100L種子罐內(nèi)，用自來水定容到60L ；攪拌均勻；然后用蒸汽直接滅菌，115度保溫30分鐘，再降溫至37°C，接入600mL —級種子菌液；在風量0.6 1，溫度37士 1°C，罐壓力0.03 0.05MPa的條件下培養(yǎng)6小時，得擴大培養(yǎng)的大腸桿菌二級種子液。
4.根據(jù)權利要求1所述的，一種大腸桿菌高效表達重組人源超氧化物歧化酶的方法，其特征在于將工業(yè)級的葡萄糖5kg、6. 65kg的KH2P04、2kg的(NH4) 2HP04、6kg的 MgS04 · 7H20、檸檬酸Ukg、檸檬酸鐵(111)0. 05kg分別投入1000L發(fā)酵罐內(nèi)，用自來水定容到500L，攪拌均勻；然后用蒸汽直接滅菌，115度保溫30分鐘，再降溫至37度，滅菌后由 28% NH4OH 調(diào)整 pH 到 7. 0，再添加 0. 8L 的微量元素液；IOOg 的 CuS04 · 5H20、50g 的 ZnSO4, 接入60L—級種子培養(yǎng)液；在風量1 0. 6 0. 8、溫度37士 1°C、罐壓力0.03 0. 05MPa 的條件下培養(yǎng)，一段時間以后補葡萄糖，到0D_達到40左右開始用IPTG誘導，誘導2小時后，向發(fā)酵罐中流加微量元素、CuSO4 ·5Η20和SiSO4,共誘導10小時，得到發(fā)酵液，利用管式離心機將發(fā)酵液進行固液分離，得到菌體和發(fā)酵液清液，經(jīng)超聲破碎后測得抗氧化歧化酶的酶活21723U/L。
5.根據(jù)權利要求4所述的一種大腸桿菌高效表達重組人源超氧化物歧化酶的方法， 其特征在于:2. 5mg/L 的微量元素為 KIU. 5mg/L 的 MnCl2 · 4H20、1. 5mg/L 的 CuCl2 · 2H20、 3. Omg/L 的 Η3Β03、2· 5mg/L 的 Na2MoO4 ·2Η20、1· 3mg/L 的 Si (CH3COO)2 ·2Η20、鹽酸硫銨 4. 5mg/ L0
全文摘要
本發(fā)明是一種大腸桿菌高效表達重組人源超氧化物歧化酶的方法，利用大腸桿菌作為菌種，以酵母粉、蛋白胨、葡萄糖、KH2PO4、(NH4)2HPO4、MgSO4·7H2O、檸檬酸、檸檬酸鐵為原料，進行液體深層次發(fā)酵生產(chǎn)人源超氧化物歧化酶，本發(fā)明的有益效果在于通過改進發(fā)酵方式，采用二級種子培養(yǎng)及噴霧干燥制得超氧化物歧化酶酶粉，簡化了發(fā)酵工藝，節(jié)省了設備和時間，實現(xiàn)了超氧化物歧化酶的高產(chǎn)率發(fā)酵，使本發(fā)明可以適用于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)，大大降低了超氧化物歧化酶的生產(chǎn)成本，具有很好的社會經(jīng)濟效益。
文檔編號C12N9/08GK102533687SQ20121004259
公開日2012年7月4日 申請日期2012年2月24日 優(yōu)先權日2012年2月24日
發(fā)明者劉欽松, 李小剛 申請人:山東博奧克生物科技有限公司