本發(fā)明屬于微生物合成生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種利用植物維生素c合成途徑構(gòu)建大腸桿菌菌株合成維生素c的方法。

背景技術(shù)：

維生素c（簡(jiǎn)寫vc），又名抗壞血酸，是一種水溶性維生素。人類、猿猴、天竺鼠和一些魚類、鳥類無(wú)法自行合成維生素c，需通過(guò)食物來(lái)供應(yīng)身體所需。vc是一種必需維生素，參與膠原蛋白的合成，可預(yù)防動(dòng)脈硬化；vc是一種強(qiáng)抗氧化劑，具有保護(hù)細(xì)胞、解毒和保護(hù)肝臟作用；vc還可用于增強(qiáng)肌體免疫力，預(yù)防感冒等急、慢性傳染病，還可用于病后恢復(fù)期、創(chuàng)傷愈合期及過(guò)敏性疾病的輔助治療，vc缺乏引起壞血病，造成牙齦萎縮、出血等等病癥。人類vc的主要食物來(lái)源：柑桔類水果、蔬菜等。食物中的vc能被人體小腸吸收，分布到體內(nèi)所有的水溶性結(jié)構(gòu)中，普通成人體內(nèi)vc代謝活性池中vc量1500mg左右。

維生素c主要應(yīng)用在制藥、保健品、軟飲料及飼料添加等領(lǐng)域，主要消費(fèi)市場(chǎng)在歐美等發(fā)達(dá)國(guó)家。目前，全球vc市場(chǎng)需求量約12萬(wàn)噸。我國(guó)是全球最大的c生產(chǎn)國(guó)和出口國(guó)，每年出口超過(guò)10億美元。但是，每當(dāng)人們提到vc產(chǎn)業(yè)，自然就會(huì)聯(lián)想到無(wú)情的價(jià)格戰(zhàn)，以羅氏(roche)為主的跨國(guó)公司試圖擠垮中國(guó)的vc企業(yè)，從1996年至2001年，出現(xiàn)兩次降價(jià)狂潮，使vc價(jià)格從12美元/kg降到2001年的2.8美元/kg，使我國(guó)20多家企業(yè)被迫停產(chǎn)。在幾輪競(jìng)爭(zhēng)中，由于中國(guó)企業(yè)首創(chuàng)“兩步發(fā)酵法”生產(chǎn)vc核心技術(shù)，在人力等成本上也有明顯競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)，保住了vc產(chǎn)業(yè)的一席之地，使國(guó)內(nèi)企業(yè)與roche(dsm)和basf形成了三足鼎立之勢(shì)。但是vc產(chǎn)業(yè)化技術(shù)的研發(fā)工作并沒(méi)有停息，如：eastman與genencor合作開發(fā)的生化觸媒法，即用多個(gè)酶進(jìn)行多步轉(zhuǎn)化，從玉米制造維生素c。其他國(guó)際大廠也都在不斷降低制造成本，如巴斯夫除了致力于將目前的制造工藝進(jìn)行優(yōu)化外，也在開發(fā)或引進(jìn)新的低成本制造工藝。目前，歐美廠商目前都在積極探索vc新的合成路徑。國(guó)內(nèi)在“二步發(fā)酵法”生產(chǎn)vc研究和應(yīng)用領(lǐng)域均處于世界領(lǐng)先水平，但新的途徑研究投入不足，在細(xì)菌“一步發(fā)酵法”合成vc研究領(lǐng)域已經(jīng)處于明顯劣勢(shì)。

在二步發(fā)酵法中，依次在d-山梨醇脫氫酶(sldh)、l-山梨糖脫氫酶(sdh)及l(fā)-山梨酮脫氫酶(sndh)的作用下，可以有效地將d-山梨醇轉(zhuǎn)化為維生素c的前體物質(zhì)2-klg（尹光琳等，微生物學(xué)報(bào)，1980，20(3)，246-251）。細(xì)菌山梨醇“一步發(fā)酵法”研發(fā)工作走在最前列的首推dsm，取得一系列領(lǐng)先成果，包括葡糖桿菌gluconobacteroxydansdsm17078全部kga代謝密切相關(guān)的基因(l-山梨酮脫氫酶基因、d-山梨醇脫氫酶基因，以及l(fā)-山梨糖脫氫酶基因a、b、c、d)的分離克隆（usptopatent，20110250636），及以上基因敲除或過(guò)表達(dá)對(duì)kga生物合成的影響；糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因sts24和sts01的敲除或過(guò)表達(dá)對(duì)kga生物合成的影響（unitedstatespatent5437989）；pqq生物合成基因?qū)ga合成的影響（yuan等bmcbiotechnology，2016,16，1-14）；以及其他基因(vcs01和vcs08等)對(duì)kga合成的影響（europeanpatentapplicationep1103603）。此外，還嘗試了多種技術(shù)手段對(duì)葡糖桿菌進(jìn)行基因改良，取得了理想的研究效果。申報(bào)相關(guān)國(guó)際發(fā)明專利30多項(xiàng)，專利覆蓋了50多個(gè)細(xì)菌相關(guān)基因以及10多個(gè)細(xì)菌種類的利用，包括大腸桿菌、假單胞菌、泛菌、谷氨酸棒桿菌、普通酮古龍酸菌、氧化葡萄糖酸桿菌、醋細(xì)菌和葡糖醋桿菌等。

大部分的植物和動(dòng)物都可以通過(guò)一系列的酶促反應(yīng)轉(zhuǎn)化d-葡萄糖合成維生素c。在真核生物中，維生素c可以通過(guò)兩個(gè)不同的生化途徑合成。在鼠類及其它的哺乳動(dòng)物中，葡萄糖通過(guò)一個(gè)復(fù)雜途徑轉(zhuǎn)化成l-古洛糖酸-1,4-內(nèi)酯。這一途徑是由終端酶l-古洛糖酸-1,4-內(nèi)酯氧化酶在動(dòng)物界中的普遍存在推斷而來(lái)的。而在人類及其它一些動(dòng)物中，編碼l-古洛糖酸-1,4-內(nèi)酯氧化酶的基因發(fā)生了突變，造成其合成維生素c能力的喪失。大多數(shù)的植物細(xì)胞中都有大量維生素c的合成，它在過(guò)氧化物、臭氧及自由基的解毒方面起著至關(guān)重要的作用。另外，維生素c在通過(guò)水溶性抗氧化劑(α-生育酚)、玉米黃質(zhì)和ph介導(dǎo)的psii活性的再生調(diào)節(jié)光合作用活性的過(guò)程中是必不可少的。植物細(xì)胞可以積累大量的維生素c，特別是在綠色組織和貯藏器官中。因?yàn)樵谥参锛?xì)胞中存在由d-半乳糖生成維生素c的完整合成途徑，目前研究人員已經(jīng)開始嘗試?yán)弥参锛?xì)胞或微藻培養(yǎng)物通過(guò)發(fā)酵生產(chǎn)維生素c。據(jù)報(bào)道，running等人分離得到的小球藻突變體產(chǎn)維生素c的產(chǎn)量從0.64mg/g干細(xì)胞提高到45mg/g細(xì)胞（journalofappliedphycology，1994,6(2)，99-104），但是這與工業(yè)上采用的經(jīng)典二步發(fā)酵法的高產(chǎn)量尚無(wú)競(jìng)爭(zhēng)性。進(jìn)一步提高利用植物細(xì)胞或藻類一步生產(chǎn)維生素c的產(chǎn)量需要進(jìn)行系統(tǒng)的代謝工程改造，然而植物中維生素c合成途徑的研究進(jìn)展非常緩慢使得代謝工程改造很難操作。

植物中初始的維生素c合成模型是根據(jù)動(dòng)物中的合成機(jī)理建立的。然而，植物細(xì)胞中是不含l-古洛糖酸-1,4-內(nèi)酯氧化酶的，多年來(lái)一直未得到植物中維生素c合成途徑的直接證據(jù)，直到后來(lái)利用擬南芥中影響維生素c生物合成突變體的鑒定，提出了經(jīng)過(guò)gdp-甘露糖和l-半乳糖的維生素c從頭合成途徑。在隨后的幾年間，研究者提出了植物細(xì)胞中還可能存在一些其它的維生素c合成途徑，但目前對(duì)這些新合成途徑的認(rèn)識(shí)比較有限。

植物細(xì)胞中維生素c從葡萄糖開始合成途徑涉及10個(gè)酶，擬南芥中這10個(gè)酶包括：athxk1、atpgi、atdin9、atpmm、atvtc1、atgme、atvtc2、atvtc4、atgaldh和atgldh（conklin，genetics，2000,154，847-856）。葡萄糖在己糖激酶hxk催化下轉(zhuǎn)化為葡萄糖-6-磷酸，再經(jīng)磷酸葡萄糖異構(gòu)酶pgi轉(zhuǎn)化為果糖-6-磷酸，磷酸甘露糖異構(gòu)酶（pmi或din9）將果糖-6-磷酸轉(zhuǎn)化為d-甘露糖-6-磷酸，在甘露糖變位酶（pmm）催化下轉(zhuǎn)化為d-甘露糖-1-磷酸，進(jìn)一步經(jīng)過(guò)gdp-甘露糖焦磷酸化酶（vtc1）催化形成gdp-d-甘露糖，再經(jīng)過(guò)gdp-甘露糖-3’5’異構(gòu)酶（gme）作用下合成gdp-l-半乳糖。gdp-l-半乳糖通過(guò)半乳糖途徑合成vc，其中需要gdp-l-半乳糖磷酸化酶（vtc2）將gdp-l-半乳糖轉(zhuǎn)化為l-甘露糖-1-磷酸，l-半乳糖-1-磷酸酯酶（vtc4）將l-甘露糖-1-磷酸轉(zhuǎn)化為l-半乳糖，l-半乳糖脫氫酶（galdh）將l-半乳糖轉(zhuǎn)化為l-半乳糖-1，4-內(nèi)酯，最后在l-半乳糖-1，4-內(nèi)酯脫氫酶（gldh）作用下合成維生素c。植物中維生素c合成途徑的發(fā)現(xiàn)使得實(shí)現(xiàn)由葡萄糖、淀粉或者纖維素直接發(fā)酵生產(chǎn)維生素c成為可能。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種利用大腸桿菌生產(chǎn)維生素c的方法，該方法通過(guò)將植物維生素c合成途徑中的11個(gè)基因轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，使大腸桿菌能夠直接利用葡萄糖為碳源，轉(zhuǎn)化為維生素c。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是。

一種利用植物的維生素c合成途徑創(chuàng)制一步發(fā)酵合成維生素c大腸桿菌菌株的方法：將植物的維生素c合成的基因構(gòu)建多基因單順?lè)醋咏M成的原核表達(dá)載體；將所述原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中。

優(yōu)選地，所述植物的維生素c合成的基因來(lái)源于草莓。

優(yōu)選地，所述植物的維生素c合成的基因通過(guò)多基因定點(diǎn)突變方法消除了基因中常用的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。這些位點(diǎn)包括ecori、sali、bamhi、kpni,xbai、saci和hindiii。

優(yōu)選地，多基因單順?lè)醋咏M成的原核表達(dá)載體由t7表達(dá)系統(tǒng)組成，11個(gè)改造的維生素c合成基因全部使用t7啟動(dòng)子和終止子控制，構(gòu)建基因表達(dá)元件。

所述維生素c合成的原核表達(dá)載體的構(gòu)建方法為：利用改良的“重疊延伸pcr技術(shù)”構(gòu)建維生素c合成所有11個(gè)基因的表達(dá)盒。在pcambia-1301載體的基礎(chǔ)上，通過(guò)在ecori和hindiii限制性內(nèi)切酶切點(diǎn)間插入的多克隆位點(diǎn)片段，可以構(gòu)成多基因表達(dá)單元，該載體的ecori和sali，sali和bamhi，bamhi和kpni,kpni和xbai,xbai和hindiii限制性內(nèi)切酶切點(diǎn)之間均可以插入基因表達(dá)盒，從而構(gòu)成多基因表達(dá)載體。

所述構(gòu)建的大腸桿菌表達(dá)載體pyb2130通過(guò)電擊法導(dǎo)入到大腸桿菌中。

優(yōu)選地，所述大腸桿菌包括bl21（de3）等所有含有t7rna聚合酶的菌株。

本發(fā)明的有益效果如下。

1，當(dāng)大腸桿菌獲得植物的維生素c合成基因后能夠合成維生素c。

2，通過(guò)本發(fā)明構(gòu)建的大腸桿菌菌株可以直接將葡萄糖轉(zhuǎn)化為維生素c。

3，該套體系操作簡(jiǎn)單，避免了使用兩步發(fā)酵過(guò)程的麻煩。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例中構(gòu)建的維生素c原核表達(dá)載體pyb2130。

圖2為本發(fā)明實(shí)施例中大腸桿菌發(fā)酵后檢測(cè)。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例中涉及的構(gòu)建維生素c合成原核表達(dá)載體pyb2130，其具體的構(gòu)建方法如下。

草莓果實(shí)總rna，cdna合成試劑盒為clontech公司產(chǎn)品；dna柱回收試劑盒購(gòu)置amersham公司；試劑rna抽提試劑盒rneasyplantminikit為qiagen公司產(chǎn)品；各種限制性內(nèi)切酶和t4dnaligase均購(gòu)自上海takara公司?？俽na采用qiagen公司的rneasyplantminikit提取。

取約50μl草莓草莓果實(shí)總rna進(jìn)行cdna合成，cdna的合成按clontech公司smartcdnalibraryconstructionkit說(shuō)明書操作進(jìn)行第一鏈合成。

1、構(gòu)建改造的草莓己糖磷酸激酶基因（fvhxk1）。

從草莓中克隆己糖磷酸激酶基因并利用定點(diǎn)突變方法將90位xhoi限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)；229位hindiii限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)；632位saci限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)；720位kpni限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)；935和1148位bgii限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)；1238位bamhi限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)；1342位ecori限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)消除。

以合成的cdna第一鏈為模板，擴(kuò)增引物：hxk1:atggggaaggtggcggtgggt（seqidno.1所示），hxk2:ttaggagtcctcgacaccaag（seqidno.2所示）。pcr反應(yīng)條件：98℃預(yù)變性3min；94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸90s，30個(gè)循環(huán)；72℃保溫10min。pcr結(jié)束后，采用酚：氯仿抽提，再加入2倍體積的無(wú)水乙醇進(jìn)行沉淀。沉淀用30μl水溶解，取1μl為模板。

90位xhoi限制性內(nèi)切酶位突變引物：90z：gagattgaaaagcttgagga（seqidno.3所示）；90f：tcctcaagcttttcaatctc（seqidno.4所示）。

229位hindiii限制性內(nèi)切酶位突變引物：229z：agcaagcctaagatgctcatcag（seqidno.5所示）；229f：ctgatgagcatcttaggcttgct（seqidno.6所示）。

632位saci限制性內(nèi)切酶位突變引物：632z：cagagttcaccaaatcagtgga（seqidno.7所示）；632f：tccactgatttggtgaactctg（seqidno.8所示）。

720位kpni限制性內(nèi)切酶位突變引物：720z：aggtaacacaatccgcatgt（seqidno.9所示）；720f：acatgcggattgtgttacct（seqidno.10所示）。

935位bglii限制性內(nèi)切酶位突變引物：935z：agaactttgagaagattatttc（seqidno.11所示）；935f：gaaataatcttctcaaagttct（seqidno.12所示）。

1148位bglii限制性內(nèi)切酶位突變引物：1148z：gaaggatatcttagagacct（seqidno.13所示）；1148f：aggtctctaagatatccttc（seqidno.14所示）。

1238位bamhi限制性內(nèi)切酶位突變引物：1238z：ctgggattctgggagtcctta（seqidno.15所示）；1238f：taaggactcccagaatcccag（seqidno.16所示）。

以引物hxk1和90f；90z和229f；229z和632f；632z和720f；720z和935f；935z和1148f；1148z和1238f；1238z和hxk2進(jìn)行pcr擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)熱1min；94℃，30s，60℃，30s，72℃，1min。共25個(gè)循環(huán)，pcr結(jié)束后，dna片斷用10%丙烯酰胺膠回收，將上述8個(gè)回收片斷取10-100ng為模板混合，以hxk1和hxk2為引物將上述片斷拼接，擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)熱1min；94℃，30s，60℃，30s，72℃，2min。共25個(gè)循環(huán)。pcr結(jié)束后，dna柱回收pcr片斷。將片段進(jìn)行ta克隆，獲得質(zhì)粒t1，并將質(zhì)粒t1高效轉(zhuǎn)化到大腸桿菌dh5α感受態(tài)細(xì)胞中。

2、構(gòu)建改造的草莓己糖磷酸異構(gòu)酶（pgi）基因fvpgi。

從草莓中克隆草莓己糖磷酸異構(gòu)酶并利用定點(diǎn)突變方法將264位xbai限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)；293位saci限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)；1126位bamhi限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)；1294位sphi限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)；1504位bgii限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)消除。

擴(kuò)增引物為：pgi1:5’-atggcatctatctctggtatctgttc-3’（seqidno.17所示）pgi2:5’-taggagtacagtgcatcgacgttg-3’（seqidno.18所示）。pcr反應(yīng)條件：98℃預(yù)變性3min；94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸120s，30個(gè)循環(huán)；72℃保溫10min。pcr結(jié)束后，采用酚：氯仿抽提，再加入2倍體積的無(wú)水乙醇進(jìn)行沉淀。沉淀用30μl水溶解，取1μl為模板。

264位xbai和293位saci限制性內(nèi)切酶位突變引物：264z：tcttgactggctgtaccagcacaaggagttcg（seqidno.19所示）；264f：cgaactccttgtgctggtacagccagtcaaga（seqidno.20所示）。

1126位bamhi限制性內(nèi)切酶位突變引物：1126z：ggaaccaaggatatggttgttct（seqidno.21所示）；1126f：agaacaaccatatccttggttcc（seqidno.22所示）。

1294位sphi限制性內(nèi)切酶位突變引物：1294z：ggagcacggatcagcttgca（seqidno.23所示）；1294f：tgcaagctgatccgtgctcc（seqidno.24所示）。

1504位bglii限制性內(nèi)切酶位突變引物：1504z：gaagaagtaacacctagaact（seqidno.25所示）；1504f：agttctaggtgttacttcttc（seqidno.26所示）。

以引物pgi1和264f；264z和1126f；1126z和1294f；1294z和1504f；1504z和pgi2進(jìn)行pcr擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)熱1min；94℃，30s，60℃，30s，72℃，1min。共25個(gè)循環(huán)，pcr結(jié)束后，dna片斷用10%丙烯酰胺膠回收，將上述8個(gè)回收片斷取10-100ng為模板混合，以pgi1和pgi2為引物將上述片斷拼接，擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)熱1min；94℃，30s，60℃，30s，72℃，2min。共25個(gè)循環(huán)。pcr結(jié)束后，dna柱回收pcr片斷。將片段進(jìn)行ta克隆，獲得質(zhì)粒t2，并將質(zhì)粒t2高效轉(zhuǎn)化到大腸桿菌dh5α感受態(tài)細(xì)胞中。

3、構(gòu)建改造的草莓磷酸甘露糖異構(gòu)酶（pmi）基因fvpmi。

從草莓中克隆甘露糖異構(gòu)酶基因并利用定點(diǎn)突變方法將817位hindiii限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)；1038位kpni限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)；1110和1221位psti限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)消除。

以合成的cdna第一鏈為模板，擴(kuò)增引物為：pmi1:5’-atggagaagtccatgatcgagaagtc-3’（seqidno.27所示）pmi2:5’-ttatggcagctggaagaacatggagt-3’（seqidno.28所示）。pcr反應(yīng)條件：98℃預(yù)變性3min；94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸90s，30個(gè)循環(huán)；72℃保溫10min。pcr結(jié)束后，采用酚：氯仿抽提，再加入2倍體積的無(wú)水乙醇進(jìn)行沉淀。沉淀用30μl水溶解，取1μl為模板。

817位hindiii限制性內(nèi)切酶位突變引物：817z：ctcaactatgtcaaggtt（seqidno.29所示）；817f：aaccttgacatagttgag（seqidno.30所示）。

1038位kpni和1110位psti限制性內(nèi)切酶位突變引物：1038z：ggttcctcccaccttttgacgagtttgaggtcgatcggtgccatcttccccagggagaatcagtggaatttcctgaag（seqidno.31所示）；1038f：cttcaggaaattccactgattctccctggggaagatggcaccgatcgacctcaaactcgtcaaaaggtgggaggaacc（seqidno.32所示）。

1221位psti限制性內(nèi)切酶位突變引物：1221z：cttttcgtgcctgaaggt（seqidno.33所示）；1221f：accttcaggcacgaaaag（seqidno.34所示）。

以引物pmi1和817f；817z和1038f；1038z和1221f；1221z和720f；720z和935f；935z和1148f；1148z和1238f；1238z和pmi2進(jìn)行pcr擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)熱1min；94℃，30s，60℃，30s，72℃，1min。共25個(gè)循環(huán)，pcr結(jié)束后，dna片斷用10%丙烯酰胺膠回收，將上述8個(gè)回收片斷取10-100ng為模板混合，以pmi1和pmi2為引物將上述片斷拼接，擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)熱1min；94℃，30s，60℃，30s，72℃，2min。共25個(gè)循環(huán)。pcr結(jié)束后，dna柱回收pcr片斷。將片段進(jìn)行ta克隆，獲得質(zhì)粒t3，并將質(zhì)粒t3高效轉(zhuǎn)化到大腸桿菌dh5α感受態(tài)細(xì)胞中。

4、構(gòu)建改造的草莓磷酸甘露糖變位酶（pmm）基因fvpmm。

從草莓中克隆磷酸甘露糖變位酶基因并利用定點(diǎn)突變方法將139位bamhi限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)；537位hindiii限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)消除。

以合成的cdna第一鏈為模板，擴(kuò)增引物為：pmm1:5’-atggctgtcatgaagcctggtgtc-3’（seqidno.35所示）pmm2:5’-ttaggaagagaagaacagagccttaac-3’（seqidno.36所示）。pcr反應(yīng)條件：98℃預(yù)變性3min；94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸60s，30個(gè)循環(huán)；72℃保溫10min。pcr結(jié)束后，采用酚：氯仿抽提，再加入2倍體積的無(wú)水乙醇進(jìn)行沉淀。沉淀用30μl水溶解，取1μl為模板。

139位bamhi限制性內(nèi)切酶位突變引物：139z：cagtgggcattgttggaggaacc（seqidno.37所示）；139f：ggttcctccaacaatgcccactg（seqidno.38所示）。

537位hindiii限制性內(nèi)切酶位突變引物：537z：gatatgctttgatgtttttcctc（seqidno.39所示）；537f：gaggaaaaacatcaaagcatatc（seqidno.40所示）。

以引物pmm1和139f；139z和537f；537z和pmm2進(jìn)行pcr擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)熱1min；94℃，30s，60℃，30s，72℃，1min。共25個(gè)循環(huán)，pcr結(jié)束后，dna片斷用10%丙烯酰胺膠回收，將上述8個(gè)回收片斷取10-100ng為模板混合，以pmm1和pmm2為引物將上述片斷拼接，擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)熱1min；94℃，30s，60℃，30s，72℃，2min。共25個(gè)循環(huán)。pcr結(jié)束后，dna柱回收pcr片斷。將片段進(jìn)行ta克隆，獲得質(zhì)粒t4，并將質(zhì)粒t4高效轉(zhuǎn)化到大腸桿菌dh5α感受態(tài)細(xì)胞中。

5、構(gòu)建改造的草莓gdp-d-甘露糖焦磷酸化酶（gmpase，vtc1）基因fvvtc。

從草莓中克隆gdp-d-甘露糖焦磷酸化酶基因并利用定點(diǎn)突變方法將367位ecori限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)；904位sphi限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)消除。

以合成的cdna第一鏈為模板，擴(kuò)增引物為：vtc1z:5’-atgaaggcactgattctggtcggt-3’（seqidno.41所示）vtc1f:5’-ttacatgacgatctcaggcttc-3’（seqidno.42所示）。pcr反應(yīng)條件：98℃預(yù)變性3min；94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸60s，30個(gè)循環(huán)；72℃保溫10min。pcr結(jié)束后，采用酚：氯仿抽提，再加入2倍體積的無(wú)水乙醇進(jìn)行沉淀。沉淀用30μl水溶解，取1μl為模板。

367位ecori限制性內(nèi)切酶位突變引物：367z：tggattccataaatcccatg（seqidno.43所示）；367f：catgggatttatggaatcca（seqidno.44所示）。

904位sphi限制性內(nèi)切酶位突變引物：904z：tcggatcaagaagcttgcttg（seqidno.45所示）；904f：caagcaagcttcttgatccga（seqidno.46所示）。

以引物vtc1z和367f；367z和904f；904z和vtc1f進(jìn)行pcr擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)熱1min；94℃，30s，60℃，30s，72℃，1min。共25個(gè)循環(huán)，pcr結(jié)束后，dna片斷用10%丙烯酰胺膠回收，將上述8個(gè)回收片斷取10-100ng為模板混合，以vtc1z和vtc1f為引物將上述片斷拼接，擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)熱1min；94℃，30s，60℃，30s，72℃，2min。共25個(gè)循環(huán)。pcr結(jié)束后，dna柱回收pcr片斷。將片段進(jìn)行ta克隆，獲得質(zhì)粒t5，并將質(zhì)粒t5高效轉(zhuǎn)化到大腸桿菌dh5α感受態(tài)細(xì)胞中。

6、構(gòu)建改造的草莓gdp-d-甘露糖-3，5-表異構(gòu)酶（gme）fvgme。

從草莓中克隆gdp-d-甘露糖-3，5-表異構(gòu)酶基因并利用定點(diǎn)突變方法將217位ecori限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)；667位psti限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)消除。

以合成的cdna第一鏈為模板，擴(kuò)增引物為：gme1:5’-atgggttctgctggtgagtctg-3’（seqidno.47所示）gme2:5’-ttactccttaccatcagcagcac-3’（seqidno.48所示）。pcr反應(yīng)條件：98℃預(yù)變性3min；94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸60s，30個(gè)循環(huán)；72℃保溫10min。pcr結(jié)束后，采用酚：氯仿抽提，再加入2倍體積的無(wú)水乙醇進(jìn)行沉淀。沉淀用30μl水溶解，取1μl為模板。

217位ecori限制性內(nèi)切酶位突變引物：217z：gagttccatcttgtggatctcag（seqidno.49所示）；217f：ctgagatccacaagatggaactc（seqidno.50所示）。

667位psti限制性內(nèi)切酶位突變引物：667z：ctgaagaaaggctctcacatccac（seqidno.51所示）；667f：gtggatgtgagagcctttcttcag（seqidno.52所示）。

以引物gme1和217f；217z和667f；667z和gme2進(jìn)行pcr擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)熱1min；94℃，30s，60℃，30s，72℃，1min。共25個(gè)循環(huán)，pcr結(jié)束后，dna片斷用10%丙烯酰胺膠回收，將上述8個(gè)回收片斷取10-100ng為模板混合，以gme1和gme2為引物將上述片斷拼接，擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)熱1min；94℃，30s，60℃，30s，72℃，2min。共25個(gè)循環(huán)。pcr結(jié)束后，dna柱回收pcr片斷。將片段進(jìn)行ta克隆，獲得質(zhì)粒t6，并將質(zhì)粒t6高效轉(zhuǎn)化到大腸桿菌dh5α感受態(tài)細(xì)胞中。

7、構(gòu)建改造的草莓gdp-l-半乳糖磷酸化酶（ggp，vtc2）基因fvvtc2。

從草莓中克隆gdp-l-半乳糖磷酸化酶基因并利用定點(diǎn)突變方法將258位sphi限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)；624位hindiii限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)；1070位ndei限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)；1236位bamhi限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)；1337位psti限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)消除。

以合成的cdna第一鏈為模板，擴(kuò)增引物為：vtc2z:5’-atgatgctgaagatcaagcgtg-3’（seqidno.53所示）；vtc2f:5’-ttactggagaaccagacactcct-3’（seqidno.54所示）。pcr反應(yīng)條件：98℃預(yù)變性3min；94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸90s，30個(gè)循環(huán)；72℃保溫10min。pcr結(jié)束后，采用酚：氯仿抽提，再加入2倍體積的無(wú)水乙醇進(jìn)行沉淀。沉淀用30μl水溶解，取1μl為模板。

258位sphi限制性內(nèi)切酶位突變引物：258z：gcttgcagaaagggctatttc（seqidno.55所示）；258f：gaaatagccctttctgcaagc（seqidno.56所示）。

624位hindiii限制性內(nèi)切酶位突變引物：624z：gaaaccttcttgcttgcacttc（seqidno.57所示）；624f：gaagtgcaagcaagaaggtttc（seqidno.58所示）。

1070位ndei限制性內(nèi)切酶位突變引物：1070z：caccacatgtccactaatttc（seqidno.59所示）；1070f：gaaattagtggacatgtggtg（seqidno.60所示）。

1236位kpni限制性內(nèi)切酶位突變引物：1236z：gaggaaccagatgtcaatcctc（seqidno.61所示）；1236f：gaggattgacatctggttcctc（seqidno.62所示）。

以引物vtc2z和258f；258z和624f；624z和1070f；1070z和1236f；1236z和vtc2f進(jìn)行pcr擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)熱1min；94℃，30s，60℃，30s，72℃，1min。共25個(gè)循環(huán)，pcr結(jié)束后，dna片斷用10%丙烯酰胺膠回收，將上述8個(gè)回收片斷取10-100ng為模板混合，以vtc2z和vtc2f為引物將上述片斷拼接，擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)熱1min；94℃，30s，60℃，30s，72℃，2min。共25個(gè)循環(huán)。pcr結(jié)束后，dna柱回收pcr片斷。將片段進(jìn)行ta克隆，獲得質(zhì)粒t7，并將質(zhì)粒t7高效轉(zhuǎn)化到大腸桿菌dh5α感受態(tài)細(xì)胞中。

8、構(gòu)建改造的草莓l-半乳糖-1-磷酸酶（gpp，vtc4）基因fvvtc4。

從草莓中克隆l-半乳糖-1-磷酸酶基因并利用定點(diǎn)突變方法將42位psti限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)；161位saci限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)；270位bamhi限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)消除。

以合成的cdna第一鏈為模板，擴(kuò)增引物：vtc4z:atggctgaaaatgattcgcttgctctgttcttggcctctgcagt（seqidno.63所示），vtc4f:ttaggagtcctcgacaccaag（seqidno.64所示）。pcr反應(yīng)條件：98℃預(yù)變性3min；94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸90s，30個(gè)循環(huán)；72℃保溫10min。pcr結(jié)束后，采用酚：氯仿抽提，再加入2倍體積的無(wú)水乙醇進(jìn)行沉淀。沉淀用30μl水溶解，取1μl為模板。

161位saci限制性內(nèi)切酶位突變引物：161z：gagttcatatttaatcatctca（seqidno.65所示）；161f：tgagatgattaaatatgaactc（seqidno.66所示）。

270位bamhi限制性內(nèi)切酶位突變引物：270z：gtggaacccctggatggcac（seqidno.67所示）；270f：gtgccatccaggggttccac（seqidno.68所示）。

以引物vtc4z和161f；161z和270f；270z和vtc4f進(jìn)行pcr擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)熱1min；94℃，30s，60℃，30s，72℃，1min。共25個(gè)循環(huán)，pcr結(jié)束后，dna片斷用10%丙烯酰胺膠回收，將上述8個(gè)回收片斷取10-100ng為模板混合，以vtc4z和vtc4f為引物將上述片斷拼接，擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)熱1min；94℃，30s，60℃，30s，72℃，2min。共25個(gè)循環(huán)。

pcr結(jié)束后，dna柱回收pcr片斷。將片段進(jìn)行ta克隆，獲得質(zhì)粒t8，并將質(zhì)粒t8高效轉(zhuǎn)化到大腸桿菌dh5α感受態(tài)細(xì)胞中。

9、構(gòu)建改造的草莓l-半乳糖醛酸內(nèi)酯脫氫酶（galdh）基因fvgaldh。

從草莓中克隆l-半乳糖醛酸內(nèi)酯脫氫酶基因并利用定點(diǎn)突變方法將678位ndei限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)消除。

以合成的cdna第一鏈為模板，擴(kuò)增引物為：galdh1:5’-atgactatccactactctgtcg-3’（seqidno.69所示）galdh2:5’-ttaggactgctggataccagaag-3’（seqidno.70所示）。pcr反應(yīng)條件：98℃預(yù)變性3min；94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸60s，30個(gè)循環(huán)；72℃保溫10min。pcr結(jié)束后，采用酚：氯仿抽提，再加入2倍體積的無(wú)水乙醇進(jìn)行沉淀。沉淀用30μl水溶解，取1μl為模板。

678位xhoi限制性內(nèi)切酶位突變引物：678z：ctttaggaattttcacatatgt（seqidno.71所示）；678f：acatatgtgaaaattcctaaag（seqidno.72所示）。

以引物galdh1和678f；678z和galdh2進(jìn)行pcr擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)熱1min；94℃，30s，60℃，30s，72℃，1min。共25個(gè)循環(huán)，pcr結(jié)束后，dna片斷用10%丙烯酰胺膠回收，將上述8個(gè)回收片斷取10-100ng為模板混合，以galdh1和galdh2為引物將上述片斷拼接，擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)熱1min；94℃，30s，60℃，30s，72℃，2min。共25個(gè)循環(huán)。pcr結(jié)束后，dna柱回收pcr片斷。將片段進(jìn)行ta克隆，獲得質(zhì)粒t9，并將質(zhì)粒t9高效轉(zhuǎn)化到大腸桿菌dh5α感受態(tài)細(xì)胞中。

10、構(gòu)建改造的草莓l-半乳糖脫氫酶（gldh）基因fvgldh。

從草莓克隆l-半乳糖脫氫酶基因并利用定點(diǎn)突變方法將12和263位saci限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)；340位xhoi限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)；602位ecori限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)；611和1625位psti限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)；1320位bgii限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)；1419位hindiii限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)消除。

以合成的cdna第一鏈為模板，擴(kuò)增引物為：gldhz:5’-atgcaacgagcactgactctgaag-3’（seqidno.73所示）gldhf:5’-ttagatggtgtcagaggatggga-3’（seqidno.74所示）。pcr反應(yīng)條件：98℃預(yù)變性3min；94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸120s，30個(gè)循環(huán)；72℃保溫10min。pcr結(jié)束后，采用酚：氯仿抽提，再加入2倍體積的無(wú)水乙醇進(jìn)行沉淀。沉淀用30μl水溶解，取1μl為模板。

263位saci限制性內(nèi)切酶位突變引物：263z：gagttccacaccgtctctaac（seqidno.75所示）；263f：gttagagacggtgtggaactc（seqidno.76所示）。

340位xhoi限制性內(nèi)切酶位突變引物：340z：gagctggagaaagtggtcaag（seqidno.77所示）；340f：cttgaccactttctccagctc（seqidno.78所示）。

602位ecori限制性內(nèi)切酶位突變引物：602z：gaactctgcaggttggtgcacatggtac（seqidno.79所示）；602f：gtaccatgtgcaccaacctgcagagttc（seqidno.80所示）。

1320位bglii限制性內(nèi)切酶位突變引物：1320z：agttctaaaacagctaatag（seqidno.81所示）；1320f：ctattagctgttttagaact（seqidno.82所示）。

1419位bglii限制性內(nèi)切酶位突變引物：1419z：aaggttaaaggaggatgatata（seqidno.83所示）；1419f：tatatcatcctcctttaacctt（seqidno.84所示）。

1625位psti限制性內(nèi)切酶位突變引物：1625z：caaagaacagcttaccactctgaag（seqidno.85所示）；1625f：cttcagagtggtaagctgttctttg（seqidno.86所示）。

以引物gldhz和263f；263z和340f；340z和602f；602z和1320f；1320z和1419f；1419z和1625f；1625z和gldhf進(jìn)行pcr擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)熱1min；94℃，30s，60℃，30s，72℃，1min。共25個(gè)循環(huán)，pcr結(jié)束后，dna片斷用10%丙烯酰胺膠回收，將上述8個(gè)回收片斷取10-100ng為模板混合，以gldhz和gldhf為引物將上述片斷拼接，擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)熱1min；94℃，30s，60℃，30s，72℃，2min。共25個(gè)循環(huán)。pcr結(jié)束后，dna柱回收pcr片斷。將片段進(jìn)行ta克隆，獲得質(zhì)粒t10，并將質(zhì)粒t10高效轉(zhuǎn)化到大腸桿菌dh5α感受態(tài)細(xì)胞中。

11、構(gòu)建改造的草莓脫氫抗壞血酸還原酶（dhar）基因fvdhar。

從草莓中克隆脫氫抗壞血酸還原酶基因并利用定點(diǎn)突變方法將33位psti限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)；339位bamhi限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)；453和521位hindiii限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)消除。

以合成的cdna第一鏈為模板，擴(kuò)增引物為：dharz:5’-atggctcttgaggttgctgccaaggctgctggag-3’（seqidno.87所示）dharf:5’-ttacttaggattgaccttaggttc-3’（seqidno.88所示）。pcr反應(yīng)條件：98℃預(yù)變性3min；94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸60s，30個(gè)循環(huán)；72℃保溫10min。pcr結(jié)束后，采用酚：氯仿抽提，再加入2倍體積的無(wú)水乙醇進(jìn)行沉淀。沉淀用30μl水溶解，取1μl為模板。

339位bamhi限制性內(nèi)切酶位突變引物：339z：gacattcctcaagagcaaggaacc（seqidno.89所示）；339f：ggttccttgctcttgaggaatgtc（seqidno.90所示）。

453位hindiii限制性內(nèi)切酶位突變引物：453z：gtcactgctgctgatctaaccttg（seqidno.91所示）；453f：caaggttagatcagcagcagtgac（seqidno.92所示）。

521位hindiii限制性內(nèi)切酶位突變引物：521z：ctaaaggtttgacccattaccat（seqidno.93所示）；521f：atggtaatgggtcaaacctttag（seqidno.94所示）。

以引物dharz和339f；339z和453f；453z和521f；521z和dharf進(jìn)行pcr擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)熱1min；94℃，30s，60℃，30s，72℃，1min。共25個(gè)循環(huán)，pcr結(jié)束后，dna片斷用10%丙烯酰胺膠回收，將上述8個(gè)回收片斷取10-100ng為模板混合，以dharz和dharf為引物將上述片斷拼接，擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)熱1min；94℃，30s，60℃，30s，72℃，2min。共25個(gè)循環(huán)。pcr結(jié)束后，dna柱回收pcr片斷。將片段進(jìn)行ta克隆，獲得質(zhì)粒t11，并將質(zhì)粒t11高效轉(zhuǎn)化到大腸桿菌dh5α感受態(tài)細(xì)胞中。

實(shí)施例1，構(gòu)建葡萄糖合成維生素c原核表達(dá)載體。

將上述11個(gè)改造的維生素c合成基因全部使用t7啟動(dòng)子和終止子控制，構(gòu)建基因表達(dá)元件。首先，我們利用“重疊延伸pcr技術(shù)”構(gòu)建維生素c合成所有11個(gè)基因的表達(dá)盒。啟動(dòng)子、基因和終止子之間不含限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。構(gòu)建的大腸桿菌表達(dá)單元為：t7fvhxk1s、t7fvpgis、t7fvpmis、t7fvpmms、t7fvvtc1s、t7fvgmes、t7fvvtc2s、t7fvvtc4s、t7fvgaldhs、t7fvgldhs、t7fvdhars。

t7啟動(dòng)子序列為：gaattcctcgagcgatcccgcgaaattaatacgactcactataggggaattgtgagcggataacaattcccctctagaaataattttgtttaactttaagaaggagatatacc（seqidno.95所示）。

t7終止子序列為：ctagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttggtcgacggtgacgttgagcatggtaagctt（seqidno.96所示）。

構(gòu)建的表達(dá)單元在puc18載體上兩兩拼接，完成后消除內(nèi)在的酶切位點(diǎn)，然后依次插入載體pcambia-1301，最終構(gòu)建成大腸桿菌維生素c合成載體pyb2130。

實(shí)施例2，葡萄糖合成維生素c原核表達(dá)載體pyb2130大腸桿菌轉(zhuǎn)化

1)大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備。

大腸桿菌菌株為bl21（de3），或bl21-ai等含有t7rna聚合酶的菌株。挑取單菌在25mllb培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)過(guò)夜，取5ml菌液轉(zhuǎn)接到100mllb培養(yǎng)基，培養(yǎng)至od600=0.7-0.8，菌液冰上放置10分鐘，5000rpm離心10min，4℃，收集菌體，加入100ml無(wú)菌雙蒸水清洗兩次。加入4ml10%甘油懸浮菌體，轉(zhuǎn)到50ml離心管。5500rpm離心10min，4℃。收集菌體，加入500μl10%甘油懸浮菌體，轉(zhuǎn)到1.5ml離心管。

2）維生素c原核表達(dá)載體yb2130經(jīng)電擊法導(dǎo)人大腸桿菌中。

取70μl農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞，加入1μl表達(dá)載體pyb2130?；靹?，轉(zhuǎn)到0.1cm電擊杯中。電擊參數(shù)：200ω，1.7kv，2.5f，電擊后立即加入800μlsoc培養(yǎng)液。培養(yǎng)1小時(shí)后，取100μl涂50μg/l卡那霉素抗性板篩選轉(zhuǎn)化子，37℃培養(yǎng)。篩選生長(zhǎng)良好的菌落培養(yǎng)后-70℃甘油管凍存。

3）驗(yàn)證大腸桿菌利用葡萄糖合成維生素c。

將在-70℃甘油管凍存的工程菌接種于裝有所需培養(yǎng)基的小試管中，接種含卡那霉素（kmp，30mg／l）的3mllb試管，在30℃培養(yǎng)過(guò)夜，過(guò)夜菌再以2％接種50ml含抗生素的lb搖瓶，在30℃培養(yǎng)2-6h后，加入iptg或iptg+0.2%阿拉伯糖誘導(dǎo)培養(yǎng)24-72小時(shí)，轉(zhuǎn)速均為200r/min。加入葡萄糖終濃度10mg/ml。測(cè)定發(fā)酵終止液的菌體光密度值和維生素c的含量。

4）維生素c含量hplc檢測(cè)。

取10ml發(fā)酵菌液，離心收集菌體，液氮研磨，加0.1%草酸1ml，冰浴1小時(shí)，超聲處理5min。10000rpm離心10min，取上清，過(guò)0.45μm濾膜。發(fā)酵上清樣品用等體積0.2%草酸稀釋，過(guò)0.45μm濾膜。

高效液相(hplc)條件:色譜柱:symmetryshieldrp18柱(5μm，150x4.6mm)。流動(dòng)相為甲醇:0.1%草酸=5:95，檢測(cè)波長(zhǎng)245nm，柱溫為30℃，流速1.0ml/min，外標(biāo)法定量。樣品每次進(jìn)樣10μl，將與標(biāo)品相同保留時(shí)間處的峰的峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算樣品中維生素c的含量。

色譜圖結(jié)果表明：大腸桿菌誘導(dǎo)培養(yǎng)3天后，可以檢測(cè)到維生素c，維生素c的含量為0.5-1μg/ml。

序列表

<110>上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院

<120>一種利用植物維生素c合成途徑構(gòu)建生產(chǎn)維生素c大腸桿菌菌株的方法

<130>2017

<160>96

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

atggggaaggtggcggtgggt21

<210>2

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

ttaggagtcctcgacaccaag21

<210>3

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

gagattgaaaagcttgagga20

<210>4

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

tcctcaagcttttcaatctc20

<210>5

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

agcaagcctaagatgctcatcag23

<210>6

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>6

ctgatgagcatcttaggcttgct23

<210>7

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>7

cagagttcaccaaatcagtgga22

<210>8

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>8

tccactgatttggtgaactctg22

<210>9

<211>60

<212>dna

<213>人工序列

<400>9

aggtaacacaatccgcatgt20

<210>10

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>10

acatgcggattgtgttacct20

<210>11

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>11

agaactttgagaagattatttc22

<210>12

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>12

gaaataatcttctcaaagttct22

<210>13

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>13

gaaggatatcttagagacct20

<210>14

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>14

aggtctctaagatatccttc20

<210>15

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>15

ctgggattctgggagtcctta21

<210>16

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>16

taaggactcccagaatcccag21

<210>17

<211>26

<212>dna

<213>人工序列

<400>17

atggcatctatctctggtatctgttc26

<210>18

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<400>18

taggagtacagtgcatcgacgttgc25

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<211>32

<212>dna

<213>人工序列

<400>19

tcttgactggctgtaccagcacaaggagttcg32

<210>20

<211>32

<212>dna

<213>人工序列

<400>20

cgaactccttgtgctggtacagccagtcaaga32

<210>21

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>21

ggaaccaaggatatggttgttct23

<210>22

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>22

agaacaaccatatccttggttcc23

<210>23

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>23

ggagcacggatcagcttgca20

<210>24

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>24

tgcaagctgatccgtgctcc20

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<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>25

gaagaagtaacacctagaact21

<210>26

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>26

agttctaggtgttacttcttc21

<210>27

<211>26

<212>dna

<213>人工序列

<400>27

atggagaagtccatgatcgagaagtc26

<210>28

<211>26

<212>dna

<213>人工序列

<400>28

ttatggcagctggaagaacatggagt26

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<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>29

ctcaactatgtcaaggtt18

<210>30

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>30

aaccttgacatagttgag18

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<211>76

<212>dna

<213>人工序列

<400>31

ggttcctcccaccttttgacgagtttgaggtcgatcggtgccatcttccccagggagaat60

cagtggaatttcctgaag78

<210>32

<211>78

<212>dna

<213>人工序列

<400>32

cttcaggaaattccactgattctccctggggaagatggcaccgatcgacctcaaactcgt60

caaaaggtgggaggaacc78

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<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>33

cttttcgtgcctgaaggt18

<210>34

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>34

accttcaggcacgaaaag18

<210>35

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<400>35

atggctgtcatgaagcctggtgtc25

<210>36

<211>27

<212>dna

<213>人工序列

<400>36

ttaggaagagaagaacagagccttaac27

<210>37

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>37

cagtgggcattgttggaggaac22

<210>38

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>38

ggttcctccaacaatgcccactg22

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<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>39

gatatgctttgatgtttttcctc23

<210>40

<211>37

<212>dna

<213>人工序列

<400>40

gaggaaaaacatcaaagcatatc23

<210>41

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>41

atgaaggcactgattctggtcgg23

<210>42

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>42

ttacatgacgatctcaggcttct23

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<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>43

tggattccataaatcccatg20

<210>44

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>44

catgggatttatggaatcca20

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<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>45

tcggatcaagaagcttgcttg21

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<212>dna

<213>人工序列

<400>46

caagcaagcttcttgatccga21

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<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>47

atgggttctgctggtgagtctg22

<210>48

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>48

ttactccttaccatcagcagcac23

<210>49

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>49

gagttccatcttgtggatctcag23

<210>50

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>50

ctgagatccacaagatggaactc23

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<211>24

<212>dna

<213>人工序列

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ctgaagaaaggctctcacatccac24

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<212>dna

<213>人工序列

<400>52

gtggatgtgagagcctttcttcag24

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<211>22

<212>dna

<213>人工序列

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atgatgctgaagatcaagcgtg22

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<211>23

<212>dna

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ttactggagaaccagacactcct23

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<212>dna

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gcttgcagaaagggctatttc21

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<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>56

gaaatagccctttctgcaagc21

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<211>22

<212>dna

<213>人工序列

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gaaaccttcttgcttgcacttc22

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<211>22

<212>dna

<213>人工序列

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gaagtgcaagcaagaaggtttc22

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<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>59

caccacatgtccactaatttc21

<210>60

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

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gaaattagtggacatgtggtg21

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<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>61

gaggaaccagatgtcaatcctc22

<210>62

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>62

gaggattgacatctggttcctc22

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<212>dna

<213>人工序列

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atggctgaaaatgattcgcttgctctgttcttggcctctgcagt44

<210>64

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

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ttaggagtcctcgacaccaag21

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<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>65

gagttcatatttaatcatctca22

<210>66

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>66

tgagatgattaaatatgaactc22

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<212>dna

<213>人工序列

<400>67

gtggaacccctggatggcac20

<210>68

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

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gtgccatccaggggttccac20

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<211>22

<212>dna

<213>人工序列

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atgactatccactactctgtcg22

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<212>dna

<213>人工序列

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ttaggactgctggataccagaag23

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ctttaggaattttcacatatgt22

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<211>22

<212>dna

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acatatgtgaaaattcctaaag22

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<212>dna

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atgcaacgagcactgactctgaag24

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<212>dna

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ttagatggtgtcagaggatggga23

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<212>dna

<213>人工序列

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gagttccacaccgtctctaac21

<210>76

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

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gttagagacggtgtggaactc21

<210>77

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

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gagctggagaaagtggtcaag21

<210>78

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

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cttgaccactttctccagctc21

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<212>dna

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gaactctgcaggttggtgcacatggtac28

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<212>dna

<213>人工序列

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gtaccatgtgcaccaacctgcagagttc28

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<212>dna

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agttctaaaacagctaatag20

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<212>dna

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ctattagctgttttagaact20

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<212>dna

<213>人工序列

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tatatcatcctcctttaacctt22

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<212>dna

<213>人工序列

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caaagaacagcttaccactctgaag25

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<212>dna

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cttcagagtggtaagctgttctttg25

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<212>dna

<213>人工序列

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atggctcttgaggttgctgccaaggctgctggag34

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<212>dna

<213>人工序列

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ttacttaggattgaccttaggttc24

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<212>dna

<213>人工序列

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gacattcctcaagagcaaggaacc24

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<212>dna

<213>人工序列

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<212>dna

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gtcactgctgctgatctaaccttg24

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<212>dna

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caaggttagatcagcagcagtgac24

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<212>dna

<213>人工序列

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ctaaaggtttgacccattaccat23

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<212>dna

<213>人工序列

<400>94

atggtaatgggtcaaacctttag23

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<212>dna

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gaattcctcgagcgatcccgcgaaattaatacgactcactataggggaattgtgagcgga60

taacaattcccctctagaaataattttgtttaactttaagaaggagatatacc113

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<212>dna

<213>人工序列

<400>96

ctagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttggtcgacggtgac60

gttgagcatggtaagctt78