一種重組大腸桿菌菌株及用其制備番茄紅素的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種利用重組大腸桿菌高密度培養(yǎng)生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)番茄紅素的方法，屬于微生物發(fā)酵領(lǐng)域。本方法所用的種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基均為化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基，培養(yǎng)基成本低廉，不含有任何有機(jī)態(tài)氮源。本方法采用菌體生長和誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化期脫偶聯(lián)的生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)番茄紅素，有效保證了較快的菌體生長速度，節(jié)省了生產(chǎn)的時(shí)間成本。利用本發(fā)明的發(fā)酵培養(yǎng)基和方法高密度培養(yǎng)大腸桿菌，并通過誘導(dǎo)、轉(zhuǎn)化，以葡萄糖為底物生產(chǎn)番茄紅素，菌體密度(OD600nm)和番茄紅素產(chǎn)量分別達(dá)到200和3.2g/L發(fā)酵液，發(fā)酵周期36小時(shí)。CGMCC No.1220320160311
【專利說明】
一種重組大腸桿菌菌株及用其制備番茄紅素的方法
技術(shù)領(lǐng)域
:
[0001]本發(fā)明涉及一種大腸桿菌(Escherichiacoli)的新菌株及通過高密度培養(yǎng)該菌株制備生產(chǎn)番茄紅素的方法，屬于微生物發(fā)酵領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
:
[0002]高密度培養(yǎng)(HCDC)即高密度發(fā)酵，一般指培養(yǎng)液中工程菌的菌體干重濃度達(dá)到50g/L以上，對工程大腸桿菌而言，其OD6qqim值達(dá)到150以上。與傳統(tǒng)微生物發(fā)酵培養(yǎng)相比，高密度培養(yǎng)具有菌體密度高，產(chǎn)物的細(xì)胞水平量高，單位體積設(shè)備的生產(chǎn)能力高，生物量的分離費(fèi)用低，生產(chǎn)周期短，生產(chǎn)效率高等優(yōu)點(diǎn)。但隨著菌體密度增加，也會(huì)隨之出現(xiàn)一些問題，例如培養(yǎng)物中溶氧不足;代謝產(chǎn)物乙酸的堆積對菌體生長和外源蛋白表達(dá)的抑制；工程菌質(zhì)粒穩(wěn)定性下降;底物濃度對細(xì)胞增長存在的抑制性作用等。
[0003]番茄紅素(Lycopene)是一種多元不飽和碳?xì)浠衔?，屬于類胡蘿卜素家族，是一種抗氧化劑，它是構(gòu)成番茄紅色色素的主要成分。番茄紅素在醫(yī)藥、食品以及化妝品領(lǐng)域有重要的應(yīng)用，比如它具有防病抗癌、增強(qiáng)機(jī)體免疫力和抗衰老的生理功能，可有效防止“自由基”對人體造成的傷害。番茄紅素?zé)o毒無害，可以添加到食品中，以增加食品的營養(yǎng)價(jià)值。近年來，番茄紅素相關(guān)的產(chǎn)品研發(fā)已成為國際上新藥研究的熱點(diǎn)。
[0004]目前國際上番茄紅素的生產(chǎn)主要有天然提取、化學(xué)合成和微生物發(fā)酵法等。番茄中番茄紅素的含量很低，利用天然提取法生產(chǎn)番茄紅素不僅產(chǎn)量低，而且價(jià)格昂貴，無法滿足市場需求;化學(xué)合成法以紫羅酮作為原料，雖價(jià)格比天然提取法低廉，但有中間產(chǎn)物殘留，其中不安全因素較多，如毒性和致癌性。而微生物發(fā)酵法具有成本低、反應(yīng)條件溫和、產(chǎn)率高、易于大規(guī)模培養(yǎng)、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)。隨著生物工程領(lǐng)域相關(guān)技術(shù)的快速發(fā)展，利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)番茄紅素已成為目前的研究熱點(diǎn)之一。
[0005]微生物發(fā)酵法生產(chǎn)番茄紅素所用的菌株分為野生微生物菌株和代謝工程菌株兩類。野生微生物菌株以三孢布拉霉(Blakeslea trispora)為主，最高產(chǎn)量約為3.7g/L，但霉菌生產(chǎn)周期較長，生產(chǎn)的時(shí)間成本較高。代謝工程菌以工程大腸桿菌(Escherichia coli)為主，利用基因工程的方法，以微生物內(nèi)源或外源的MEP途徑或者外源的MVA途徑合成IPP和DMAPP，再引入外源的CrtE、CrtB和CrtI基因，最終合成番茄紅素。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明人已做過廣泛的研究，以提供一種通過發(fā)酵以工業(yè)規(guī)模實(shí)現(xiàn)制備番茄紅素的方法。
[0007]本發(fā)明要解決的第一個(gè)技術(shù)問題是提供一種大腸桿菌菌株(Escherichiacoli),該菌株生產(chǎn)周期較短，生產(chǎn)的時(shí)間成本較低。
[0008]本發(fā)明要解決的第二個(gè)技術(shù)問題是提供一種高密度培養(yǎng)方法，該方法能實(shí)現(xiàn)高菌體密度、高外源蛋白表達(dá)量、高目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量。
[0009]本發(fā)明提供了一種高密度培養(yǎng)工程大腸桿菌生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)番茄紅素的方法。本方法有如下優(yōu)勢:
[0010](I)所用的種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基均為化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基成本低廉，不含有任何有機(jī)態(tài)氮源，如酵母浸提物、蛋白胨等。
[0011](2)本方法采用菌體生長期和誘導(dǎo)、轉(zhuǎn)化期脫偶聯(lián)的生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)番茄紅素，有效保證了較快的菌體生長速度，節(jié)省了生產(chǎn)的時(shí)間成本。
[0012](3)本方法在菌體生長期采用了指數(shù)補(bǔ)料-恒速補(bǔ)料相結(jié)合的分段補(bǔ)料方式，既保證了菌體生長所需營養(yǎng)的供給，又可根據(jù)發(fā)酵設(shè)備的自身限制最大限度地保證發(fā)酵液中氧氣的供應(yīng)，菌體密度(ODeoor?)達(dá)到200。
[0013](4)利用本發(fā)明的發(fā)酵培養(yǎng)基和方法高密度培養(yǎng)大腸桿菌，并通過誘導(dǎo)、轉(zhuǎn)化，以葡萄糖為底物生產(chǎn)番茄紅素，菌體密度(OD6OOnm)和番茄紅素產(chǎn)量分別達(dá)到200和3.2g/L發(fā)酵液，發(fā)酵周期36小時(shí)。
[0014]本發(fā)明的重組大腸埃希氏菌(Escherichia coli)菌株Mva-10-Yk，已于2016年3月11日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏號(hào)為:CGMCCN0.12203，保藏單位地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)。
[0015]本發(fā)明的高密度培養(yǎng)的培養(yǎng)基，其中包括種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基和補(bǔ)料培養(yǎng)基。
[0016]所述的種子培養(yǎng)基，按g/L記，包括:檸檬酸1.1-2；磷酸二氫鉀9-15.2;磷酸氫二銨2-4；七水合硫酸鎂0.1-1.5；葡萄糖2-5;硫酸鏈霉素0.05-2；硫酸卡那霉素0.05 -1.5。
[0017]所述種子培養(yǎng)基中的七水合硫酸鎂和葡萄糖需要分別單獨(dú)滅菌后與其他成分混入口 ο
[0018]所述種子培養(yǎng)基中的硫酸鏈霉素和硫酸卡那霉素需分別單獨(dú)用無菌濾膜過濾滅菌后與其他成分混合。
[0019]所述種子培養(yǎng)基在滅菌之前需用濃度為5M的氨水調(diào)節(jié)pH至6.5-7.5。
[0020]所述發(fā)酵培養(yǎng)基，按g/L記，包括:檸檬酸1.1-2.0;磷酸二氫鉀9-15.2;磷酸氫二銨
2-4;七水合硫酸鎂0.1-1.5;葡萄糖10-25;以及維生素BI 3-10mg/L;微量元素I 10_20ml/1^聚醚類消泡劑0.1-21111/1。
[0021]所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的微量元素I，包括:800-1000mg/L乙二胺四乙酸二鈉，100-25011^/1六水合氯化鈷，1500-250011^/1四水合氯化亞錳，90-15011^/1二水合氯化銅，200-500mg/L硼酸，250-400mg/L 二水合鉬酸鈉，1000-2500mg/L 二水合乙酸鋅，5-10g/L檸檬酸鐵。
[0022]所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的七水合硫酸鎂和葡萄糖需要分別單獨(dú)滅菌后與其他成分混入口 ο
[0023]所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的維生素BI，微量元素I，需分別單獨(dú)用無菌濾膜過濾滅菌后與其他成分混合。
[0024]所述補(bǔ)料培養(yǎng)基中，包括:葡萄糖400-600g/L;七水合硫酸鎂1.0-2.0g/L;微量元素 II 10-20ml/Lo
[0025]所述補(bǔ)料培養(yǎng)基中的微量元素II，包括:900-1200mg//L乙二胺四乙酸二鈉，400-eoomg/l六水合氯化鈷，1200 - 2400mg/L四水合氯化亞錳，100 - 300mg/L二水合氯化銅，200 -500mg/L硼酸，300 - 250mg/L二水合鉬酸鈉，1500 - 2500mg/L二水合乙酸鋅，1- 4g/L檸檬酸鐵。
[0026]所述補(bǔ)料培養(yǎng)基中的葡萄糖和七水合硫酸鎂需要分別單獨(dú)滅菌后與其他成分混口 O
[0027]所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的微量元素II，需單獨(dú)用無菌濾膜過濾滅菌后與其他成分混入口 O
[0028]本發(fā)明提供的一種應(yīng)用所述培養(yǎng)基高密度培養(yǎng)重組大腸桿菌生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)番茄紅素的方法。
[0029]所述的高密度培養(yǎng)，是指菌體增長階段與誘導(dǎo)、轉(zhuǎn)化階段脫偶聯(lián)的培養(yǎng)方式，具體地，該方法包括種子培養(yǎng)階段，菌體增長階段，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化階段。
[0030]所述高密度培養(yǎng)中的種子培養(yǎng)階段，是指將凍存的菌種以1- 5 %的接種量，接種到裝有20-1OOml種子培養(yǎng)基的500ml三角瓶；于搖床30-39°C，180-280rpm的條件下培養(yǎng)5-12小時(shí)得到一級種子;再將一級種子以2-10%的接種量，接種到裝有20-1OOml種子培養(yǎng)基的5001111三角瓶;于搖床30-39°(:，180-280印111的條件下培養(yǎng)5-12小時(shí)得到二級種子，二級種子的00600咖為1.5-4.00
[0031]所述高密度培養(yǎng)中的菌體增長階段，是指將二級種子以2%-10%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基裝液量為30-60%的發(fā)酵罐中，發(fā)酵罐通氣量為1-5vvm，轉(zhuǎn)速為200-1200rpm，溶氧控制在15- 35 %，溶氧偶聯(lián)轉(zhuǎn)速，pH為6.5-7.5，以濃度為5-1OM氨水控制pH，培養(yǎng)溫度為29-39 °C；發(fā)酵時(shí)間為5 - 8h時(shí)，發(fā)酵液中初始葡萄糖耗盡，立即啟動(dòng)補(bǔ)料培養(yǎng)基的補(bǔ)料，補(bǔ)料速率分布在7-28ml/(L.h )，從補(bǔ)料起始時(shí)間開始，每2 - 5h取出少量發(fā)酵液，測量其0D600nm，直至發(fā)酵時(shí)間為18 - 25h，發(fā)酵液0D600nm的增長速率減慢，該時(shí)間點(diǎn)0D600nm為160-185。
[0032]所述菌體增長階段的補(bǔ)料速率是指采用指數(shù)補(bǔ)料-恒速補(bǔ)料相結(jié)合的方式，具體地，以7-10ml/(L.h)起始，并以每小時(shí)1.05-1.35的倍率增長，模擬指數(shù)補(bǔ)料;直至發(fā)酵罐轉(zhuǎn)速和通氣量達(dá)到上限時(shí)，補(bǔ)料速率不再增加，并維持該時(shí)刻補(bǔ)料速率不變，進(jìn)行恒速補(bǔ)料。
[0033]所述的誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化階段，是指菌體增長階段結(jié)束后，向發(fā)酵液中加入終濃度為
0.002-0.2%的L-阿拉伯糖，調(diào)整補(bǔ)料速率，誘導(dǎo)生產(chǎn)番茄紅素的相關(guān)酶表達(dá)，并以補(bǔ)料培養(yǎng)基中的葡萄糖為底物，生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)生番茄紅素。
[0034]所述誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化階段的的調(diào)整補(bǔ)料速率，包括將補(bǔ)料速率調(diào)整至15_30ml/(L.h)，進(jìn)入誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化期6小時(shí)后，番茄紅素產(chǎn)量明顯增加，補(bǔ)料速率按每小時(shí)0.4-0.9倍的倍率減慢，直至發(fā)酵時(shí)間達(dá)到36小時(shí)放罐。
[0035]產(chǎn)物番茄紅素的檢測方法:
[0036]發(fā)酵過程中可留取發(fā)酵液樣品于-20°C保存，用于產(chǎn)物檢測。
[0037]樣品化凍后搖勻，取發(fā)酵液樣品離心8000rpm，5min后棄上清，將沉淀震蕩散開，向沉淀中加入等體積丙酮，充分萃取SOminc3I^OOOrpm離心5min，測定其474nm吸光值。
[0038]番茄紅素濃度與A474nm的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。
[0039]利用本方法，發(fā)酵結(jié)束時(shí)菌體密度(0D6QQnm)和番茄紅素產(chǎn)量分別達(dá)到150-200和2.4-3.2g/L發(fā)酵液，發(fā)酵周期36小時(shí)。其生物量和產(chǎn)物體積產(chǎn)量隨發(fā)酵時(shí)間的變化曲線如圖2所示。
【附圖說明】
:
[0040]圖1番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)曲線圖
[0041]圖2生長曲線及產(chǎn)物曲線圖
【具體實(shí)施方式】
:
[0042]實(shí)施例1
[0043]重組大腸桿菌高密度培養(yǎng)的培養(yǎng)基制備
[0044]種子培養(yǎng)基，按g/L記，包括:檸檬酸1.7;磷酸二氫鉀13;磷酸氫二銨4;七水合硫酸鎂1.0;葡萄糖5;硫酸鏈霉素0.05;硫酸卡那霉素0.05。
[0045]所述種子培養(yǎng)基中的七水合硫酸鎂和葡萄糖需要分別單獨(dú)滅菌后與其他成分混入口 ο
[0046]所述種子培養(yǎng)基中的硫酸鏈霉素和硫酸卡那霉素需分別單獨(dú)用無菌濾膜過濾滅菌后與其他成分混合。
[0047]所述種子培養(yǎng)基在滅菌之前需用濃度為5M的氨水調(diào)節(jié)pH至7.0。
[0048]發(fā)酵培養(yǎng)基，按g/L記，包括:檸檬酸1.7;磷酸二氫鉀15;磷酸氫二銨4;七水合硫酸鎂0.9;葡萄糖20;以及維生素BI 5mg/L;微量元素I 10ml/L;聚醚類消泡劑0.5ml/L。
[0049]所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的微量元素I，包括:800mg/L乙二胺四乙酸二鈉，100mg/L六水合氯化鈷，1500mg/L四水合氯化亞猛，90mg/L 二水合氯化銅，200mg/L硼酸，250mg/L 二水合鉬酸鈉，1000mg/L 二水合乙酸鋅，5g/L檸檬酸鐵。
[0050]所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的七水合硫酸鎂和葡萄糖需要分別單獨(dú)滅菌后與其他成分混入口 ο
[0051]所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的維生素BI，微量元素I，需分別單獨(dú)用無菌濾膜過濾滅菌后與其他成分混合。
[0052]所述補(bǔ)料培養(yǎng)基中，包括:葡萄糖600g/L;七水合硫酸鎂1.0g/L;微量元素II10ml/Lo
[0053]所述補(bǔ)料培養(yǎng)基中的微量元素II，包括:900mg/L乙二胺四乙酸二鈉，400mg/L六水合氯化鈷，1200mg/L四水合氯化亞猛，100mg/L 二水合氯化銅，200mg/L硼酸，300mg/L 二水合鉬酸鈉，1500mg/L二水合乙酸鋅，I g/L檸檬酸鐵。
[0054]所述補(bǔ)料培養(yǎng)基中的葡萄糖和七水合硫酸鎂需要分別單獨(dú)滅菌后與其他成分混入口 ο
[0055]所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的微量元素II，需單獨(dú)用無菌濾膜過濾滅菌后與其他成分混入口 O
[0056]實(shí)施例2
[0057]重組大腸桿菌高密度培養(yǎng)的種子液制備
[0058]重組大腸埃希氏菌(Escherichia coli)菌株Mva-10_Yk，已于2016年3月11日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為:CGMCC N0.12203。
[0059]高密度培養(yǎng)中的種子培養(yǎng)階段，是指將凍存的菌種以I%的接種量，接種到裝有50ml種子培養(yǎng)基的500ml三角瓶;于搖床37°C，280rpm的條件下培養(yǎng)8小時(shí)得到一級種子;再將一級種子以4%的接種量，接種到裝有10ml種子培養(yǎng)基的500ml三角瓶；于搖床37°C，280印111的條件下培養(yǎng)6小時(shí)得到二級種子，二級種子的0060011111為1.5-2.5。
[0060]實(shí)施例2中所述的種子培養(yǎng)為:
[0061 ]種子培養(yǎng)基，按g/L記，包括:檸檬酸1.7;磷酸二氫鉀13;磷酸氫二銨4;七水合硫酸鎂1.0;葡萄糖5;硫酸鏈霉素0.05;硫酸卡那霉素0.05。
[0062]所述種子培養(yǎng)基中的七水合硫酸鎂和葡萄糖需要分別單獨(dú)滅菌后與其他成分混入口 ο
[0063]所述種子培養(yǎng)基中的硫酸鏈霉素和硫酸卡那霉素需分別單獨(dú)用無菌濾膜過濾滅菌后與其他成分混合。
[0064]所述種子培養(yǎng)基在滅菌之前需用濃度為5M的氨水調(diào)節(jié)pH至7.0。
[0065]發(fā)酵培養(yǎng)基，按g/L記，包括:檸檬酸1.7;磷酸二氫鉀15;磷酸氫二銨4;七水合硫酸鎂0.9;葡萄糖20;以及維生素BI 5mg/L;微量元素I 10ml/L;聚醚類消泡劑0.5ml/L。
[0066]所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的微量元素I，包括:800mg/L乙二胺四乙酸二鈉，100mg/L六水合氯化鈷，1500mg/L四水合氯化亞猛，90mg/L二水合氯化銅，200mg/L硼酸，250mg/L二水合鉬酸鈉，1000mg/L 二水合乙酸鋅，5g/L檸檬酸鐵。
[0067]所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的七水合硫酸鎂和葡萄糖需要分別單獨(dú)滅菌后與其他成分混入口 ο
[0068]所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的維生素BI，微量元素I，需分別單獨(dú)用無菌濾膜過濾滅菌后與其他成分混合。
[0069]所述補(bǔ)料培養(yǎng)基中，包括:葡萄糖600g/L;七水合硫酸鎂1.0g/L;微量元素II10ml/Lo
[0070]所述補(bǔ)料培養(yǎng)基中的微量元素II，包括:900mg/L乙二胺四乙酸二鈉，400mg/L六水合氯化鈷，1200mg/L四水合氯化亞猛，100mg/L 二水合氯化銅，200mg/L硼酸，300mg/L 二水合鉬酸鈉，1500mg/L二水合乙酸鋅，I g/L檸檬酸鐵。
[0071]所述補(bǔ)料培養(yǎng)基中的葡萄糖和七水合硫酸鎂需要分別單獨(dú)滅菌后與其他成分混入口 ο
[0072]所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的微量元素II，需單獨(dú)用無菌濾膜過濾滅菌后與其他成分混入口 O
[0073]實(shí)施例3
[0074]重組大腸桿菌高密度培養(yǎng)的菌體增長階段調(diào)控方法
[0075]高密度培養(yǎng)中的菌體增長階段，是指將二級種子以10%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基裝液量為40%的發(fā)酵罐中，發(fā)酵罐通氣量為1-3vvm，轉(zhuǎn)速為300-1200rpm，溶氧控制在20-30 %，溶氧偶聯(lián)轉(zhuǎn)速，pH為6.8 - 7.2，以濃度為5M氨水控制pH，培養(yǎng)溫度為37 V ;當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為Sh時(shí)，發(fā)酵液溶氧瞬間上升，即發(fā)酵液中初始葡萄糖耗盡，立即啟動(dòng)補(bǔ)料培養(yǎng)基的補(bǔ)料，補(bǔ)料速率從8ml/(L.h)起始，隨之以指數(shù)補(bǔ)料-恒速補(bǔ)料相結(jié)合的方式調(diào)控。，從補(bǔ)料起始時(shí)間開始，每2 - 5h取出少量發(fā)酵液，測量其0D600nm，直至發(fā)酵時(shí)間為2 Ih，發(fā)酵液0D600nm的增長速率減慢，該時(shí)間點(diǎn)0060011111為180。
[0076]所述菌體增長階段的補(bǔ)料速率是指采用指數(shù)補(bǔ)料-恒速補(bǔ)料相結(jié)合的方式，具體地，以8ml/(L.h)起始，并以每小時(shí)1.2的倍率增長，模擬指數(shù)補(bǔ)料;直至發(fā)酵罐轉(zhuǎn)速和通氣量達(dá)到上限時(shí)，補(bǔ)料速率不再增加，并維持該時(shí)刻補(bǔ)料速率不變，進(jìn)行恒速補(bǔ)料。
[0077]實(shí)施例4
[0078]重組大腸桿菌高密度培養(yǎng)生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)番茄紅素的誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化階段
[0079]以實(shí)施例3所描述的方法，菌體增長階段結(jié)束后，向發(fā)酵液中加入終濃度為0.02%的L-阿拉伯糖，調(diào)整補(bǔ)料速率，誘導(dǎo)生產(chǎn)番茄紅素的相關(guān)酶表達(dá)，并以補(bǔ)料培養(yǎng)基中的葡萄糖為底物，生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)生番茄紅素。
[0080]所述誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化階段的的調(diào)整補(bǔ)料速率，是將補(bǔ)料速率調(diào)整至25ml/(L.h)，進(jìn)入誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化期6小時(shí)后，番茄紅素產(chǎn)量明顯增加，補(bǔ)料速率按每小時(shí)0.7倍的倍率減慢，直至發(fā)酵時(shí)間達(dá)到36小時(shí)放罐。
[0081 ]產(chǎn)物番茄紅素的檢測方法:
[0082]發(fā)酵過程中可留取發(fā)酵液樣品于-20°C保存，用于產(chǎn)物檢測。
[0083]樣品化凍后搖勻，取發(fā)酵液樣品離心8000rpm，5min后棄上清，將沉淀震蕩散開，向沉淀中加入等體積丙酮，充分萃取SOminc3I^OOOrpm離心5min，測定其474nm吸光值。
[0084]發(fā)酵結(jié)束時(shí)菌體密度(0D600nm)和番茄紅素產(chǎn)量分別達(dá)到200和3.2g/L發(fā)酵液，發(fā)酵周期36小時(shí)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種重組大腸桿菌(Escherichia coli)菌株Mva-10-Yk，該菌種保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏號(hào)CGMCC N0.12203。2.—種用重組大腸桿菌菌株制備番茄紅素的方法，其特征在于，在高密度培養(yǎng)基中培養(yǎng)重組大腸桿菌的種子培養(yǎng)階段、菌體增長階段和誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化階段。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的高密度培養(yǎng)基，其特征包括:種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基、補(bǔ)料培養(yǎng)基。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的種子培養(yǎng)基，其特征包括:檸檬酸1.1-2g/L;磷酸二氫鉀9-15.2g/L;磷酸氫二銨2-4g/L;七水合硫酸鎂0.1-1.5g/L;葡萄糖2-5g/L;硫酸鏈霉素0.05-2g/L ;硫酸卡那霉素0.05-1.5g/L。5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的種子培養(yǎng)基，其特征在于:在滅菌之前需用濃度為5M的氨水調(diào)節(jié)pH至6.5-7.5。6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征包括:檸檬酸1.1-2.0g/L;磷酸二氫鉀9 -15.2g/L;磷酸氫二銨2- 4g/L;七水合硫酸鎂0.1-1.5g/L;葡萄糖10- 25g/L;以及維生素BI3- 10mg/L;微量元素I 10-20ml/L;聚醚類消泡劑0.1_2ml/L。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的微量元素I，其特征包括:800-1000mg/L乙二胺四乙酸二鈉，100-25011^/1六水合氯化鈷，1500-250011^/1四水合氯化亞錳，90-15011^/1二水合氯化銅，200 - 500mg/L硼酸，250 - 400mg/L二水合鉬酸鈉，1000 - 2500mg/L二水合乙酸鋅，5 -10g/L檸檬酸鐵。8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的補(bǔ)料培養(yǎng)基，其特征在于:葡萄糖400-600g/L;七水合硫酸鎂1.0-2.0g/L;微量元素 II 10-20ml/Lo9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的微量元素II，其特征在于:900-1200mg/L乙二胺四乙酸二鈉，400 - 600mg/L六水合氯化鈷，1200 - 2400mg/L四水合氯化亞錳，100 - SOOmg/!二水合氯化銅，200-500mg/L硼酸，300-250mg/L二水合鉬酸鈉，1500-2500mg/L二水合乙酸鋅，1-4g/L檸檬酸鐵。10.根據(jù)權(quán)利要求2所述的種子培養(yǎng)階段，其特征在于:將凍存的菌種以1-5%的接種量，接種到裝有20-1OOml種子培養(yǎng)基的500ml三角瓶;于搖床30-39 °C，180-280rpm的條件下培養(yǎng)5-12小時(shí)得到一級種子;再將一級種子以2-10%的接種量，接種到裝有20-1OOml種子培養(yǎng)基的5001111三角瓶;于搖床30-39°(:，180-280印111的條件下培養(yǎng)5-12小時(shí)得到二級種子，二級種子的0D6QQnm為1.5-4.0。11.根據(jù)權(quán)利要求2所述的菌體增長階段，其特征在于:將二級種子以2%-10%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基裝液量為30 - 60 %的發(fā)酵罐中，發(fā)酵罐通氣量為1- 5vvm，轉(zhuǎn)速為200 -1200rpm，溶氧控制在15- 35 %，溶氧偶聯(lián)轉(zhuǎn)速，pH為6.5- 7.5，以濃度為5-1OM氨水控制pH，培養(yǎng)溫度為29 - 39 °C ;發(fā)酵時(shí)間為5- 8h時(shí)，發(fā)酵液中初始葡萄糖耗盡，立即啟動(dòng)補(bǔ)料培養(yǎng)基的補(bǔ)料，補(bǔ)料速率分布在7-28ml/(L.h)，采用指數(shù)補(bǔ)料-恒速補(bǔ)料相結(jié)合的方式進(jìn)行;從補(bǔ)料起始時(shí)間開始，每2-5h取出少量發(fā)酵液，測量其OD6QQnm，直至發(fā)酵時(shí)間為18-25h，發(fā)酵液0D_■的增長速率下降，該時(shí)間點(diǎn)OD6qq■為160 -185 012.根據(jù)權(quán)利要求11所述的指數(shù)補(bǔ)料-恒速補(bǔ)料相結(jié)合的方式補(bǔ)料，其特征在于:以7-10ml/(L.h)起始，并以每小時(shí)1.05-1.35的倍率增長，模擬指數(shù)補(bǔ)料;直至發(fā)酵罐轉(zhuǎn)速和通氣量達(dá)到上限時(shí)，補(bǔ)料速率不再增加，并維持該時(shí)刻補(bǔ)料速率不變，進(jìn)行恒速補(bǔ)料。13.根據(jù)權(quán)利要求2所述的誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化階段，其特征在于:菌體增長階段結(jié)束后，向發(fā)酵液中加入終濃度為0.002-0.2 %的L-阿拉伯糖，調(diào)整補(bǔ)料速率，誘導(dǎo)生產(chǎn)番茄紅素的相關(guān)酶表達(dá)，并以補(bǔ)料培養(yǎng)基中的葡萄糖為底物，生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)生番茄紅素。14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的調(diào)整補(bǔ)料速率，其特征在于:將補(bǔ)料速率調(diào)整至15-30ml/(L.h)，進(jìn)入誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化期6小時(shí)后，番茄紅素產(chǎn)量明顯增加，補(bǔ)料速率按每小時(shí)0.4-0.9倍的倍率減慢，直至發(fā)酵時(shí)間達(dá)到36小時(shí)放罐。
【文檔編號(hào)】C12P5/02GK105969709SQ201610292894
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年5月5日
【發(fā)明人】陳浩, 陳浪, 周衛(wèi)強(qiáng), 張莎莎, 胡開蕾, 晏禮明, 陶勇, 劉偉豐
【申請人】中國科學(xué)院微生物研究所