產(chǎn)能檢測磺胺藥物的蛋白質(zhì)的重組大腸桿菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域中產(chǎn)能檢測磺胺藥物的蛋白質(zhì)的重組大腸桿菌及其構(gòu) 建方法與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 食品中殘留的獸藥會破壞胃腸道菌群平衡，并可導(dǎo)致長期的腹瀉、維生素缺乏及 影響其它藥物的療效，從而影響人體健康。磺胺藥物是一類具有對氨基苯磺酰胺結(jié)構(gòu)的化 學(xué)藥物，磺胺藥物價(jià)格便宜、使用方便，廣泛應(yīng)用于動物疾病防治和促生長，其在動物源食 品中的殘留問題已經(jīng)引起人們的廣泛關(guān)注。如何確保動物源食品質(zhì)量安全，除了嚴(yán)格控制 產(chǎn)業(yè)鏈中磺胺藥物的使用外，建立動物源食品中磺胺藥物的快速檢測方法則顯得尤為重 要。
[0003] 目前磺胺藥物的檢測方法主要有儀器法（包括高效氣相色譜、高效液相色譜以及 色質(zhì)聯(lián)用技術(shù)等）、微生物法、免疫分析方法以及受體分析方法等。這些方法各有特點(diǎn)：儀 器法準(zhǔn)確、可靠、靈敏度高，是一種確證方法，但是不適合現(xiàn)場快速檢測；微生物法可同時(shí)檢 測多種抗生素，但靈敏度不高、檢測時(shí)間長，且無法定量；免疫分析方法基于抗原抗體的特 異結(jié)合，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、可定量檢測等優(yōu)勢，但由于靈敏度高且可識別同一類藥 物的抗體難以獲得，制約了其在獸藥殘留檢測領(lǐng)域的應(yīng)用。歐盟制定了磺胺藥物總量在動 物源食品中的最高殘留限量為100ng/mL。如能獲得可同時(shí)檢測多種磺胺藥物的物質(zhì)將有助 于磺胺藥物的檢測。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何檢測多種磺胺藥物。
[0005] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明首先提供了一株能高效產(chǎn)生可用于檢測多種磺胺藥 物的蛋白質(zhì)flop的重組大腸桿菌。
[0006] 本發(fā)明所提供的一株能高效產(chǎn)生可用于檢測多種磺胺藥物的蛋白質(zhì)flop的重組 大腸桿菌是大腸埃希氏菌（Escherichia coli)BL21 (DE3) -pET28b_f Iop，其在中國微生物 菌種保藏管理委員會普通微生物中心的登記入冊編號為CGMCC No. 10068。該菌種已于2014 年11月27日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（簡稱CGMCC)。
[0007] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了構(gòu)建重組大腸桿菌的方法。
[0008] 本發(fā)明所提供的構(gòu)建重組大腸桿菌的方法，包括將用于檢測多種磺胺藥物的蛋白 質(zhì)flop的編碼基因?qū)胧荏w大腸桿菌中得到產(chǎn)所述用于檢測多種磺胺藥物的蛋白質(zhì)flop 的重組大腸桿菌；
[0009] 所述用于檢測多種磺胺藥物的蛋白質(zhì)flop為如下a)或b)的蛋白質(zhì)：
[0010] a)由SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
[0011] b)將SEQ ID No. 1的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和 /或添加得到的具有用于檢測多種磺胺藥物的蛋白質(zhì)flop活性的由a)衍生的蛋白質(zhì)。
[0012] 其中，SEQ ID No. 1由314個(gè)氨基酸殘基組成。
[0013] 上述構(gòu)建重組大腸桿菌的方法中，所述用于檢測多種磺胺藥物的蛋白質(zhì)flop的 編碼基因?yàn)槿缦?)或2)或3)的核酸分子：
[0014] 1)其編碼序列是SEQ ID No. 2的DNA分子或cDNA分子；
[0015] 2)在嚴(yán)格條件下與1)限定的DNA分子雜交且編碼所述用于檢測多種磺胺藥物的 蛋白質(zhì)flop的DNA分子或cDNA分子；
[0016] 3)與1)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且編碼所述用于檢測多 種磺胺藥物的蛋白質(zhì)flop的DNA分子或cDNA分子。
[0017] 其中，SEQ ID No. 2由945個(gè)核苷酸組成，其編碼序列是第1-945位。
[0018] 這里使用的術(shù)語"同一性"指核酸序列間的序列相似性。"同一性"包括與本發(fā)明 的SEQ ID No. 2所示的DNA分子或cDNA分子具有75 %或更高，或85 %或更高，或90 %或更 高，或95%或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行評價(jià)。使用 計(jì)算機(jī)軟件，兩個(gè)或多個(gè)序列之間的同一性可以用百分比（％)表示，其可以用來評價(jià)相關(guān) 序列之間的同一性。
[0019] 所述嚴(yán)格條件是在2XSSC，0. 1% SDS的溶液中，在68°C下雜交并洗膜2次，每次 5min，又于0. 5 X SSC，0. 1 % SDS的溶液中，在68°C下雜交并洗膜2次，每次15min。
[0020] 上述75%或75%以上同一性，可為80%、85%、90%或95%以上的同一性。
[0021] 上述構(gòu)建重組大腸桿菌的方法中，所述用于檢測多種磺胺藥物的蛋白質(zhì)flop的 編碼基因通過重組表達(dá)載體導(dǎo)入所述受體大腸桿菌中。
[0022] 上述構(gòu)建重組大腸桿菌的方法中，所述受體大腸桿菌為大腸桿菌BL21(DE3); 所述重組表達(dá)載體是將所述用于檢測多種磺胺藥物的蛋白質(zhì)flop的編碼基因插入載體 pET_28b (+)的多克隆位點(diǎn)得到的重組表達(dá)載體。
[0023] 上述構(gòu)建重組大腸桿菌的方法中，所述重組表達(dá)載體可含有序列SEQ ID No. 2所 示的用于編碼用于檢測多種磺胺藥物的蛋白質(zhì)flop的DNA序列；進(jìn)一步的，所述重組載體 具體可 pET-28b (+) -f Iop ;所述 pET-28b (+) -f Iop 為將 pET-28b (+)載體的 NedI 和 XhoI 識 別位點(diǎn)（識別序列）間的DNA序列替換為SEQ ID No. 2所示的用于編碼用于檢測多種磺胺 藥物的蛋白質(zhì)flop的DNA序列，保持其它DNA序列不變，得到表達(dá)SEQ ID No. 1所示的用 于檢測多種磺胺藥物的蛋白質(zhì)flop的重組載體。
[0024] 上述構(gòu)建重組大腸桿菌的方法中，所述重組大腸桿菌可為大腸埃希氏菌 (Escherichia coli)BL21 (DE3)-pET28b_flop，其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通 微生物中心的登記入冊編號為CGMCC No. 10068。
[0025] 本發(fā)明所提供的由上述任一種構(gòu)建重組大腸桿菌的方法構(gòu)建的重組大腸桿菌也 屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0026] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了所述用于檢測多種磺胺藥物的蛋白質(zhì)flop 的制備方法。
[0027] 本發(fā)明所提供的所述用于檢測多種磺胺藥物的蛋白質(zhì)flop的制備方法，包括培 養(yǎng)所述大腸埃希氏菌（Escherichia coli)BL21 (DE3)-pET28b_flop或由上述任一種構(gòu)建重 組大腸桿菌的方法構(gòu)建的重組大腸桿菌，得到所述用于檢測多種磺胺藥物的蛋白質(zhì)flop。
[0028] 所述用于檢測多種磺胺藥物的蛋白質(zhì)flop的制備方法具體可按照如下方法制 備，在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述大腸埃希氏菌（Escherichia coli)BL21(DE3)-pET28b-flop 或由上述任一種構(gòu)建重組大腸桿菌的，收集所述大腸埃希氏菌（Escherichia coli) BL21 (DE3)-pET28b-flop或由上述任一種構(gòu)建重組大腸桿菌的代謝物，從所述代謝物中得 到所述用于檢測多種磺胺藥物的蛋白質(zhì)flop。
[0029] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了下述1)-8)中的任一種應(yīng)用：
[0030] 1)所述大腸埃希氏菌（Escherichia coli)BL21 (DE3)-pET28b_fIop 在生產(chǎn)所述 用于檢測多種磺胺藥物的蛋白質(zhì)flop中的應(yīng)用；
[0031] 2)所述構(gòu)建重組大腸桿菌的方法在生產(chǎn)所述用于檢測多種磺胺藥物的蛋白質(zhì) flop中的應(yīng)用；
[0032] 3)由所述構(gòu)建重組大腸桿菌的方法構(gòu)建的重組大腸桿菌在生產(chǎn)所述用于檢測多 種磺胺藥物的蛋白質(zhì)flop中的應(yīng)用；
[0033] 4)所述大腸埃希氏菌（Escherichia coli)BL21 (DE3)-pET28b_fIop 在檢測磺胺 藥物中的應(yīng)用；
[0034] 5)所述用于檢測多種磺胺藥物的蛋白質(zhì)flop在檢測磺胺藥物中的應(yīng)用；
[0035] 6)所述構(gòu)建重組大腸桿菌的方法在檢測磺胺藥物中的應(yīng)用；
[0036] 7)由所述構(gòu)建重組大腸桿菌的方法構(gòu)建的重組大腸桿菌在檢測磺胺藥物中的應(yīng) 用；
[0037] 8)所述用于檢測多種磺胺藥物的蛋白質(zhì)flop的制備方法在檢測磺胺藥物中的應(yīng) 用。
[0038] 上述應(yīng)用中，所述磺胺藥物具體可為磺胺異噁唑、柳氮磺胺吡啶、磺胺苯吡唑、磺 胺吡啶、磺胺甲二唑、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺噻唑、磺胺苯酰、磺胺喹噁啉、磺胺甲氧吡嗪、磺 胺索嘧啶、磺胺醋酰、磺胺甲噁唑、磺胺氯噠嗪、磺胺乙氧噠嗪、磺胺甲氧嘧啶、磺胺甲噻唑、 磺胺二甲基嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺甲基異噁唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺胍、磺胺間甲氧噠 嗪、磺胺硝苯、磺胺嘧啶、磺胺溴二甲嘧啶、氨苯磺胺、磺胺多辛和酞磺胺噻唑中的全部或部 分任一種。
[0039] 上述應(yīng)用中，所述應(yīng)用為非疾病診斷和/或非治療的應(yīng)用
[0040] 實(shí)驗(yàn)證明，將SEQ ID NO. 2所示的flop基因通過重組表達(dá)載體pET-28b (+) -flop 導(dǎo)入大腸桿菌BL21 (DE3)中，經(jīng)過篩選得到大腸埃希氏菌（Escherichia coli) BL21 (DE3) -pET28b-f Iop (即為 BL21-pET28b-f lop-7 菌株），具有最高的蛋白質(zhì) f Iop 產(chǎn)率， 200mL含有大腸埃希氏菌（Escherichia coli)BL21 (DE3)-pET28b-flop的LB液體培養(yǎng)基經(jīng) 培養(yǎng)、菌體破碎、離心收集上清進(jìn)行蛋白質(zhì)純化后可以收獲3. 89mg的蛋白質(zhì)flop，適于作 為蛋白質(zhì)flop的生產(chǎn)菌株。以大腸埃希氏菌（Escherichia coli)BL21(DE3)-pET28b_flop 表達(dá)的蛋白質(zhì)flop對于磺胺二甲基嘧啶標(biāo)準(zhǔn)品的檢測限為4. 82ng/mL，可以識別包括磺胺 二甲基嘧啶、磺胺甲氧嘧啶、磺胺甲噻唑、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺甲基異噁唑等在內(nèi)的至少 29種磺胺藥物。
[0041] 保藏說明
[0042] 菌種名稱：大腸埃希氏菌
[0043] 拉丁名：Escherichia coli
[0044] 菌株編號：BL21 (DE3) -pET28b_flop
[0045] 保藏機(jī)構(gòu)：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心
[0046] 保藏機(jī)構(gòu)簡稱：CGMCC
[0047] 地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號
[0048] 保藏日期：2014年11月27日