專利名稱：制備玉米黃素和/或其生物合成中間體和/或次級產(chǎn)物的方法
發(fā)明描述本發(fā)明涉及通過培養(yǎng)與野生型相比由于雙鏈ε-環(huán)化酶核糖核酸序列而具有降低的ε-環(huán)化酶活性的經(jīng)遺傳修飾植物制備玉米黃素和/或其生物合成中間體和/或次級產(chǎn)物(secondary products)的方法，并且涉及經(jīng)遺傳修飾植物及其作為食品和飼料的用途和生產(chǎn)類胡蘿卜素提取物的用途。
類胡蘿卜素，諸如番茄紅素、葉黃素、β-胡蘿卜素或玉米黃素，可在細(xì)菌、藻類、真菌和植物中從頭合成。含有至少一個酮基的酮類胡蘿卜素，即類胡蘿卜素，例如蝦青素、角黃素、β-胡蘿卜素-4-酮、3-羥基β-胡蘿卜素-4-酮、3’-羥基β-胡蘿卜素-4-酮、金盞花玉紅質(zhì)(adonirubin)和金盞花黃質(zhì)(adonixanthin)，是由某些藻類和微生物作為次級代謝物產(chǎn)生的天然抗氧化劑和色素。
由于其著色特性，類胡蘿卜素可用作著色劑和著色輔助劑。例如玉米黃素和葉黃素用于卵黃著色，β-胡蘿卜素在食品和飲料中作為橙色色素，蝦青素在家畜類喂養(yǎng)，尤其是在紅鱒、鮭魚和蝦養(yǎng)殖中，用作著色輔助劑。
此外，由于其抗氧化特性，類胡蘿卜素如葉黃素、玉米黃素、番茄紅素、β-胡蘿卜素和蝦青素，用于補充人類和家畜類營養(yǎng)以治療和預(yù)防疾病。
研發(fā)一種經(jīng)濟的制備天然類胡蘿卜素的生物技術(shù)方法是非常重要的。
在專利WO 00/32788中公開了通過將過表達類胡蘿卜素生物合成基因和反義操作相聯(lián)合影響萬壽菊屬花瓣中特定類胡蘿卜素比率的方法。
盡管專利WO 00/32788中公開的方法提供了與野生型相比具有改變了的類胡蘿卜素含量的經(jīng)遺傳修飾植物，但所述的方法具有以下缺點，即例如“β-類胡蘿卜素途徑”的類胡蘿卜素如β-胡蘿卜素或玉米黃素的含量水平，和所述類胡蘿卜素的純度，以及“β-類胡蘿卜素途徑”的類胡蘿卜素如β-胡蘿卜素或玉米黃素，與“α-類胡蘿卜素途徑”的類胡蘿卜素如α-胡蘿卜素或葉黃素的比率，仍然不令人滿意。
因此，本發(fā)明的目的是提供通過培養(yǎng)植物制備玉米黃素和/或生物合成中間體和/或其次級產(chǎn)物的另一種方法，并且，分別地提供另外的可產(chǎn)生玉米黃素和/或其生物合成中間體和/或其次級產(chǎn)物的轉(zhuǎn)基因植物而且這些轉(zhuǎn)基因植物具有優(yōu)化的特性，如與“α-類胡蘿卜素途徑”的類胡蘿卜素相比玉米黃素和/或生物合成中間體和/或其次級產(chǎn)物的含量更高，并且該方法沒有所報導(dǎo)的現(xiàn)有技術(shù)的缺點。
因此，建立了通過培養(yǎng)與野生型相比由于雙鏈ε-環(huán)化酶核糖核酸序列而具有降低的ε-環(huán)化酶活性的經(jīng)遺傳修飾植物制備玉米黃素和/或其生物合成中間體和/或次級產(chǎn)物的方法。
ε-環(huán)化酶活性是指ε-環(huán)化酶的酶活性。
ε-環(huán)化酶是指具有將末端、直鏈番茄紅素基團轉(zhuǎn)化為ε-紫羅酮環(huán)的酶活性的蛋白質(zhì)。
因此，ε-環(huán)化酶具體而言是指具有將番茄紅素轉(zhuǎn)化為δ-胡蘿卜素的酶活性的蛋白質(zhì)。
所以，ε-環(huán)化酶活性是指在特定時間內(nèi)由ε-環(huán)化酶蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化的番茄紅素的量或產(chǎn)生的δ-胡蘿卜素的量。
因此，當(dāng)與野生型相比ε-環(huán)化酶活性降低時，與野生型相比在特定時間內(nèi)由ε-環(huán)化酶蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化的番茄紅素的量或產(chǎn)生的δ-胡蘿卜素的量減少。
降低的ε-環(huán)化酶活性優(yōu)選地是指基于不同的細(xì)胞生物學(xué)機制，部分或基本上完全停止或阻斷植物細(xì)胞、植物或其部分、組織、器官、細(xì)胞或由其產(chǎn)生的種子中的ε-環(huán)化酶功能。
與野生型相比，例如通過減少植物中ε-環(huán)化酶蛋白質(zhì)的量或ε-環(huán)化酶mRNA的量，可以降低ε-環(huán)化酶活性。因此，通過直接測定或通過測定本發(fā)明植物中與野生型相比ε-環(huán)化酶蛋白質(zhì)的量或ε-環(huán)化酶mRNA的量可以測定與野生型相比降低的ε-環(huán)化酶活性。
ε-環(huán)化酶活性的降低包括ε-環(huán)化酶的量減少至基本上完全缺乏所述ε-環(huán)化酶(即缺乏可檢測到的ε-環(huán)化酶活性或缺乏免疫學(xué)可檢測的所述ε-環(huán)化酶)。與野生型相比，植物中，特別優(yōu)選地是在花中，ε-環(huán)化酶活性(或ε-環(huán)化酶蛋白質(zhì)的量或ε-環(huán)化酶mRNA的量)優(yōu)選地降低至少5％，更加優(yōu)選地降低至少20％，更加優(yōu)選地降低至少50％，更加優(yōu)選地為降低100％。具體而言“降低”也是指完全缺乏ε-環(huán)化酶活性(或完全缺乏ε-環(huán)化酶蛋白質(zhì)或ε-環(huán)化酶mRNA)。
優(yōu)選地是在下述條件下測定本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾植物或野生型或參照植物中ε-環(huán)化酶活性按照Fraser和Sandmann(Biochem.Biophys.Res.Comm.185(1)(1992)9-15)的方法可以體外測定ε-環(huán)化酶活性，測定時將磷酸鉀緩沖液(pH 7.6)、底物番茄紅素、紅甜椒(paprika)基質(zhì)蛋白質(zhì)、NADP+、NADPH和ATP加入特定量植物提取物中。
特別優(yōu)選地是按照Bouvier、d’Harlingue和Camara(類胡蘿卜素環(huán)化酶抑制的分子分析，Arch.Biochem.Biophys.346(1)(1997)53-64)的方法測定本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾植物或野生型或參照植物中ε-環(huán)化酶活性。
體外測定在0.25ml體積中進行。反應(yīng)混合物包括50mM磷酸鉀緩沖液(pH 7.6)、不同量的植物提取物、20nM番茄紅素、0.25mg紅甜椒色質(zhì)體基質(zhì)蛋白質(zhì)、0.2mM NADP+、0.2mM NADPH和1mM ATP。將NADP/NADPH和ATP溶解于0.01ml含1mg吐溫80的乙醇中后立即加入孵育介質(zhì)。在30℃反應(yīng)60分鐘后，加入氯仿/甲醇(2∶1)終止反應(yīng)。通過HPLC法分析提取入氯仿的反應(yīng)產(chǎn)物。
使用放射性底物的另一種測定方法描述于Fraser和Sandmann(Biochem.Biophys.Res.Comm.185(1)(1992)9-15)。另一種分析方法描述于Beyer、Krncke和Nievelstein(在黃水仙(Narcissus pseudonarcissus L.)色質(zhì)體中番茄紅素異構(gòu)酶/環(huán)化酶的反應(yīng)機制，J.Biol.Chem.266(26)(1991)17072-17078)。
根據(jù)上下文，術(shù)語“植物”可以指親本植物(野生型)或本發(fā)明的經(jīng)遺傳修飾植物或兩者。
并且優(yōu)選地且特別地當(dāng)其中植物或野生型不能清楚歸類的情況下，用于降低ε-環(huán)化酶活性和增加玉米黃素和/或生物合成中間體和/或其次級產(chǎn)物含量的“野生型”是指參照植物。
所述參照植物為萬壽菊(Tagetes erecta)、孔雀草(Tagetes patula)、香葉萬壽菊(Tagetes lucida)、普林萬壽菊(Tagetes pringlei)、Tagetespalmeri、小萬壽菊(Tagetes minuta)或鐘形萬壽菊(Tagetes campanulata)，特別優(yōu)選地是萬壽菊。
在本發(fā)明方法中，通過將至少一種雙鏈ε-環(huán)化酶核糖核酸序列，在下文中也稱為ε-環(huán)化酶dsRNA，或者保證其表達的一個表達盒或多個表達盒導(dǎo)入植物來降低ε-環(huán)化酶活性。
也包括這些方法，其中所述ε-環(huán)化酶dsRNA直接針對ε-環(huán)化酶基因(即諸如啟動子序列的基因組DNA序列)或ε-環(huán)化酶轉(zhuǎn)錄本(即mRNA序列)。
根據(jù)本發(fā)明，與野生型相比，通過雙鏈ε-環(huán)化酶核糖核酸序列降低ε-環(huán)化酶活性的經(jīng)遺傳修飾植物是指利用雙鏈ε-環(huán)化酶核糖核酸序列降低ε-環(huán)化酶活性。這種利用雙鏈RNA(“雙鏈RNA干擾”，也稱為dsRNA加工)進行基因調(diào)控的方法本身是已知的并描述于如Matzke MA等(2000)Plant Mol Biol 43401-415；Fire A等(1998)Nature 391806-811；WO 99/32619；WO 99/53050；WO 00/68374；WO 00/44914；WO 00/44895；WO 00/49035或WO 00/63364中。根據(jù)描述于所列引文中的過程和方法制備表達參照。
根據(jù)本發(fā)明，“雙鏈核糖核酸序列”是指一個或多個這樣的核糖核酸序列，它們或者在理論上屬于互補序列，如按照Watson和Crick的堿基配對原則，和/或?qū)嶋H上，如由于雜交實驗，能夠在體外和/或體內(nèi)形成雙鏈RNA結(jié)構(gòu)。
技術(shù)人員認(rèn)為雙鏈RNA結(jié)構(gòu)的形成代表一種平衡態(tài)。雙鏈分子與相應(yīng)的解鏈形式的比率優(yōu)選地至少為1∶10，優(yōu)選地為1∶1，特別優(yōu)選地為5∶1，最優(yōu)選地為10∶1。
雙鏈ε-環(huán)化酶核糖核酸序列或ε-環(huán)化酶dsRNA優(yōu)選地是指具有雙鏈結(jié)構(gòu)區(qū)域并在所述區(qū)域內(nèi)含有如下核酸序列的RNA分子，所述核酸序列a)與所述植物固有的至少部分ε-環(huán)化酶轉(zhuǎn)錄本相同和/或b)與所述植物固有的至少部分ε-環(huán)化酶-啟動子序列相同。
因此，在本發(fā)明的方法中，優(yōu)選地通過將具有雙鏈結(jié)構(gòu)區(qū)域并在所述區(qū)域內(nèi)含有如下核酸序列的RNA導(dǎo)入植物降低ε-環(huán)化酶活性，其中所述核酸序列a)與所述植物固有的至少部分ε-環(huán)化酶轉(zhuǎn)錄本相同和/或b)與所述植物固有的至少部分ε-環(huán)化酶-啟動子序列相同。
術(shù)語“ε-環(huán)化酶轉(zhuǎn)錄本”是指ε-環(huán)化酶基因的轉(zhuǎn)錄部分，其中除了ε-環(huán)化酶-編碼序列之外，還包括非編碼序列，如UTR。
“與所述植物固有的至少部分ε-環(huán)化酶-啟動子序列相同”的RNA優(yōu)選地意思是指RNA序列與至少部分ε-環(huán)化酶-啟動子序列的理論轉(zhuǎn)錄本即相應(yīng)RNA序列相同。
植物固有的ε-環(huán)化酶轉(zhuǎn)錄本的“部分”或植物固有的ε-環(huán)化酶啟動子序列的“部分”是指可以從涵蓋轉(zhuǎn)錄本或啟動子序列少數(shù)幾個堿基到多至全部序列的部分序列。技術(shù)人員通過常規(guī)實驗方法可以快速測定所述部分序列的最佳長度。
部分序列的長度通常為至少10個堿基且不多于2kb，優(yōu)選地為至少25個堿基且不多于1.5kb，特別優(yōu)選地為至少50個堿基且不多于600個堿基，非常特別優(yōu)選地為至少100個堿基且不多于500個堿基，最優(yōu)選地為至少200個堿基或至少300個堿基且不多于400個堿基。
為了獲得盡可能高的特異性且不降低其它酶的活性(其中其它酶活性的降低是不期望的)優(yōu)選地對部分序列進行選擇。因此選擇ε-環(huán)化酶轉(zhuǎn)錄本的ε-環(huán)化酶dsRNA部分序列部分和/或在其它序列中不存在的ε-環(huán)化酶啟動子序列的部分序列是有利的。
因此，在一個特別優(yōu)選的實施方案中，ε-環(huán)化酶dsRNA包含與植物固有ε-環(huán)化酶部分轉(zhuǎn)錄本相同的且含有植物固有的編碼ε-環(huán)化酶的核酸的5’端或3’端的序列。轉(zhuǎn)錄本5’或3’端的非翻譯區(qū)特別適于制備選擇型雙鏈結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明進一步涉及當(dāng)導(dǎo)入植物有機體(或細(xì)胞、組織、器官或從其得到的繁殖材料)時引起ε-環(huán)化酶降低的雙鏈RNA分子(dsRNA分子)。
在上下文中，降低ε-環(huán)化酶(ε-環(huán)化酶dsRNA)表達的雙鏈RNA分子優(yōu)選地包含a)含有至少基本上與至少部分有意-RNA ε-環(huán)化酶轉(zhuǎn)錄本相同的核糖核苷酸序列的有意-RNA鏈，和b)基本上，優(yōu)選地完全，與a)中RNA有意鏈互補的反義-RNA鏈。
關(guān)于dsRNA分子，ε-環(huán)化酶核酸序列或相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄本優(yōu)選地是指SEQID No.4的序列或其部分。
“基本上相同”意思是指與ε-環(huán)化酶靶序列相比，dsRNA序列也可以具有插入、缺失或單一位點突變，而且引起表達有效降低。抑制性dsRNA的有意鏈和ε-環(huán)化酶基因至少部分有意-RNA轉(zhuǎn)錄本之間的同源性或反義鏈和ε-環(huán)化酶基因互補鏈之間的同源性優(yōu)選地為至少75％，特別優(yōu)選地為80％，非常優(yōu)選地為至少90％，最優(yōu)選地為100％。
為了引起ε-環(huán)化酶表達有效降低，dsRNA和ε-環(huán)化酶基因轉(zhuǎn)錄本之間100％的序列一致性不是絕對必須的。因此，該方法允許由于遺傳突變、多態(tài)性或進化多樣性而存在的序列差異是有利的。因此，例如利用產(chǎn)生于第一有機體ε-環(huán)化酶序列的dsRNA抑制第二有機體中ε-環(huán)化酶的表達是可能的。為了該目的，dsRNA優(yōu)選地包含與保守區(qū)域?qū)?yīng)的ε-環(huán)化酶基因轉(zhuǎn)錄本的序列區(qū)域。所述保守區(qū)域可以容易地來自于序列比較。
此外，“基本上相同的”dsRNA也可以定義為能夠與部分ε-環(huán)化酶基因轉(zhuǎn)錄本雜交的核酸序列，例如在400mM NaCl、40mM PIPES pH 6.4、1mM EDTA中50℃或70℃雜交12至16小時)。
“基本上互補”意思是與有意-RNA鏈的互補鏈相比，反義-RNA鏈也可以具有插入、缺失和單一位點突變。反義-RNA鏈和有意-RNA鏈互補鏈之間的同源性優(yōu)選地為至少80％，特別優(yōu)選地為至少90％，非常特別優(yōu)選地為至少95％，最優(yōu)選地為100％。
利用被導(dǎo)入所述植物并在所述植物中轉(zhuǎn)錄成ε-環(huán)化酶dsRNA的核酸構(gòu)建體進行用ε-環(huán)化酶dsRNA轉(zhuǎn)化植物是優(yōu)選的。
因此本發(fā)明還涉及這樣的核酸構(gòu)建體，該核酸構(gòu)建體可轉(zhuǎn)錄成a)含有至少基本上與至少部分有意-RNA ε-環(huán)化酶轉(zhuǎn)錄本相同的核糖核苷酸序列的有意-RNA鏈，和b)基本上，優(yōu)選地完全，與a)中RNA有意鏈互補的反義-RNA鏈。
這些核酸構(gòu)建體也稱為表達盒或下文中的表達載體。
在另一個實施方案中，ε-環(huán)化酶dsRNA包括a)含有至少基本上與至少部分ε-環(huán)化酶基因啟動子區(qū)的有意-RNA轉(zhuǎn)錄本相同的核糖核苷酸序列的有意-RNA鏈，和b)基本上，優(yōu)選地完全，與a)中RNA有意鏈互補的反義-RNA鏈。
優(yōu)選地，ε-環(huán)化酶啟動子區(qū)是指SEQ ID No.13的序列或其部分。
優(yōu)選地用于植物轉(zhuǎn)化的相應(yīng)核酸構(gòu)建體包含a)基本上與至少部分ε-環(huán)化酶基因啟動子序列相同的有意-DNA鏈，和b)基本上，優(yōu)選地完全，與a)中DNA有意鏈互補的反義-DNA鏈。
特別優(yōu)選地利用以下部分序列制備用于降低，特別是用于降低萬壽菊ε-環(huán)化酶活性的ε-環(huán)化酶dsRNA序列且特別是其表達盒SEQ ID No.6ε-環(huán)化酶5’-末端區(qū)域的有意片段SEQ ID No.7ε-環(huán)化酶5’-末端區(qū)域的反義片段SEQ ID No.8ε-環(huán)化酶3’-末端區(qū)域的有意片段SEQ ID No.9ε-環(huán)化酶3’-末端區(qū)域的反義片段
SEQ ID No.13ε-環(huán)化酶啟動子的有意片段SEQ ID No.14ε-環(huán)化酶啟動子的反義片段dsRNA可以由一條或多條多核糖核苷酸鏈組成。為了實現(xiàn)相同的目的，當(dāng)然將多種含有上面所定義的核糖核苷酸序列片段之一的單獨dsRNA分子導(dǎo)入細(xì)胞或有機體也是可行的。
雙鏈dsRNA結(jié)構(gòu)可以由兩條互補的、單獨的RNA鏈形成，優(yōu)選地由單一一條自身互補的RNA鏈形成。在后一情況下，有意-RNA和反義-RNA鏈優(yōu)選地以反向重復(fù)序列彼此共價連接。
例如在專利WO 99/53050中所述，dsRNA也可以含有通過連接序列(“接頭”；例如內(nèi)含子)將有意和反義鏈連接的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。自身互補dsRNA結(jié)構(gòu)是優(yōu)選的，這是因為它們只需要表達一條RNA序列并且它們總含有等摩爾比例的互補RNA鏈。連接序列優(yōu)選地是內(nèi)含子(例如馬鈴薯ST-LS1基因內(nèi)含子；Vancanneyt GF等(1990)Mol Gen Genet 220(2)245-250)。
編碼dsRNA的核酸序列可以進一步包括一些元件，例如轉(zhuǎn)錄終止信號或多腺苷酸化信號。
然而，如果dsRNA直接針對ε-環(huán)化酶啟動子序列，優(yōu)選地為不包含任何轉(zhuǎn)錄終止信號或多腺苷酸化信號。這能夠使dsRNA滯留在細(xì)胞核中并阻止dsRNA散布于植物體各處。
如果dsRNA的兩條鏈在細(xì)胞或植物體內(nèi)組裝，可以下述方式進行，例如a)用包含兩個表達盒的載體轉(zhuǎn)化細(xì)胞或植物，b)用兩個載體，一個含有具有有意鏈的表達盒，另一個含有具有反義鏈的表達盒，共轉(zhuǎn)化細(xì)胞或植物。
c)兩個不同植物品系雜交，其中所述不同植物品系一個含有具有有意鏈的表達盒，另一個含有具有反義鏈的表達盒。
可以在細(xì)胞外或細(xì)胞內(nèi)起始RNA雙鏈體的形成。
可以在體內(nèi)或體外合成dsRNA。為了該目的，將編碼dsRNA的DNA序列置于至少一個遺傳控制元件(例如啟動子)控制下的表達盒中是可能的。多聚腺苷酸化作用是非必需的，也不需要任何存在以起始翻譯的元件。MPdsRNA表達盒優(yōu)選地存在于轉(zhuǎn)化構(gòu)建體或轉(zhuǎn)化載體上。
在一個優(yōu)選的實施方案中，使用了其花具有最低ε-環(huán)化酶表達率的經(jīng)遺傳修飾植物。
這是優(yōu)選地通過以花特異，特別優(yōu)選地是以花瓣特異的方式降低ε-環(huán)化酶活性實現(xiàn)的。
在上述特別優(yōu)選的實施方案中，這是通過在花特異啟動子或，甚至更優(yōu)選的在花瓣特異啟動子控制下轉(zhuǎn)錄ε-環(huán)化酶dsRNA序列實現(xiàn)的。
因此，在一個特別優(yōu)選的實施方案中，dsRNA的表達是由在花特異啟動子的功能控制下，特別優(yōu)選地是在SEQ ID No.10所述的啟動子或其功能等同部分控制下的表達構(gòu)建體起始進行的。
為了該目的優(yōu)選地將編碼ε-環(huán)化酶dsRNA反義鏈和/或有意鏈或者編碼所述dsRNA的自身互補鏈的表達盒插入轉(zhuǎn)化載體并利用上述方法將其導(dǎo)入植物細(xì)胞。對于本發(fā)明的目的穩(wěn)定插入基因組是有利的。
可以以盡可能使每個細(xì)胞至少一個拷貝的量將dsRNA導(dǎo)入細(xì)胞。根據(jù)需要，較大量(例如每個細(xì)胞至少5、10、100、500或1000個拷貝)可以引起更有效的降低。
dsRNA方法，利用反義RNA和VIGS(病毒誘導(dǎo)的基因沉默)方法共抑制也稱為轉(zhuǎn)錄后基因沉默(PTGS)或轉(zhuǎn)錄基因沉默(TGS)。
在本發(fā)明方法優(yōu)選的實施方案中，所使用的植物選自毛茛科(Ranunculaceae)、小檗科(Berberidaceae)、罌粟科(Papaveraceae)、大麻科(Cannabaceae)、薔薇科(Rosaceae)、豆科(Fabaceae)、亞麻科(Linaceae)、葡萄科(Vitaceae)、蕓苔科(Brassicaceae)、葫蘆科(Cucurbitaceae)、報春花科(Primulaceae)、石竹科(Caryophyllaceae)、莧科(Amaranthaceae)、龍膽科(Gentianaceae)、牻牛兒苗科(Geraniaceae)、忍冬科(Caprifoliaceae)、木犀科(Oleaceae)、旱金蓮科(Tropaeolaceae)、茄科(Solanaceae)、玄參科(Scrophulariaceae)、菊科(Asteraceae)、百合科(Liliaceae)、石蒜科(Amaryllidaceae)、禾本科(Poaceae)、蘭科(Orchidaceae)、錦葵科(Malvaceae)、木蘭科(Illiaceae)或唇形科(Lamiaceae)。特別優(yōu)選的是選自以下植物屬的植物金盞菊屬(Marigold)、萬壽菊屬(Tagetes)、金合歡屬(Acacia)、烏頭屬(Aconitum)、側(cè)金盞花屬(Adonis)、阿尼菊屬(Arnica)、耬斗菜屬(Aquilegia)、紫菀屬(Aster)、黃芪屬(Astragalus)、紫葳屬(Bignonia)、金盞花屬(Calendula)、驢蹄草屬(Caltha)、風(fēng)鈴草屬(Campanula)、美人蕉屬(Canna)、矢車菊屬(Centaurea)、桂竹香屬(Cheiranthus)、茼蒿屬(Chrysanthemum)、柑桔屬(Citrus)、還陽參屬(Crepis)、番紅花屬(Crocus)、南瓜屬(Curcurbita)、金雀兒屬(Cytisus)、鳳凰木屬(Delonia)、翠雀屬(Delphinium)、石竹屬(Dianthus)、異果菊屬(Dimorphotheca)、多榔菊屬(Doronicum)、花菱草屬(Eschscholtzia)、連翹屬(Forsythia)、Fremontia、勛章菊屬(Gazania)、斷腸草屬(Gelsemium)、染料木屬(Genista)、龍膽屬(Gentiana)、老鸛草屬(Geranium)、扶郎花屬(Gerbera)、水楊梅屬(Geum)、銀樺屬(Grevilla)、堆心菊屬(Helenium)、向日葵屬(Helianthus)、獐耳細(xì)辛屬(Hepatica)、獨活屬(Heracleum)、木槿屬(Hibiscus)、賽菊芋屬(Heliopsis)、金絲桃屬(Hypericum)、貓兒菊屬(Hypochoeris)、鳳仙花屬(Impatiens)、鳶尾屬(Iris)、藍花楹屬(Jacaranda)、棣棠屬(Kerria)、毒豆屬(Laburnum)、香豌豆屬(Lathyrus)、獅齒菊屬(Leontodon)、百合屬(Lilium)、亞麻屬(Linum)、百脈根屬(Lotus)、番茄屬(Lycopersicon)、珍珠菜屬(Lysimachia)、合囊蕨屬(Maratia)、苜蓿屬(Medicago)、溝酸漿屬(Mimulus)、水仙屬(Narcissus)、月見草屬(Oenothera)、木犀屬(Osmanthus)、碧冬茄屬(Petunia)、石楠屬(Photinia)、酸漿屬(Physalis)、牧根草屬(Phyteuma)、委陵菜屬(Potentilla)、火棘屬(Pyracantha)、毛茛屬(Ranunculus)、杜鵑花屬(Rhododendron)、薔薇屬(Rosa)、金光菊屬(Rudbeckia)、千里光屬(Senecio)、蠅子草屬(Silene)、松香草屬(Silphium)、白芥屬(Sinapsis)、花楸屬(Sorbus)、鷹爪豆屬(Spartium)、黃鐘花屬(Tecoma)、蝴蝶草屬(Torenia)、婆羅門參屬(Tragopogon)、金蓮花屬(Trollius)、旱金蓮屬(Tropaeolum)、郁金香屬(Tulipa)、款冬屬(Tussilago)、荊豆屬(Ulex)、堇菜屬(Viola)或百日草屬(Zinnia)。
非常特別優(yōu)選的是選自以下植物物種的植物金盞菊、萬壽菊或孔雀草。
本發(fā)明制備玉米黃素和/或其生物合成中間體和/或次級產(chǎn)物的方法中，培養(yǎng)經(jīng)遺傳修飾植物，下文中也稱為轉(zhuǎn)基因植物，的步驟之后優(yōu)選地為收獲植物并從植物，特別優(yōu)選地為從植物花瓣，分離玉米黃素和/或其生物合成中間體和/或次級產(chǎn)物。
轉(zhuǎn)基因植物以本身已知的方式生長于營養(yǎng)培養(yǎng)基中并如前所述進行收獲。
以本身已知的方式從收獲的花瓣中分離玉米黃素和/或其生物合成中間體和/或次級產(chǎn)物，例如通過干燥和隨后的提取以及，根據(jù)需要，進一步化學(xué)或物理純化過程，例如沉淀方法、結(jié)晶法、諸如精餾法的熱分離方法或諸如層析的物理分離方法。例如，通過諸如丙酮、己烷、醚或甲基叔丁基醚的有機溶劑優(yōu)選地從花瓣中分離玉米黃素和/或生物合成中間體和/或其次級產(chǎn)物。
其它分離酮類胡蘿卜素，特別是從花瓣分離酮類胡蘿卜素，的方法描述于，例如，Egger和Kleinig(Phytochemistry(1967)6，437-440)以及Egger(Phytochemistry(1965)4，609-618)中。
玉米黃素生物合成中間體和/或其次級產(chǎn)物優(yōu)選地選自番茄紅素、β-胡蘿卜素、蝦青素、角黃素、β-胡蘿卜素-4-酮、3-羥基β-胡蘿卜素-4-酮、3’-羥基β-胡蘿卜素-4-酮、金盞花玉紅質(zhì)和金盞花黃質(zhì)、堇菜黃素、花藥黃質(zhì)、新黃素、辣椒紅素、辣椒紅。
玉米黃素生物合成中間體是指生物合成圖解中玉米黃素生物化學(xué)途徑中的類胡蘿卜素。所述中間體優(yōu)選地為番茄紅素和/或β-胡蘿卜素。
玉米黃素生物合成次級產(chǎn)物是指生物合成圖解中來源于玉米黃素的類胡蘿卜素，例如花藥黃質(zhì)、堇菜黃素和新黃素。然而，具體而言，玉米黃素生物合成次級產(chǎn)物也指例如通過將其它酶活性導(dǎo)入植物而生物合成的玉米黃素及其中間體來源的那些類胡蘿卜素。
例如，通過在經(jīng)遺傳修飾植物中引入酮酶活性，如通過將編碼酮酶的核酸導(dǎo)入親本植物，可能使經(jīng)遺傳修飾植物由β-類胡蘿卜素途徑的類胡蘿卜素，如β-胡蘿卜素或玉米黃素，起始產(chǎn)生酮類胡蘿卜素諸如蝦青素、角黃素、β-胡蘿卜素-4-酮、3-羥基β-胡蘿卜素-4-酮、3’-羥基β-胡蘿卜素-4-酮、金盞花玉紅質(zhì)或金盞花黃質(zhì)。
因此，玉米黃素生物合成次級產(chǎn)物也特別是指蝦青素、角黃素、β-胡蘿卜素-4-酮、3-羥基β-胡蘿卜素-4-酮、3’-羥基β-胡蘿卜素-4-酮、金盞花玉紅質(zhì)或金盞花黃質(zhì)。
特別優(yōu)選的玉米黃素次級產(chǎn)物是蝦青素。
本發(fā)明還涉及制備經(jīng)遺傳修飾植物的方法，其中含有上述核酸構(gòu)建體的表達盒被導(dǎo)入親本植物。
表達盒含有調(diào)節(jié)信號，即控制宿主細(xì)胞中編碼序列表達的調(diào)節(jié)性核酸序列。在一個優(yōu)選的實施方案中，表達盒含有上游啟動子，即在編碼序列的5’端，和下游多腺苷酸化信號，即在3’端，并且，根據(jù)需要，還含有其它定位于5’端和3’端之間可操作連接于編碼序列的用于至少一個上述基因的調(diào)節(jié)元件?？刹僮鬟B接意思是指依次排列啟動子、編碼序列、終止子以及，根據(jù)需要，以每個調(diào)節(jié)元件在試圖表達編碼序列時均能夠行使其功能方式連接的其它調(diào)節(jié)元件。
下面以舉例的方式描述了優(yōu)選的用于植物的核酸構(gòu)建體、表達盒和載體以及產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的方法，以及轉(zhuǎn)基因植物本身。
優(yōu)選地用于可操作連接的序列(但不限于此)是靶向性序列以保證亞細(xì)胞定位于質(zhì)外體、液泡、質(zhì)體、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)、細(xì)胞核、油質(zhì)體或其它腔隙中，以及是翻譯增強子如來自煙草花葉病毒的5’前導(dǎo)序列(Gallie等，Nucl.Acids Res.15(1987)，8693-8711)。
表達盒適當(dāng)?shù)膯幼哟篌w而言可以是能夠控制植物中外源基因表達的任意啟動子。
“組成型”啟動子是指在植物發(fā)育期間相對寬的期間內(nèi)，優(yōu)選地為植物發(fā)育期的所有時間，在多數(shù)優(yōu)選地為全部組織中保證表達的啟動子。
特別優(yōu)選地使用植物啟動子或來源于植物病毒的啟動子。所給出的特別優(yōu)選的啟動子是花椰菜花葉病毒(cauliflower mosaic virus)35S轉(zhuǎn)錄本的CaMV啟動子(Franck等(1980)Cell 21285-294；Odell等(1985)Nature313810-812；Shewmaker等(1985)Virology 140281-288；Gardner等(1986)Plant Mol Biol 6221-228)，或者19S CaMV啟動子(US 5,352,605；WO 84/02913；Benfey等(1989)EMBO J 82195-2202)。
更加適當(dāng)?shù)慕M成型啟動子是pds啟動子(Pecker等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci USA 894962-4966)或核酮糖二磷酸羧化酶加氧酶小亞基(SSU)啟動子(US 4,962,028)、豆球蛋白B啟動子(GenBank Acc.No.X03677)、農(nóng)桿菌屬(agrobacterium)胭脂堿合酶啟動子、TR雙啟動子、農(nóng)桿菌屬OCS(章魚堿合酶)啟動子、遍在蛋白啟動子(Holtorf S等(1995)Plant Mol Biol29637-649)遍在蛋白1啟動子(Christensen等(1992)Plant Mol Biol18675-689；Bruce等(1989)Proc Natl Acad Sci USA 869692-9696)、Smas啟動子、肉桂醇脫氫酶啟動子(US 5,683,439)、液泡ATP酶亞基啟動子或來自小麥的富含脯氨酸的蛋白質(zhì)啟動子(WO 91/13991)、Pnit啟動子(Y07648.L，Hillebrand等(1998)，Plant.Mol.Biol.36，89-99，Hillebrand等(1996)，Gene，170，197-200)，以及其它為技術(shù)人員所熟知的其在植物中組成型表達基因的啟動子。
表達盒也可以含有化學(xué)可誘導(dǎo)啟動子(綜述文章Gatz等(1997)AnnuRev Plant Physiol Plant Mol Biol 4889-108)，通過化學(xué)可誘導(dǎo)啟動子能夠在特定時間控制植物中酮酶基因的表達。同樣能夠使用該種類型的其它啟動子，例如PRP1啟動子(Ward等(1993)Plant Mol Biol 22361-366)、水楊酸可誘導(dǎo)啟動子(WO 95/19443)、苯磺酰胺可誘導(dǎo)啟動子(EP 0 388 186)、四環(huán)素可誘導(dǎo)啟動子(Gatz等(1992)Plant J 2397-404)、脫落酸可誘導(dǎo)啟動子(EP 0 335 528)或者乙醇-或環(huán)己酮-可誘導(dǎo)啟動子(WO 93/21334)。
更加優(yōu)選的啟動子是那些通過生物或非生物脅迫誘導(dǎo)的啟動子，例如PRP1基因的病原體-可誘導(dǎo)啟動子(Ward等(1993)Plant Mol Biol22361-366)、熱誘導(dǎo)的番茄hsp70或hsp80啟動子(US 5,187,267)、冷誘導(dǎo)的馬鈴薯α-淀粉酶啟動子(WO 96/12814)、光誘導(dǎo)的PPDK啟動子或創(chuàng)傷誘導(dǎo)的pinII啟動子(EP375091)。
病原體-可誘導(dǎo)的啟動子包括那些由于病原體攻擊而誘導(dǎo)基因的啟動子，所述基因例如PR蛋白質(zhì)基因、SAR蛋白質(zhì)基因、β-1，3-葡聚糖酶基因、幾丁質(zhì)酶基因等等(例如Redolfi等(1983)Neth J Plant Pathol 89245-254；Uknes等(1992)The Plant Cell 4645-656；Van Loon(1985)Plant Mol Viral4111-116；Marineau等(1987)Plant Mol Biol 9335-342；Matton等(1987)Molecular Plant-Microbe Interactions 2325-342；Somssich等(1986)ProcNatl Acad Sci USA 832427-2430；Somssich等(1988)Mol Gen Genetics293-98；Chen等(1996)Plant J 10955-966；Zhang和Sing(1994)Proc NatlAcad Sci USA 912507-2511；Warner等(1993)Plant J 3191-201；Siebertz等(1989)Plant Cell 1961-968(1989)。
作為創(chuàng)傷可誘導(dǎo)啟動子還包括諸如pinII基因啟動子(Ryan(1990)AnnRev Phytopath 28425-449；Duan等(1996)Nat Biotech 14494-498)、wun1和wun2基因啟動子(US 5,428,148)、win1和win2基因啟動子(Stanford等(1989)Mol Gen Genet 215200-208)、系統(tǒng)素啟動子(McGurl等(1992)Science 2551570-1573)、WIP1基因啟動子(Rohmeier等(1993)Plant MolBiol 22783-792；Ekelkamp等(1993)FEBS Letters 32373-76)、MPI基因啟動子(Corderok等(1994)The Plant J 6(2)141-150)等等。
其它適當(dāng)?shù)膯幼拥膶嵗秊楣麑嵆墒焯禺惖膯幼?，例如番茄果實成熟特異的啟動?WO 94/21794、EP 409 625)。因為一些組織的形成天然依賴于發(fā)育，所以發(fā)育依賴的啟動子包括一些組織特異性啟動子。
其它特別優(yōu)選的啟動子是那些保證在植物組織或部分例如發(fā)生酮類胡蘿卜素或其前體生物合成的部分中表達的啟動子。優(yōu)選的實例是具有花藥、子房、花瓣、萼片、花、葉子、蒂和根以及其組合特異性的啟動子。
對塊莖、貯藏根或根特異的啟動子的實例為patatin啟動子I類(B33)或馬鈴薯組織蛋白酶D抑制劑啟動子。
葉特異性啟動子的實例為馬鈴薯胞質(zhì)FBP酶啟動子(WO 97/05900)、核酮糖二磷酸羧化酶加氧酶(核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶)SSU啟動子(小亞基)或馬鈴薯ST-LSI啟動子(Stockhaus等(1989)EMBO J 82445-2451)。
花特異性啟動子的實例為八氫番茄紅素合酶啟動子(WO 92/16635)、P-rr基因啟動子(WO 98/22593)或，特別優(yōu)選地為，花特異的擬南芥菜(Arabidopsis thaliana)AP3啟動子(AL132971核苷酸區(qū)域9298-10200；Hill等(1998)Development 1251711-1721)的修飾形式AP3P。
花藥特異性啟動子的實例為5126啟動子(US 5,689,049、US 5,689,051)、glob-l啟動子或g-玉米醇溶蛋白啟動子。
其它適于在植物中表達的啟動子描述于Rogers等(1987)Meth inEnzymol 153253-277；Schardl等(1987)Gene 611-11和Berger等(1989)Proc Natl Acad Sci USA 868402-8406。
本申請中所述的所有啟動子通常能夠使雙鏈ε-環(huán)化酶核糖核酸序列在本發(fā)明的植物中表達。
在本發(fā)明方法中和本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾植物中特別優(yōu)選的是花特異啟動子。
優(yōu)選地通過將適當(dāng)?shù)膯幼尤诤嫌谏鲜鲛D(zhuǎn)錄雙鏈ε-環(huán)化酶核糖核酸序列的核酸序列上，且優(yōu)選地融合于被插入到啟動子和核酸序列之間并編碼質(zhì)體特異轉(zhuǎn)運肽的核酸序列上，并且通過如描述于T.Maniatis、E.F.Fritsch和J.Sambrook，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY(1989)，以及T.J.Silhavy、M.L.Berman和L.W.Enquist，Experiments with GeneFusions，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY(1984)，以及Ausubel，F(xiàn).M.等，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Assoc.和Wiley-Interscience(1987)中的常規(guī)重組和克隆技術(shù)融合多腺苷酸化信號產(chǎn)生表達盒。
優(yōu)選插入的編碼質(zhì)體轉(zhuǎn)運肽的核酸確保定位于質(zhì)體且特別是定位于色質(zhì)體。
特別優(yōu)選的轉(zhuǎn)運肽來自于煙草(Nicotiana tabacum)質(zhì)體轉(zhuǎn)酮酶或另一種轉(zhuǎn)運肽(例如核酮糖二磷酸羧化酶加氧酶小亞基(rbcS)的轉(zhuǎn)運肽或鐵氧還蛋白NADP氧化還原酶的轉(zhuǎn)運肽，以及異戊烯焦磷酸異構(gòu)酶2的轉(zhuǎn)運肽)或其功能等同物。
特別優(yōu)選的是在三個閱讀框內(nèi)作為在NcoI切割位點中具有ATG密碼子的KpnI/BamHI片段的煙草質(zhì)體轉(zhuǎn)酮酶質(zhì)體轉(zhuǎn)運肽三個盒的核酸序列pTP09KpnI_GGTACCATGGCGTCTTCTTCTTCTCTCACTCTCTCTCAAGCTATCCTCTCTCGTTCTGTCCCTCGCCATGGCTCTGCCTCTTCTTCTCAACTTTCCCCTTCTTCTCTCACTTTTTCCGGCCTTAAATCCAATCCCAATATCACCACCTCCCGCCGCCGTACTCCTTCCTCCGCCGCCGCCGCCGCCGTCGTAAGGTCACCGGCGATTCGTGCCTCAGCTGCAACCGAAACCATAGAGAAAACTGAGACTGCGGGATCC_BamHIpTP10KpnI_GGTACCATGGCGTCTTCTTCTTCTCTCACTCTCTCTCAAGCTATCCTCTCTCGTTCTGTCCCTCGCCATGGCTCTGCCTCTTCTTCTCAACTTTCCCCTTCTTCTCTCACTTTTTCCGGCCTTAAATCCAATCCCAATATCACCACCTCCCGCCGCCGTACTCCTTCCTCCGCCGCCGCCGCCGCCGTCGTAAGGTCACCGGCGATTCGTGCCTCAGCTGCAACCGAAACCATAGAGAAAACTGAGACTGCGCTGGATCC_BamHIpTP11KpnI_GGTACCATGGCGTCTTCTTCTTCTCTCACTCTCTCTCAAGCTATCCTCTCTCGTTCTGTCCCTCGCCATGGCTCTGCCTCTTCTTCTCAACTTTCCCCTTCTTCTCTCACTTTTTCCGGCCTTAAATCCAATCCCAATATCACCACCTCCCGCCGCCGTACTCCTTCCTCCGCCGCCGCCGCCGCCGTCGTAAGGTCACCGGCGATTCGTGCCTCAGCTGCAACCGAAACCATAGAGAAAACTGAGACTGCGGGGATCC_BamHI質(zhì)體轉(zhuǎn)運肽的其它實例是擬南芥菜質(zhì)體異戊烯焦磷酸異構(gòu)酶2(IPP-2)的轉(zhuǎn)運肽和豌豆核酮糖二磷酸羧化酶小亞基(rbcS)的轉(zhuǎn)運肽(Guerineau，F(xiàn)、Woolston，S、Brooks，L、Mullineaux，P(1988)，將外源蛋白靶向色質(zhì)體的表達盒，Nucl.Acids Res.1611380)。
本發(fā)明的核酸能夠合成制備或天然獲得或者可以包含合成或天然核酸成分的混合物，并且含有來自不同有機體的多種異源基因。
終止子的實例是35S終止子(Guerineau等(1988)Nucl Acids Res.1611380)、nos終止子(Depicker A、Stachel S、Dhaese P、Zambryski P、Goodman HM，胭脂堿合酶轉(zhuǎn)錄本圖譜和DNA序列，J Mol Appl Genet.1982；1(6)561-73)或ocs終止子(Gielen，J、de Beuckeleer、M，Seurinck，J、Debroek，H、de Greve，H、Lemmers，M、van Montagu，M、Schell，J(1984)，根癌農(nóng)桿菌質(zhì)粒pTiAch5的TL-DNA的全長序列，EMBO J.3835-846)。
而且，使用提供適當(dāng)?shù)南拗菩郧懈钗稽c或去除冗余DNA或限制性切割位點的操作法是可能的。關(guān)于插入、缺失或替代，例如轉(zhuǎn)換或顛換，用于體外誘變、引物修復(fù)、限制性酶切或連接是可能的。
使用適當(dāng)?shù)牟僮鞣椒ǎT如限制性酶切、回切(chewing back)或填充突出端形成鈍末端，以提供連接片段的互補末端是可能的。
優(yōu)選的多腺苷酸化信號是植物多腺苷酸化信號，優(yōu)選地為那些基本上符合根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)T-DNA多腺苷酸化信號的多腺苷酸化信號，特別是Ti質(zhì)粒pTiACH5的T-DNA基因3(章魚堿合酶)(Gielen等，EMBO J.3(1984)，835 ff)的多腺苷酸化信號或其功能等同物。
將核酸序列轉(zhuǎn)移進入植物基因組稱為轉(zhuǎn)化。
為了該目的，使用本身已知的方法從瞬時或穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的植物組織或植物細(xì)胞進行植物的轉(zhuǎn)化和再生是可能的。
轉(zhuǎn)化植物的適當(dāng)方法是通過聚乙二醇誘導(dǎo)DNA攝入的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法、稱為粒子轟擊法的使用基因槍的生物彈射擊(biolistic)法、電穿孔、干燥胚在含有DNA的溶液中孵育、微注射和上述農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium)介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移。所述方法描述于，例如B.Jenes等，基因轉(zhuǎn)移技術(shù)，在Transgenic Plants，Vol.1，Engineering and Utilization(S.D.Kung和R.Wu編輯，Academic Press)(1993)一書中的128-143頁和Potrykus，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Molec.Biol.42(1991)，205-225。
欲表達的構(gòu)建體優(yōu)選地克隆入適于轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌的載體中，例如pBin19(Bevan等，Nucl.Acids Res.12(1984)，8711)或特別優(yōu)選的是pSUN2、pSUN3、pSUN4或pSUN5(WO 02/00900)。
用表達盒轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌能夠用于以已知的方法轉(zhuǎn)化植物，例如在農(nóng)桿菌溶液中浸浴創(chuàng)傷的葉子或葉片并隨后在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中培養(yǎng)。
對于優(yōu)選地產(chǎn)生經(jīng)遺傳修飾植物，下文也稱為轉(zhuǎn)基因植物，將融合表達盒克隆入適于轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌的載體，例如pBin19或，特別是，pSUN5。
然后用此種載體轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌能夠以已知的方式用于轉(zhuǎn)化植物，特別是作物植物，例如通過在農(nóng)桿菌溶液中浸浴創(chuàng)傷的葉子或葉片并隨后在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中培養(yǎng)。
通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物的方法尤其公開于F.F.White，高等植物中用于基因轉(zhuǎn)移的載體；在Transgenic Plants，Vol.1，Engineering and Utilization(S.D.Kung和R.Wu編輯，Academic Press，1993)一書中的第15-38頁。含有整合入表達盒以表達編碼酮酶的基因的轉(zhuǎn)基因植物能夠以已知的方式從創(chuàng)傷葉子或葉片的轉(zhuǎn)化細(xì)胞再生形成。
為了用雙鏈ε-環(huán)化酶核酸序列轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，將表達盒整合并插入重組載體，該重組載體的載體DNA含有額外的功能調(diào)節(jié)信號，例如用于復(fù)制或整合的序列。適當(dāng)?shù)妮d體尤其描述于“Methods in Plant MolecularBiology and Biotechnology”(CRC Press)，6/7章，71-119頁(1993)。
利用上面引用的重組和克隆技術(shù)，能夠?qū)⒈磉_盒克隆入使其能夠在諸如大腸桿菌(E.coli)中復(fù)制的適當(dāng)?shù)妮d體中。適當(dāng)?shù)目寺≥d體尤其為pJIT117(Guerineau等(1988)Nucl.Acids Res.1611380)、pBR322、pUC系列、M13mp系列和pACYC184。在大腸桿菌和農(nóng)桿菌中均能夠復(fù)制的雙元載體是特別優(yōu)選的。
本發(fā)明進一步涉及與野生型相比，具有由于雙鏈ε-環(huán)化酶核糖核酸序列引起降低的ε-環(huán)化酶活性的經(jīng)遺傳修飾植物。
如上所述，在特定的實施方案中，經(jīng)遺傳修飾植物含有具雙鏈結(jié)構(gòu)區(qū)域并在所述區(qū)域內(nèi)含有以下核酸序列的RNA，所述核酸序列
a)與所述植物固有的至少部分ε-環(huán)化酶轉(zhuǎn)錄本相同和/或b)與所述植物固有的至少部分ε-環(huán)化酶啟動子序列相同。
經(jīng)遺傳修飾植物優(yōu)選地選自毛茛科、小檗科、罌粟科、大麻科、薔薇科、豆科、亞麻科、葡萄科、蕓苔科、葫蘆科、報春花科、石竹科、莧科、龍膽科、牻牛兒苗科、忍冬科、木犀科、旱金蓮科、茄科、玄參科、菊科、百合科、石蒜科、禾本科、蘭科、錦葵科、木蘭科或唇形科。
特別優(yōu)選的經(jīng)遺傳修飾植物是選自以下植物屬的植物金盞菊屬、萬壽菊屬、金合歡屬、烏頭屬、側(cè)金盞花屬、阿尼菊屬、耬斗菜屬、紫菀屬、黃芪屬、紫葳屬、金盞花屬、驢蹄草屬、風(fēng)鈴草屬、美人蕉屬、矢車菊屬、桂竹香屬、茼蒿屬、柑桔屬、還陽參屬、番紅花屬、南瓜屬、金雀兒屬、鳳凰木屬、翠雀屬、石竹屬、異果菊屬、多榔菊屬、花菱草屬、連翹屬、Fremontia、勛章菊屬、斷腸草屬、染料木屬、龍膽屬、老鸛草屬、扶郎花屬、水楊梅屬、銀樺屬、堆心菊屬、向日葵屬、獐耳細(xì)辛屬、獨活屬、木槿屬、賽菊芋屬、金絲桃屬、貓兒菊屬、鳳仙花屬、鳶尾屬、藍花楹屬、棣棠屬、毒豆屬、香豌豆屬、獅齒菊屬、百合屬、亞麻屬、百脈根屬、番茄屬、珍珠菜屬、合囊蕨屬、苜蓿屬、溝酸漿屬、水仙屬、月見草屬、木犀屬、碧冬茄屬、石楠屬、酸漿屬、牧根草屬、委陵菜屬、火棘屬、毛茛屬、杜鵑花屬、薔薇屬、金光菊屬、千里光屬、蠅子草屬、松香草屬、白芥屬、花楸屬、鷹爪豆屬、黃鐘花屬、蝴蝶草屬、婆羅門參屬、金蓮花屬、旱金蓮屬、郁金香屬、款冬屬、荊豆屬、堇菜屬或百日草屬。
非常特別優(yōu)選的遺傳修飾選自以下植物屬金盞菊、萬壽菊或孔雀草。
此外本發(fā)明還涉及轉(zhuǎn)基因植物，涉及其繁殖材料并涉及其植物細(xì)胞、組織或部分，尤其是其花瓣。
如上述的經(jīng)遺傳修飾植物可以用于制備玉米黃素和/或其生物合成中間體和/或次級產(chǎn)物，特別是用于制備番茄紅素、β-胡蘿卜素、蝦青素、角黃素、β-胡蘿卜素-4-酮、3-羥基β-胡蘿卜素-4-酮、3’-羥基β-胡蘿卜素-4-酮、金盞花玉紅質(zhì)或金盞花黃質(zhì)，并且特別是用于制備蝦青素。
與野生型相比，本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾植物具有含量增加的至少一種選自玉米黃素和/或生物合成中間體和/或其次級產(chǎn)物的類胡蘿卜素。
在這種情況下，增加的含量也是指已經(jīng)被引起變化的酮類胡蘿卜素、或蝦青素的含量。
具有含量增加的玉米黃素和/或其生物合成中間體和/或次級產(chǎn)物并被人類和動物食用的經(jīng)遺傳修飾植物也可以，例如，直接或經(jīng)本身已知的加工后，用于作為食品或飼料或作為飼料添加劑和食品添加劑。經(jīng)遺傳修飾植物也可以用于制備所述植物的含類胡蘿卜素提取物和/或制備飼料添加劑和食品添加劑。
經(jīng)遺傳修飾植物也可以用作園藝領(lǐng)域的裝飾植物。
現(xiàn)在將通過下面的實施例，但并不限于此，闡述本發(fā)明一般實驗條件重組DNA序列分析按照Sanger的方法(Sanger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74(1977)，5463-5467)，使用Licor激光熒光DNA序列分析儀(購自MWG Biotech，Ebersbach，Germany)對重組DNA分子測序。
實施例1用于在萬壽菊中進行ε-環(huán)化酶dsRNA花特異性表達的雙鏈ε-環(huán)化酶核糖核酸序列表達盒的克隆載體的制備由ε-環(huán)化酶片段組成的反向重復(fù)轉(zhuǎn)錄本在花特異的擬南芥菜啟動子AP3(AL132971核苷酸區(qū)域9298-10200；Hill等(1998)Development 1251711-1721)的修飾形式AP3P調(diào)控下在萬壽菊中表達。
在每一情況中反向重復(fù)轉(zhuǎn)錄本包括一個正向的片段(有意片段)和一個序列完全相同的反向片段(反義片段)，這兩個片段通過功能內(nèi)含子即馬鈴薯ST-LH1基因PIV2內(nèi)含子彼此相互連接(Vancanneyt G.等(1990)Mol Gen Genet 220245-50)。
利用基因組DNA(通過標(biāo)準(zhǔn)方法從擬南芥菜分離得到)和引物PR7(SEQ ID No.15)和PR10(SEQ ID No.18)，通過PCR方法制備編碼擬南芥菜AP3啟動子(-902到+15)的cDNA。
PCR條件如下擴增編碼AP3啟動子片段(-902到+15)的DNA的PCR反應(yīng)在含有以下成分的50μl反應(yīng)混合物中進行-1μl 擬南芥菜基因組DNA(1∶100稀釋，如上述制備)-0.25mM dNTPs-0.2mM PR7(SEQ ID No.15)-0.2mM PR10(SEQ ID No.18)-5μl 10X PCR緩沖液(Stratagene)-0.25μlPfu聚合酶(Stratagene)-28.8μl蒸餾水在以下循環(huán)條件下進行PCR1X 94℃ 2分鐘35X 94℃ 1分鐘50℃ 1分鐘72℃ 1分鐘1X 72℃ 10分鐘使用標(biāo)準(zhǔn)方法將922bp擴增子克隆入PCR克隆載體pCR2.1(Invitrogen)產(chǎn)生質(zhì)粒pTAP3。pTAP3克隆序列分析證實其序列與所公開的AP3序列(AL132971，核苷酸區(qū)域9298-10200)僅存在一個插入(AL132971序列9765位點插入一個G)和一個堿基替換(AL132971序列9726位點用G替換A)(位點33用T替換G，位點55用T替換G)的不同。在不同的擴增實驗中再現(xiàn)了這些核苷酸的差別，從而代表了所用擬南芥菜植物中的核苷酸序列。
通過利用pTAP3質(zhì)粒的重組PCR方法制備了修飾形式AP3P。以PR7(SEQ ID No.15)和PR9(SEQ ID No.17)為引物擴增了10200-9771區(qū)域(擴增子A7/9)，以PR8(SEQ ID No.16)和PR10(SEQ ID No.18)為引物擴增了9526-9285區(qū)域(擴增子A8/10)。
PCR條件如下擴增編碼AP3啟動子10200-9771和9526-9285區(qū)域的DNA片段的PCR反應(yīng)在含有以下成分的50μl反應(yīng)混合物中進行-100ng AP3擴增子(上述)-0.25mM dNTPs-0.2mM PR7(SEQ ID No.15)或PR8(SEQ ID No.16)-0.2mM PR9(SEQ ID No.17)或PR10(SEQ ID No.18)-5μl 10X PCR緩沖液(Stratagene)-0.25μlPfu Taq聚合酶(Stratagene)-28.8μl蒸餾水在以下循環(huán)條件下進行PCR1X94℃ 2分鐘35X 94℃ 1分鐘50℃ 2分鐘72℃ 3分鐘1X72℃ 10分鐘重組PCR包括對25個核苷酸序列重疊的擴增子A7/9和A8/10的退火、完全形成雙鏈和隨后的擴增。從而形成AP3啟動子的修飾形式AP3P，其中已經(jīng)缺失了9670-9526位。將兩個擴增子A7/9和A8/10在17.6μl含下述成分的反應(yīng)混合物中變性(95℃5分鐘)和退火(室溫緩慢冷卻至40℃)-0.5μg A7/9-0.25μg A8/10在20μl含以下成分的反應(yīng)混合物中填補3’端(30℃30分鐘)-17.6μlA7/9和A8/10退火反應(yīng)物(如上述制備)-50μM dNTPs-2μl 1X Klenow緩沖液
-2U Klenow酶通過利用有意特異引物(PR7 SEQ ID No.15)和反義特異引物(PR10SEQ ID No.18)的PCR法擴增編碼啟動子修飾形式AP3P的核酸。PCR條件如下擴增AP3P片段的PCR反應(yīng)在50μl含以下成分的反應(yīng)混合物中進行-1μl退火反應(yīng)物(如上述制備)-0.25mM dNTPs-0.2mM PR7(SEQ ID No.15)-0.2mM PR10(SEQ ID No.18)-5μl10X PCR緩沖液(Stratagene)-0.25μl Pfu Taq聚合酶(Stratagene)-28.8μl 蒸餾水PCR在以下循環(huán)條件下進行1X 94℃ 2分鐘35X 94℃ 1分鐘50℃ 1分鐘72℃ 1分鐘1X 72℃ 10分鐘利用引物PR7，SEQ ID No.15和PR10 SEQ ID No.18的PCR擴增形成編碼啟動子修飾形式AP3P的778bp片段。將擴增子克隆入克隆載體pCR2.1(Invitrogen)中。利用引物T7和M13的序列分析反應(yīng)證實該序列與AL132971序列10200-9298區(qū)域除缺失了內(nèi)部區(qū)域9285-9526外其余是相同的。因此將該克隆用于克隆入表達載體pJIT117(Guerineau等1988，Nucl.Acids Res.1611380)。
通過從pTAP3P分離771bp SacI-HindIII片段并將其連接入SacI-HindIII-酶切的pJIT117載體進行克隆。以啟動子AP3P代替原來的啟動子d35S的克隆命名為pJAP3P。
通過利用p35SGUS INT質(zhì)粒DNA(Vancanneyt G.等(1990)Mol GenGenet 220245-50)和引物PR40(Seq ID No.20)和PR41(Seq ID No.21)的PCR方法制備含有ST-LS1基因PIV2內(nèi)含子的DNA片段。
PCR條件如下擴增ST-LS1基因PIV2內(nèi)含子序列的PCR反應(yīng)在50μl含以下成分的反應(yīng)混合物中進行-1μl p35SGUS INT-0.25mM dNTPs-0.2μM PR40(SEQ ID No.20)-0.2μM PR41(SEQ ID No.21)-5μl 10X PCR緩沖液(TAKARA)-0.25μl R Taq聚合酶(TAKARA)-28.8μl 蒸餾水PCR反應(yīng)在以下循環(huán)條件下進行1X 94℃ 2分鐘35X 94℃ 1分鐘53℃ 1分鐘72℃ 1分鐘1X 72℃ 10分鐘利用PR40和PR41的PCR擴增形成206bp的片段。利用標(biāo)準(zhǔn)方法，將擴增子克隆入PCR克隆載體pBluntII(Invitrogen)，形成克隆pBluntII-40-41。利用引物SP6的該克隆序列分析反應(yīng)證實該序列與p35SGUS INT載體的相應(yīng)序列相同。
因此該克隆用于克隆入pJAP3P載體(如上述)。
通過從pBluntII-40-41分離206bp SalI-BamHI片段并將其與SalI-BamHI酶切pJAP3P載體連接進行克隆。含有位于rbcs轉(zhuǎn)運肽3’端下游的正向ST-LS1基因PIV2內(nèi)含子的克隆命名為pJAI1并且其適于制備花特異地表達反向重復(fù)轉(zhuǎn)錄本的表達盒。
在圖2中，AP3P片段含有修飾的AP3P啟動子(771bp)，rbcs片段含有豌豆rbcS轉(zhuǎn)運肽(204bp)，內(nèi)含子片段含有馬鈴薯ST-LS1基因PIV2內(nèi)含子，并且term片段(761bp)含有CaMV多腺苷酸化信號。
實施例2用于在萬壽菊中花特異表達ε-環(huán)化酶dsRNA的反向重復(fù)表達盒的制備(直接針對ε-環(huán)化酶cDNA5’區(qū)域)利用有意特異引物(PR42 SEQ ID No.22)和反義特異引物(PR43SEQ ID No.23)通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)從萬壽菊cDNA擴增得到含有ε-環(huán)化酶cDNA(GenBank登陸號AF251016)5’-末端435bp區(qū)域的核酸。萬壽菊ε-環(huán)化酶cDNA 5’-末端435bp區(qū)域由138bp 5’-非翻譯序列(5’UTR)和對應(yīng)N末端的297bp編碼區(qū)。
為了從萬壽菊花制備總RNA，將100mg冰凍、粉碎的花轉(zhuǎn)移至反應(yīng)器中并用0.8ml Trizol緩沖液(LifeTechnologies)提取。用0.2ml氯仿提取上清。12000g離心15分鐘后，取出水相上清液并轉(zhuǎn)移至新反應(yīng)器中并用一倍體積的乙醇進行提取。用一倍體積的異丙醇沉淀RNA，用75％乙醇洗滌并將沉淀物溶于DEPC水(室溫將含1/1000體積焦碳酸二乙酯的水孵育過夜，隨后高壓滅菌)中。分光光度法測定RNA濃度。對于cDNA合成，將2.5μg總RNA在60℃變性10分鐘，冰上冷卻2分鐘，并使用cDNA試劑盒(Ready-to-go-you-prime-beads，Pharmacia Biotech)按照制造商的說明，利用反義特異引物(PR17 SEQ ID No.19)將其轉(zhuǎn)錄為cDNA。
隨后PCR反應(yīng)的條件如下擴增含ε-環(huán)化酶5’-末端435bp區(qū)域的PR42-PR43 DNA片段的PCR反應(yīng)在50μl含以下成分的反應(yīng)混合物中進行-1μl cDNA(如上述制備)-0.25mM dNTPs-0.2μM PR42(SEQ ID No.22)-0.2μM PR43(SEQ ID No.23)-5μl 10X PCR緩沖液(TAKARA)
-0.25μl R Taq聚合酶(TAKARA)-28.8μl 蒸餾水?dāng)U增含ε-環(huán)化酶5’-末端435bp區(qū)域的PR44-PR45 DNA片段的PCR反應(yīng)在50μl含以下成分的反應(yīng)混合物中進行-1μlcDNA(如上述制備)-0.25mM dNTPs-0.2μM PR44(SEQ ID No.24)-0.2μM PR45(SEQ ID No.25)-5μl10X PCR緩沖液(TAKARA)-0.25μl R Taq聚合酶(TAKARA)-28.8μl 蒸餾水PCR反應(yīng)在以下循環(huán)條件下進行1X 94℃2分鐘35X 94℃1分鐘58℃1分鐘72℃1分鐘1X 72℃10分鐘使用引物PR42和PR43的PCR擴增產(chǎn)生443bp片段，而使用引物PR44和PR45的PCR擴增產(chǎn)生444bp片段。
使用標(biāo)準(zhǔn)方法，將兩個擴增子，PR42-PR43(HindIII-SalI有意)片段和PR44-PR45(EcoRI-BamHI反義)片段，克隆入PCR-克隆載體pCR-BluntII(Invitrogen)。使用SP6引物的序列分析反應(yīng)證實在每一情況下除了所導(dǎo)入的限制性酶切位點外，序列與已公布的AF251016序列(SEQ ID No.4)完全相同。因此這些克隆被用于制備pJAI1克隆載體中的反向重復(fù)構(gòu)建體(見通過從pCR-BluntII克隆載體(Invitrogen)分離444bp PR44-PR45BamHI-EcoRI片段并將其與BamHI-EcoRI-酶切的pJAI1載體連接進行第一次克隆步驟。含有反義方向ε-環(huán)化酶5’-末端區(qū)域的克隆命名為pJAI2。連接反應(yīng)導(dǎo)致ε-環(huán)化酶5’-末端區(qū)域和CaMV多腺苷酸化信號之間的轉(zhuǎn)錄融合。
通過從pCR-BluntII克隆載體(Invitrogen)分離443bp PR42-PR43HindIII-SalI片段并將其與HindIII-SalI-酶切的pJAI2載體連接進行第二次克隆步驟。含有有意方向ε-環(huán)化酶cDNA 435bp 5’-末端區(qū)域的克隆命名為pJAI3。連接反應(yīng)形成AP3P和ε-環(huán)化酶5’-末端區(qū)域有意片段之間的轉(zhuǎn)錄融合。
利用矮牽?；蚪MDNA(按照標(biāo)準(zhǔn)方法制備)和引物PRCHRC5(SEQ ID No.42)和PRCHRC3(SEQ ID No.43)，通過擴增CHRC啟動子片段制備CHRC啟動子控制下的反向重復(fù)序列表達盒。將擴增子克隆入pCR2.1克隆載體(Invitrogen)。利用引物M13和T7對所得克隆pCR2.1-CHRC進行序列分析證實該序列與AF099501序列相同。因此該克隆可用于克隆入pJAI3表達載體。
通過從pCR2.1-CHRC分離1537bp SacI-HindIII片段并將其連接入SacI-HindIII-酶切的pJAI3載體進行克隆。含有CHRC啟動子以代替原來的AP3P啟動子的克隆命名為pJCI3。
使用雙元載體pSUN5(WO02/00900)制備用于在萬壽菊中進行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的AP3P-或CHRC-控制的反向重復(fù)轉(zhuǎn)錄本轉(zhuǎn)化的表達載體。
通過將pJAI3 2622bp SacI-XhoI片段與SacI-XhoI-酶切的pSUN5載體連接制備表達載體pS5AI3(圖3，構(gòu)建體圖譜)。
在圖3中，AP3P片段包括修飾的AP3P啟動子(771bp)，5sense片段包括有意方向的萬壽菊ε-環(huán)化酶5’區(qū)域(435bp)，intron片段包括馬鈴薯ST-LS1基因PIV2內(nèi)含子，5anti片段包括反義方向的萬壽菊ε-環(huán)化酶5’區(qū)域(435bp)并且term片段(761bp)包括CaMV多聚腺苷酸化信號。
通過將pJCI3 3394bp SacI-XhoI片段與SacI-XhoI-酶切的pSUN5載體相連接制備表達載體pS5CI3(圖4，構(gòu)建體圖譜)。
在圖4中，CHRC片段包括啟動子(1537bp)，5sense片段包括有意方向的萬壽菊ε-環(huán)化酶5’區(qū)域(435bp)，intron片段包括馬鈴薯ST-LS1基因PIV2內(nèi)含子，5anti片段包括反義方向的萬壽菊ε-環(huán)化酶5’區(qū)域(435bp)，并且term片段(761bp)包括CaMV多腺苷酸化信號。
實施例3用于在萬壽菊中花特異表達ε-環(huán)化酶dsRNA的反向重復(fù)表達盒的制備(直接針對ε-環(huán)化酶cDNA 3’區(qū)域)使用有意特異引物(PR46 SEQ ID No.26)和反義特異引物(PR47SEQ ID No.27)，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法(PCR)從萬壽菊cDNA中擴增含ε-環(huán)化酶cDNA 3’-末端區(qū)域(384bp)的核酸(GenBank登陸號AF251016)。萬壽菊ε-環(huán)化酶cDNA 3’-末端區(qū)域(384bp)包括140bp 3’-非翻譯序列(3’UTR)和244bp對應(yīng)C末端的編碼區(qū)。
如實施例2所述從萬壽菊花制備總RNA。
如實施例1所述，使用反義特異引物PR17(SEQ ID No.19)進行cDNA合成。
隨后PCR反應(yīng)的條件如下擴增含ε-環(huán)化酶3’-末端384bp區(qū)域的PR46-PR47 DNA片段的PCR反應(yīng)在50μl含以下成分的反應(yīng)混合物中進行-1μlcDNA(如上述制備)-0.25mM dNTPs-0.2μM PR46(SEQ ID No.26)-0.2μM PR47(SEQ ID No.27)-5μl10X PCR緩沖液(TAKARA)-0.25μl R Taq聚合酶(TAKARA)-28.8μl 蒸餾水?dāng)U增含ε-環(huán)化酶3’-末端384bp區(qū)域的PR48-PR49 DNA片段的PCR反應(yīng)在50μl含以下成分的反應(yīng)混合物中進行-1μl cDNA(如上述制備)-0.25mMdNTPs-0.2μMPR48(SEQ ID No.28)
-0.2μMPR49(SEQ ID No.29)-5μl 10X PCR緩沖液(TAKARA)-0.25μl R Taq聚合酶(TAKARA)-28.8μl 蒸餾水在以下循環(huán)條件下進行PCR反應(yīng)1X 94℃2分鐘35X 94℃1分鐘58℃1分鐘72℃1分鐘1X 72℃10分鐘使用SEQ ID No.26和SEQ ID No.27進行PCR擴增產(chǎn)生392bp片段，而使用SEQ ID No.28和SEQ ID No.29進行PCR擴增形成396bp片段。
使用標(biāo)準(zhǔn)方法，將兩個擴增子，PR46-PR47片段和PR48-PR49片段，克隆入PCR-克隆載體pCR-BluntII(Invitrogen)中。使用SP6引物的序列分析反應(yīng)證實在每一情況下除了所導(dǎo)入的限制性酶切位點外，其序列與所公布的AF251016序列(SEQ ID No.4)完全相同。因此這些克隆能夠用于制備pJAI1克隆載體中的反向重復(fù)構(gòu)建體(見實施例1)。通過從pCR-BluntII克隆載體(Invitrogen)分離396bp PR48-PR49BamHI-EcoRI片段并將其與BamHI-EcoRI-酶切pJAI1載體連接進行第一次克隆步驟。含有反義方向ε-環(huán)化酶3’-末端區(qū)域的克隆命名為pJAI4。該連接導(dǎo)致在ε-環(huán)化酶3’-末端區(qū)域反義片段和CaMV多腺苷酸化信號之間形成轉(zhuǎn)錄融合。
通過從pCR-BluntII克隆載體(Invitrogen)分離392bp PR46-PR47HindIII-SalI片段并將其與HindIII-SalI-酶切pJAI4載體連接進行第二次克隆步驟。含有有意方向392bpε-環(huán)化酶3’-末端區(qū)域的克隆命名為pJAI5。該連接導(dǎo)致在AP3P和ε-環(huán)化酶3’-末端區(qū)域有意片段之間形成轉(zhuǎn)錄融合。
使用雙元載體pSUN5(WO02/00900)制備用于在萬壽菊中進行農(nóng)桿菌介導(dǎo)在AP3P-控制下的反向重復(fù)轉(zhuǎn)錄本轉(zhuǎn)化的表達載體。通過將pJAI52523bp SacI-XhoI片段與SacI-XhoI-酶切的pSUN5載體連接制備表達載體pS5AI5(圖5，構(gòu)建體圖譜)。
在圖5中，AP3P片段包括修飾的AP3P啟動子(771bp)，sense片段包括有意方向的萬壽菊ε-環(huán)化酶3’區(qū)域(435bp)，intron片段包括馬鈴薯ST-LS1基因IV2內(nèi)含子，anti片段包括反義方向的萬壽菊ε-環(huán)化酶3’區(qū)域(435bp)，并且term片段(761bp)包括CaMV多腺苷酸化信號。
實施例4ε-環(huán)化酶啟動子的克隆利用基因組DNA(通過標(biāo)準(zhǔn)方法從萬壽菊，“Orangenprinz”品系，分離得到)，通過兩個獨立的克隆策略，反向PCR(采用Long等，Proc.Natl.Acad.Sci USA 9010370)和TAIL-PCR(Liu Y-G.等(1995)Plant J.8457-463)，分別分離ε-環(huán)化酶啟動子的199bp片段和312bp片段。
對于反向PCR方法，用EcoRV和RsaI在25μl反應(yīng)混合物中消化2μg基因組DNA，然后稀釋至300μl并用3U連接酶16℃重新連接過夜。使用引物PR50(SEQ ID No.30)和PR51(SEQ ID No.31)的PCR擴增產(chǎn)生在每一情況下含有為有意方向的354bpε-環(huán)化酶cDNA(GenBank登陸號AF251016)的片段，并將該片段連接于300bpε-環(huán)化酶啟動子和70bpε-環(huán)化酶cDNA 5’-末端區(qū)域(見圖6)。
PCR反應(yīng)條件如下擴增尤其是含ε-環(huán)化酶312bp啟動子片段的PR50-PR51 DNA片段的PCR反應(yīng)在含以下成分的50μl反應(yīng)混合物中進行-1μl連接混合物(如上述制備)-0.25mM dNTPs-0.2μM PR50(SEQ ID No.30)-0.2μM PR51(SEQ ID No.31)-5μl 10X PCR緩沖液(TAKARA)-0.25μl R Taq聚合酶(TAKARA)-28.8μl 蒸餾水在以下循環(huán)條件下進行PCR反應(yīng)1X 94℃2分鐘35X 94℃1分鐘53℃1分鐘72℃1分鐘1X 72℃10分鐘使用引物PR50和PR51的PCR擴增反應(yīng)產(chǎn)生含有尤其是ε-環(huán)化酶312bp啟動子片段的734bp片段(圖6)。
使用標(biāo)準(zhǔn)方法，將擴增子克隆入PCR-克隆載體pCR2.1(Invitrogen)。使用引物M13和T7進行測序反應(yīng)產(chǎn)生序列SEQ ID No.11。在獨立的擴增實驗中重新產(chǎn)生該序列并因此代表所使用的萬壽菊“Orangenprinz”品系中的核酸序列。
對于TAIL-PCR方法，進行三個連續(xù)的PCR反應(yīng)，每個反應(yīng)使用不同的基因特異引物(巢式引物)。
在20μl含以下成分的反應(yīng)混合物中進行TAIL1-PCR-1ng 基因組DNA(如上述制備)-0.2mM每種dNTP-0.2μM PR60(SEQ ID No.32)-0.2μM AD1(SEQ ID No.35)-2μl 10X PCR緩沖液(TAKARA)-0.5μl R Taq聚合酶(TAKARA)-加至20μl蒸餾水在上下文中，AD1最初是序列(a/c/g/t)tcga(g/c)t(a/t)t(g/c)g(a/t)gtt的引物混合物。
在以下循環(huán)條件下進行PCR反應(yīng)TAIL11X 93℃1分鐘，95℃1分鐘。
5X 94℃30秒，62℃1分鐘，72℃2.5分鐘。
1X 94℃30秒，25℃3分鐘，3分鐘內(nèi)上升至72℃。
72℃2.5分鐘15X 94℃10秒，68℃1分鐘，72℃2.5分鐘；94℃10秒，68℃1分鐘，72℃2.5分鐘；94℃10秒，29℃1分鐘，72℃2.5分鐘。
1X 72℃5分鐘。
在21μl含以下成分的反應(yīng)混合物中進行TAIL2-PCR-1μl 1∶50稀釋的TAIL1反應(yīng)混合物(如上述制備)-0.8mM dNTP-0.2μM PR61(SEQ ID No.33)-0.2μM AD1(SEQ ID No.35)-2μl 10X PCR緩沖液(TAKARA)-0.5μl R Taq聚合酶(TAKARA)-加至21μl 蒸餾水在以下循環(huán)條件下進行PCR反應(yīng)TAIL212X94℃10秒，64℃1分鐘，72℃2.5分鐘；94℃10秒，64℃1分鐘，72℃2.5分鐘；94℃10秒，29℃1分鐘，72℃2.5分鐘；1X 72℃5分鐘在100μl含以下成分的反應(yīng)混合物中進行TAIL3-PCR-1μl 1∶10稀釋的TAIL2反應(yīng)混合物(如上述制備)-0.8mMdNTP-0.2μM PR63(SEQ ID No.34)-0.2μM AD1(SEQ ID No.35)-10μl10X PCR緩沖液(TAKARA)-0.5μl R Taq聚合酶(TAKARA)-加至100μl蒸餾水在以下循環(huán)條件下進行PCR反應(yīng)TAIL320X 94℃15秒，29℃30秒，72℃2分鐘1X 72℃5分鐘使用引物PR63和AD1的PCR擴增反應(yīng)產(chǎn)生含有尤其是ε-環(huán)化酶199bp啟動子片段的280bp片段(圖7)。
使用標(biāo)準(zhǔn)方法，將擴增子克隆入PCR-克隆載體pCR2.1(Invitrogen)。使用引物M13和T7的序列分析反應(yīng)產(chǎn)生序列SEQ ID No.12。該序列與利用IPCR策略分離的序列SEQ ID No.11內(nèi)的ε-環(huán)化酶區(qū)域相同，并因此代表所使用的萬壽菊“Orangenprinz”品系中的核酸序列。
含有通過IPCR策略分離的ε-環(huán)化酶啟動子312bp片段(SEQ IDNo.11)的pCR2.1克隆命名為pTA-ecycP并用于制備IR構(gòu)建體。
實施例5用于在萬壽菊中花特異表達ε-環(huán)化酶dsRNA的反向重復(fù)表達盒的制備(直接針對ε-環(huán)化酶cDNA的啟動子區(qū))。
由ε-環(huán)化酶啟動子片段組成的反向重復(fù)轉(zhuǎn)錄本在花特異的擬南芥菜啟動子AP3的修飾形式AP3P(見實施例1)或花特異啟動子CHRC(GenBank登陸號AF099501)的控制下在萬壽菊中表達。反向重復(fù)轉(zhuǎn)錄本在每一情況下含有正向的ε-環(huán)化酶啟動子片段(有意片段)和序列相同的反向ε-環(huán)化酶啟動子片段(反義片段)，這兩個片段通過功能內(nèi)含子彼此相連(見實施例1)。
利用質(zhì)粒DNA(pTA-ecycP克隆，見實施例4)并分別利用引物PR124(SEQ ID No.36)和PR126(SEQ ID No.38)，以及引物PR125(SEQ IDNo.37)和PR127(SEQ ID No.39)，通過PCR方法制備啟動子片段。
PCR反應(yīng)條件如下擴增含ε-環(huán)化酶啟動子片段的PR124-PR126 DNA片段的PCR反應(yīng)在50μl含以下成分的反應(yīng)混合物中進行-1μl cDNA(如上述制備)-0.25mM dNTPs-0.2μM PR124(SEQ ID No.36)-0.2μM PR126(SEQ ID No.38)
-5μl 10X PCR緩沖液(TAKARA)-0.25μl R Taq聚合酶(TAKARA)-28.8μl 蒸餾水?dāng)U增含312bpε-環(huán)化酶啟動子片段的PR125-PR127 DNA片段的PCR反應(yīng)在50μl含以下成分的反應(yīng)混合物中進行-1μl cDNA(如上述制備)-0.25mMdNTPs-0.2μMPR125(SEQ ID No.37)-0.2μMPR127(SEQ ID No.39)-5μl 10X PCR緩沖液(TAKARA)-0.25μl R Taq聚合酶(TAKARA)-28.8μl蒸餾水在以下循環(huán)條件下進行PCR反應(yīng)1X 94℃2分鐘35X 94℃1分鐘53℃1分鐘72℃1分鐘1X 72℃10分鐘使用引物PR124和PR126的PCR擴增反應(yīng)產(chǎn)生358bp片段，而使用引物PR125和PR127的PCR擴增反應(yīng)產(chǎn)生361bp片段。
使用標(biāo)準(zhǔn)方法，將兩個擴增子，PR124-PR126(HindIII-SalI有意)片段和PR125-PR127(EcoRI-BamHI反義)片段，克隆入PCR-克隆載體pCR-BluntII(Invitrogen)中。使用SP6引物的序列分析反應(yīng)證實在每一情況下，除了所導(dǎo)入的限制性酶切位點外，其序列與SEQ ID No.11完全相同。因此這些克隆可用于制備pJAI1克隆載體中的反向重復(fù)構(gòu)建體(見實施例1) 。
通過從pCR-BluntII克隆載體(Invitrogen)分離358bp PR124-PR126HindIII-SalI片段并將其與BamHI-EcoRI-酶切pJAI1載體連接進行第一次克隆步驟。含有意方向ε-環(huán)化酶啟動子片段的克隆命名為cs43。連接反應(yīng)使ε-環(huán)化酶啟動子有意片段插入到AP3P啟動子和內(nèi)含子之間。
通過從pCR-BluntII克隆載體(Invitrogen)分離361bp PR125-PR127BamHI-EcoRI片段并將其與BamHI-EcoRI-酶切cs43載體連接進行第二次克隆步驟。含反義方向ε-環(huán)化酶啟動子片段的克隆命名為cs44。連接反應(yīng)在內(nèi)含子與ε-環(huán)化酶啟動子反義片段之間產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄融合。
使用矮牽牛基因組DNA(通過標(biāo)準(zhǔn)方法制備)和引物PRCHRC3’(SEQID No.43)和PRCHRC5’(SEQ ID No.42)，通過擴增CHRC啟動子片段制備在CHRC啟動子控制下的反向重復(fù)表達盒。將擴增子克隆入pCR2.1克隆載體(Invitrogen)。使用M13和T7引物對所得克隆進行序列分析證實該序列與AF099501序列相同。因此該克隆可用于克隆入表達載體cs44。
通過分離pCR2.1-CHRC 1537bp SacI-HindIII片段并將其連入SacI-HindIII-酶切的cs44載體進行克隆。含有CHRC啟動子而非原來的AP3P啟動子的克隆命名為cs45。
通過將AP3P啟動子以反義方向克隆入cs45中ε-環(huán)化酶反義片段3’端制備在兩個啟動子，CHRC啟動子和AP3P啟動子，控制下的反向重復(fù)表達盒。使用引物PR128和PR129擴增pJAI1的AP3P啟動子片段。將擴增子克隆入pCR2.1克隆載體(Invitrogen)。使用M13和T7引物的序列分析證實該序列與序列SEQ ID No.1相同。該克隆，pCR2.1-AP3PSX，用于制備在兩個啟動子控制下的反向重復(fù)表達盒。
通過從pCR2.1-AP3PSX分離771bp SalI-XhoI片段并將其連接入XhoI-酶切cs45載體進行克隆。含有3’端反向重復(fù)、反義方向AP3P啟動子的克隆命名為cs46。
使用雙元載體pSUN5(WO02/00900)制備對AP3P-控制的反向重復(fù)轉(zhuǎn)錄本進行萬壽菊中農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的表達盒。
通過將cs44的1685bp SacI-XhoI片段與SacI-XhoI-酶切pSUN5載體連接制備表達載體pS5AI7(圖8，構(gòu)建體圖譜)。
在圖8中，AP3P片段包括修飾的AP3P啟動子(771bp)，P-sense片段包括有意方向的ε-環(huán)化酶312bp啟動子片段，intron片段包括馬鈴薯ST-LS1基因IV2內(nèi)含子，并且P-anti片段包括反義方向的ε-環(huán)化酶312 bp啟動子片段。
通過將cs45 2445bp SacI-XhoI片段與SacI-XhoI-酶切pSUN5載體連接制備表達載體pS5CI7(圖9，構(gòu)建體圖譜)。
在圖9中，CHRC片段包括CHRC啟動子(1537bp)，P-sense片段包括有意方向的ε-環(huán)化酶312bp啟動子片段，intron片段包括馬鈴薯ST-LS1基因IV2內(nèi)含子，并且P-anti片段包括反義方向的ε-環(huán)化酶312bp啟動子片段。
通過將cs46 3219bp SacI-XhoI片段與SacI-XhoI-酶切pSUN5載體連接制備表達載體pS5CI7(


圖10，構(gòu)建體圖譜)。
在
圖10中，CHRC片段包括CHRC啟動子(1537bp)，P-sense片段包括有意方向的ε-環(huán)化酶312bp啟動子片段，intron片段包括馬鈴薯ST-LS1基因IV2內(nèi)含子，P-anti片段包括反義方向的ε-環(huán)化酶312 bp啟動子片段，并且AP3P片段包括反義方向的771bp AP3P啟動子片段。
實施例6轉(zhuǎn)基因萬壽菊植物的制備將萬壽菊種子滅菌并放置于發(fā)芽培養(yǎng)基上(MS培養(yǎng)基；Murashige和Skoog，Physiol.Plant.15(1962)，473-497)pH 5.8，2％蔗糖)。發(fā)芽發(fā)生于18-28℃/20-200μE/3-16周的溫度/光/時間間隔內(nèi)，但是優(yōu)選地為21℃，20-70μE，4-8周。
然后收獲體外發(fā)育形成的植物的所有葉子并垂直切割至中脈。在制備期間將以這種方式產(chǎn)生的大小為10-60mm2的葉外植體室溫貯存于液體MS培養(yǎng)基最多2小時。
用雙元質(zhì)粒PS5AI3轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌EHA105株。轉(zhuǎn)化的根癌農(nóng)桿菌EHA105株在以下條件下生長過夜將單菌落接種于含25mg/l卡那霉素的YEB(0.1％酵母提取物、0.5％牛肉膏、0.5％蛋白胨、0.5％蔗糖、0.5％硫酸鎂×7H2O)中并在28℃生長16-20小時。然后6000g離心10分鐘收獲細(xì)菌懸液并重懸于液體MS培養(yǎng)基中直至OD600產(chǎn)生為大約0.1-0.8。該懸液用于與葉材料共培養(yǎng)。
共培養(yǎng)之前，立即用細(xì)菌懸液代替其中已經(jīng)貯存葉子的MS培養(yǎng)基。將葉子孵育于農(nóng)桿菌懸液中并室溫輕輕振蕩30分鐘。將感染的外植體放置于含生長調(diào)節(jié)劑例如3mg/l芐氨基嘌呤(BAP)和1mg/l吲哚乙酸(IAA)，并已經(jīng)用瓊脂(例如0.8％植物瓊脂(Duchefa，NL))固化的MS培養(yǎng)基上。葉在培養(yǎng)基上的方向沒有影響。將外植體培養(yǎng)1-8天，但是優(yōu)選地為6天，在此期間使用以下條件光強度30-80μmol/m2×s，溫度22-24℃，16/8小時光/暗交替。然后將共培養(yǎng)的外植體轉(zhuǎn)移至新鮮MS培養(yǎng)基中，優(yōu)選地含有相同的生長調(diào)節(jié)劑，此外該第二培養(yǎng)基還含有抗生素以抑制細(xì)菌生長。200-500mg/l濃度的特美汀(Timentin)非常適于該目的。所應(yīng)用的第二選擇性成分是一種用于篩選成功轉(zhuǎn)化子的成分。1-5mg/l濃度的膦絲菌素選擇非常有效，但其它選擇成分也可按照所用方法使用。
一至三周后，在每一情況下，將外植體轉(zhuǎn)移至新鮮培養(yǎng)基直至形成胚芽和小芽，并且然后將其轉(zhuǎn)移至含特美汀和PPT或含其它用于生根的生長調(diào)節(jié)劑的成分即例如0.5mg/l吲哚丁酸(IBA)和0.5mg/l赤霉酸GA3的相同基礎(chǔ)培養(yǎng)基中?？蓪⑸难矿w轉(zhuǎn)移至溫室中。
除了上述方法，也可進行以下有利的改進-用細(xì)菌感染外植體之前，可以將外植體在上述培養(yǎng)基上預(yù)孵育以共培養(yǎng)1-12天，優(yōu)選地為3-4天。然后如上述進行感染、共培養(yǎng)和選擇再生。
-用于再生的pH(通常為5.8)能夠降低至pH 5.2。這可改善對農(nóng)桿菌生長的控制。
-在再生培養(yǎng)基中加入AgNO3(3-10mg/l)以改善培養(yǎng)條件，包括再生本身。
-降低酚形成并為技術(shù)人員所熟知的成分，例如檸檬酸、抗壞血酸、PVP和許多其他成分，對培養(yǎng)具有有益的作用。
-液體培養(yǎng)基也能夠用于全過程。培養(yǎng)物也能夠孵育于定位在液體培養(yǎng)基的商業(yè)可得的支持物上。
根據(jù)上述轉(zhuǎn)化方法，利用以下表達構(gòu)建體獲得以下品系使用pS5AI3獲得CS30-1、CS30-3和CS30-4實施例7轉(zhuǎn)基因植物的特性將實施例6的轉(zhuǎn)基因萬壽菊植物的花材料在液氮中壓擠并用100％丙酮提取(三次，每次500μl)粉末(大約250-500mg)。蒸發(fā)溶劑并將類胡蘿卜素重懸于100μl丙酮。
利用C30反相柱能夠區(qū)分出類胡蘿卜素單酯和二酯。HPLC運行條件實際上與已公開方法相同(Frazer等(2000)，Plant Journal 24(4)551-558)?；赨V-VIS譜鑒定類胡蘿卜素是可能的。
表1描述了按照上述實施例制備的轉(zhuǎn)基因萬壽菊植物和對照萬壽菊植物萬壽菊花瓣中的類胡蘿卜素譜。所有類胡蘿卜素的量以[μg/g]鮮重給出，與對照植物相比變化的百分比顯示于括弧中。
與未遺傳修飾的對照植物相比，經(jīng)遺傳修飾植物具有明顯增加的“β-胡蘿卜素途徑”的類胡蘿卜素例如β-胡蘿卜素和玉米黃素含量，并具有明顯降低的“α-類胡蘿卜素途徑”的類胡蘿卜素例如葉黃素含量。
表1
比較實施例1通過反義降低萬壽菊中ε-環(huán)化酶活性使用技術(shù)人員熟知的常規(guī)方法，如比較實施例制備萬壽菊反義品系CS32-9，其中ε-環(huán)化酶活性已通過反義降低。通過上述方法測定的該品系(CS32-9)中的類胡蘿卜素譜同樣描述于表1。
序列表<110>太陽基因兩合公司<120>制備玉米黃素和/或其生物合成中間體和/或次級產(chǎn)物的方法<130>NAE 439/02<160>43<170>PatentIn版本3.1<210>1<211>777<212>DNA<213>擬南芥菜(Arabidopsis thaliana)<220>
<221>啟動子<222>(1)..(777)<223>
<400>1gagctcactc actgatttcc attgcttgaa aattgatgat gaactaagat caatccatgt60tagtttcaaa acaacagtaa ctgtggccaa cttagttttg aaacaacact aactggtcga120agcaaaaaga aaaaagagtt tcatcatata tctgatttga tggactgttt ggagttagga180ccaaacatta tctaeaaaca aagacttttc tcctaacttg tgattccttc ttaaacccta240ggggtaatat tctattttcc aaggatcttt agttaaaggc aaatccggga aattattgta300atcatttggg gaaacatata aaagatttga gttagatgga agtgacgatt aatccaaaca360tatatatctc tttcttctta tttcccaaat taacagacaa aagtagaata ttggctttta420acaccaatat aaaaacttgc ttcacaccta aacacttttg tttactttag ggtaagtgca480aaaagccaac caaatccacc tgcactgatt tgacgtttac aaacgccgtt aagtcgatgt540ccgttgattt aaacagtgtc ttgtaattaa aaaaatcagt ttacataaat ggaaaattta600
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<221>內(nèi)含子<222>(1)..(195)<223>
<400>2tacgtaagtt tctgcttcta cctttgatat atatataata attatcatta attagtagta60atataatatt tcaaatattt ttttcaaaat aaaagaatgt agtatatagc aattgctttt120ctgtagttta taagtgtgta tattttaatt tataactttt ctaatatatg accaaaattt180gttgatgtgc agctg 195<210>3<211>212<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>內(nèi)含子<222>(1)..(212)<223>
<400>3gtcgactacg taagtttctg cttctacctt tgatatatat ataataatta tcattaatta60gtagtaatat aatatttcaa atattttttt caaaataaaa gaatgtagta tatagcaatt120
gcttttctgt agtttataag tgtgtatatt ttaatttata acttttctaa tatatgacca180aaatttgttg atgtgcaggt atcaccggat cc 212<210>4<211>1830<212>DNA<213>萬壽菊(Tagetes erecta)<220>
<221>CDS<222>(141)..(1691)<223>
<400>4ggcacgaggc aaagcaaagg ttgtttgttg ttgttgttga gagacactcc aatccaaaca60gatacaaggc gtgactggat atttctctct cgttcctaac aacagcaacg aagaagaaaa120agaatcatta ctaacaatca atg agt atg aga gct gga cac atg acg gca aca173Met Ser Met Arg Ala Gly His Met Thr Ala Thr1 5 10atg gcg gct ttt aca tgc cct agg ttt atg act agc atc aga tac acg 221Met Ala Ala Phe Thr Cys Pro Arg Phe Met Thr Ser Ile Arg Tyr Thr15 20 25aag caa att aag tgc aac gct gct aaa agc cag cta gtc gtt aaa caa 269Lys Gln Ile Lys Cys Asn Ala Ala Lys Ser Gln Leu Val Val Lys Gln30 35 40gag att gag gag gaa gaa gat tat gtg aaa gcc ggt gga tcg gag ctg 317Glu Ile Glu Glu Glu Glu Asp Tyr Val Lys Ala Gly Gly Ser Glu Leu45 50 55ctt ttt gtt caa atg caa cag aat aag tcc atg gat gca cag tct agc 365Leu Phe Val Gln Met Gln Gln Asn Lys Ser Met Asp Ala Gln Ser Ser60 65 70 75cta tcc caa aag ctc cca agg gta cca ata gga gga gga gga gac agt 413Leu Ser Gln Lys Leu Pro Arg Val Pro Ile Gly Gly Gly Gly Asp Ser
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Glu Asp Tyr Val Lys Ala Gly Gly Ser Glu Leu Leu Phe Val Gln Met50 55 60Gln Gln Asn Lys Ser Met Asp Ala Gln Ser Ser Leu Ser Gln Lys Leu65 70 75 80Pro Arg Val Pro Ile Gly Gly Gly Gly Asp Ser Asn Cys Ile Leu Asp85 90 95Leu Val Val Ile Gly Cys Gly Pro Ala Gly Leu Ala Leu Ala Gly Glu100 105 110Ser Ala Lys Leu Gly Leu Asn Val Ala Leu Ile Gly Pro Asp Leu Pro115 120 125Phe Thr Asn Asn Tyr Gly Val Trp Glu Asp Glu Phe Ile Gly Leu Gly130 135 140Leu Glu Gly Cys Ile Glu His Val Trp Arg Asp Thr Val Val Tyr Leu145 150 155 160Asp Asp Asn Asp Pro Ile Leu Ile Gly Arg Ala Tyr Gly Arg Val Ser165 170 175Arg Asp Leu Leu His Glu Glu Leu Leu Thr Arg Cys Met Glu Ser Gly180 185 190Val Ser Tyr Leu Ser Ser Lys Val Glu Arg Ile Thr Glu Ala Pro Asn195 200 205Gly Leu Ser Leu Ile Glu Cys Glu Gly Asn Ile Thr Ile Pro Cys Arg210 215 220
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Ser Lys Gln Met Leu Asp His Gly Arg Tyr Thr Thr Asn Ile Ser Lys405 410 415Gln Ala Trp Glu Thr Leu Trp Pro Leu Glu Arg Lys Arg Gln Arg Ala420 425 430Phe Phe Leu Phe Gly Leu Ala Leu Ile Val Gln Met Asp Ile Glu Gly435 440 445Thr Arg Thr Phe Phe Arg Thr Phe Phe Arg Leu Pro Thr Trp Met Trp450 455 460Trp Gly Phe Leu Gly Ser Ser Leu Ser Ser Thr Asp Leu Ile Ile Phe465 470 475 480Ala Phe Tyr Met Phe Ile Ile Ala Pro His Ser Leu Arg Met Gly Leu485 490 495Val Arg His Leu Leu Ser Asp Pro Thr Gly Gly Thr Met Leu Lys Ala500 505 510Tyr Leu Thr Ile515<210>6<211>445<212>DNA<213>萬壽菊<220>
<221>有意片段<222>(1)..(445)<223>
<400>6aagcttgcac gaggcaaagc aaaggttgtt tgttgttgtt gttgagagac actccaatcc 60aaacagatac aaggcgtgac tggatatttc tctctcgttc ctaacaacag caacgaagaa 120gaaaaagaat cattactaac aatcaatgag tatgagagct ggacacatga cggcaacaat 180ggcggctttt acatgcccta ggtttatgac tagcatcaga tacacgaagc aaattaagtg 240caacgctgct aaaagccagc tagtcgttaa acaagagatt gaggaggaag aagattatgt 300gaaagccggt ggatcggagc tgctttttgt tcaaatgcaa cagaataagt ccatggatgc 360acagtctagc ctatcccaaa agctcccaag ggtaccaata ggaggaggag gagacagtaa 420ctgtatactg gatttggttg tcgac445<210>7<211>446<212>DNA<213>萬壽菊<220>
<221>反義片段<222>(1)..(446)<223>
<400>7gaattcgcac gaggcaaagc aaaggttgtt tgttgttgtt gttgagagac actccaatcc 60aaacagatac aaggcgtgac tggatatttc tctctcgttc ctaacaacag caacgaagaa 120gaaaaagaat cattactaac aatcaatgag tatgagagct ggacacatga cggcaacaat 180ggcggctttt acatgcccta ggtttatgac tagcatcaga tacacgaagc aaattaagtg 240caacgctgct aaaagccagc tagtcgttaa acaagagatt gaggaggaag aagattatgt 300gaaagccggt ggatcggagc tgctttttgt tcaaatgcaa cagaataagt ccatggatgc 360acagtctagc ctatcccaaa agctcccaag ggtaccaata ggaggaggag gagacagtaa 420
ctgtatactg gatttggttg gatcct 446<210>8<211>393<212>DNA<213>萬壽菊<220>
<221>有意片段<222>(1)..(393)<223>
<400>8aagctttgga ttagcactga ttgtccagat ggatattgag gggacccgca cattcttccg60gactttcttc cgcttgccca catggatgtg gtgggggttt cttggatctt cgttatcatc120aactgacttg ataatatttg cgttttacat gtttatcata gcaccgcata gcctgagaat180gggtctggtt agacatttgc tttctgaccc gacaggagga acaatgttaa aagcgtatct240cacgatataa ataactctag tcgcgatcag tttagattat aggcacatct tgcatatata300tatgtataaa ccttatgtgt gctgtatcct tacatcaaca cagtcattaa ttgtatttct360tggggtaatg ctgatgaagt attttctgtc gac 393<210>9<211>397<212>DNA<213>萬壽菊<220>
<221>反義片段<222>(1)..(397)<223>
<400>9gaattctctt tggattagca ctgattgtcc agatggatat tgaggggacc cgcacattct60
tccggacttt cttccgcttg cccacatgga tgtggtgggg gtttcttgga tcttcgttat120catcaactga cttgataata tttgcgtttt acatgtttat catagcaccg catagcctga180gaatgggtct ggttagacat ttgctttctg acccgacagg aggaacaatg ttaaaagcgt240atctcacgat ataaataact ctagtcgcga tcagtttaga ttataggcac atcttgcata300tatatatgta taaaccttat gtgtgctgta tccttacatc aacacagtca ttaattgtat360ttcttggggt aatgctgatg aagtattttc tggatcc 397<210>10<211>1537<212>DNA<213>-<220>
<221>啟動子<222>(1)..(1537)<223>
<400>10gagctctaca aattagggtt actttattca ttttcatcca ttctctttat tgttaaattt60tgtacattta ttcaataata ttatatgttt attacaaatt ctcactttct tattcatacc120tattcactca agcctttacc atcttccttt tctatttcaa tactatttct acttcatttt180tcacgttttt aacatctttc tttatttctt gtccacttcg tttagggatg cctaatgtcc240caaatttcat ctctcgtagt aacacaaaac caatgtaatg ctacttctct ctacattttt300aatacaaata aagtgaaaca aaatatctat aaataaacaa atatatatat tttgttagac360gctgtctcaa cccatcaatt aaaaaatttt gttatatttc tactttacct actaaatttg420tttctcatat ttacctttta acccccacaa aaaaaaatta taaaaaagaa agaaaaaagc480taaaccctat ttaaatagct aactataaga tcttaaaatt atcctcatca gtgtatagtt540
taattggtta ttaacttata acattatata tctatgacat atactctctc ctagctattt600ctcacatttt ttaacttaag aaaatagtca taacatagtc taaaattcaa acatccacat660gctctaattt gattaacaaa aagttagaaa tatttattta aataaaaaag actaataaat720atataaaatg aatgttcata cgcagaccca tttagagatg agtatgcttt cacatgctga780gattattttc aaaactaagg ttgtagcaat attaaatcaa taaaattatt ataaataaca840aaattaacct gctcgtgttt gctgtatatg ggaggctaca aaataaatta aactaaagat900gattatgttt tagacatttt ttctatctgt attagtttat acatattaat tcaggagctg960cacaacccaa ttctattttc gttccttggt ggctgggttt ctcacaaggt tcaatagtca1020atattaggtt ttattggact tttaatagta tcaaacaaat ctatgtgtga acttaaaaat1080tgtattaaat atttagggta acctgttgcc gtttttagaa taatgtttct tcttaataca1140cgaaagcgta ttgtgtattc attcatttgg cgcctcacat gcttcggttg gctcgcttta1200gtctctgcct tctttgtata ttgtactccc cctcttccta tgccacgtgt tctgagctta1260acaagccacg ttgcgtgcca ttgccaaaca agtcatttta acttcacaag gtccgatttg1320acctccaaaa caacgacaag tttccgaaca gtcgcgaaga tcaagggtat aatcgtcttt1380ttgaattcta tttctcttta tttaatagtc cctctcgtgt gatagttttt aaaagatttt1440taaaacgtag ctgctgttta agtaaatccc agtccttcag tttgtgcttt tgtgtgtttt1500gtttctctga tttacggaat ttggaaataa taagctt 1537<210>11<211>734<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>變異<222>(1)..(734)<223>
<400>11ctaacaatca atgagtagag agctggacac atgacggcaa caatggcggc ttttacatgc60cctaggttta tgactagcat cagatacacg aagcaaatta agtgcaacgc tgctaaaagc120cagctagtcg ttaaacaaga gattgaggag gaagaagatt atgtgaaagc cggtggatcg180gagctgcttt ttgttcaaat gcaacagaat aagtccatgg atgcacagtc tagcctatcc240caaaaggtca ctccagactt aattgcttat aaataaataa atatgttttt taggaataat300gatatttaga tagattagct atcacctgtg ctgtggtgtg cagctcccaa gggtcttacc360gatagtaaaa tcgttagtta tgattaatac ttgggaggtg ggggattata ggctttgttg420tgagaatgtt gagaaagagg tttgacaaat cggtgtttga atgaggttaa atggagttta480attaaaataa agagaagaga aagattaaga gggtgatggg gatattaaag acggscaata540tagtgatgcc acgtagaaaa aggtaagtga aaacatacaa cgtggcttta aaagatggct600tggctgctaa tcaactcaac tcaactcata tcctatccat tcaaattcaa ttcaattcta660ttgaatgcaa agcaaagcaa aggttgtttg ttgttgttgt tgagagacac tccaatccaa720acagatacaa ggcg 734<210>12<211>280<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>變異<222>(1)..(280)<223>
<400>12gtcgagtatg gagttcaatt aaaataaaga gaagaraaag attaagaggg tgatggggat60
attaaagacg gccaatrtag tgatgccacg taagaaaaag gtaagtgaaa acatacaacg120tggctttaaa agatggcttg gctgctaatc aactcaactc aactcatatc ctatccattc180aaattcaatt caattctatt gaatgcaaag caaagcaaag caaaggttgt ttgttgttgt240tgttgagaga cactccaatc caaacagata caaggcgtga 280<210>13<211>358<212>DNA<213>萬壽菊<220>
<221>(有意)啟動子<222>(1)..(358)<223>
<400>13aagcttaccg atagtaaaat cgttagttat gattaatact tgggaggtgg gggattatag60gctttgttgt gagaatgttg agaaagaggt ttgacaaatc ggtgtttgaa tgaggttaaa120tggagtttaa ttaaaataaa gagaagagaa agattaagag ggtgatgggg atattaaaga180cggccaatat agtgatgcca cgtagaaaaa ggtaagtgaa aacatacaac gtggctttaa240aagatggctt ggctgctaat caactcaact caactcatat cctatccatt caaattcaat300tcaattctat tgaatgcaaa gcaaagcaaa gcaaaggttg tttgttgttg ttgtcgac 358<210>14<211>361<212>DNA<213>萬壽菊<220>
<221>(反義)啟動子<222>(1)..(361)<223>
<400>14ctcgagctta ccgatagtaa aatcgttagt tatgattaat acttgggagg tgggggatta60taggctttgt tgtgagaatg ttgagaaaga ggtttgacaa atcggtgttt gaatgaggtt120aaatggagtt taattaaaat aaagagaaga gaaagattaa gagggtgatg gggatattaa180agacggccaa tatagtgatg ccacgtagaa aaaggtaagt gaaaacatac aacgtggctt240taaaagatgg cttggctgct aatcaactca actcaactca tatcctatcc attcaaattc300aattcaattc tattgaatgc aaagcaaagc aaagcaaagg ttgtttgttg ttgttggatc360c361<210>15<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物<222>(1)..(28)<223>
<400>15gagctcactc actgatttcc attgcttg 28<210>16<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物<222>(1)..(37)<223>
<400>16
cgccgttaag tcgatgtccg ttgatttaaa cagtgtc 37<210>17<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物<222>(1)..(34)<223>
<400>17atcaacggac atcgacttaa cggcgtttgt aaac34<210>18<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物<222>(1)..(25)<223>
<400>18taagcttttt gttgaagaga tttgg 25<210>19<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物<222>(1)..(23)<223>
<400>19gaaaatactt catcagcatt acc23<210>20<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物<222>(1)..(28)<223>
<400>20gtcgactacg taagtttctg cttctacc 28<210>21<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物<222>(1)..(26)<223>
<400>21ggatccggtg atacctgcac atcaac 26<210>22<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物<222>(1)..(28)<223>
<400>22aagcttgcac gaggcaaagc aaaggttg 28<210>23<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物<222>(1)..(29)<223>
<400>23gtcgacaacc aaatccagta tacagttac 29<210>24<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物<222>(1)..(30)<223>
<400>24aggatccaac caaatccagt atacagttac 30<210>25<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物<222>(1)..(28)<223>
<400>25gaattcgcac gaggcaaagc aaaggttg 28<210>26<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物<222>(1)..(25)<223>
<400>26aagctttgga ttagcactga ttgtc 25<210>27<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物<222>(1)..(29)<223>
<400>27gtcgacagaa aatacttcat cagcattac 29<210>28<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物<222>(1)..(29)
<223>
<400>28ggatccagaa aatacttcat cagcattac 29<210>29<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物<222>(1)..(27)<223>
<400>29gaattctctt tggattagca ctgattg27<210>30<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物<222>(1)..(23)<223>
<400>30cgccttgtat ctgtttggat tgg23<210>31<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物
<222>(1)..(24)<223>
<400>31ctaacaatca atgagtatga gagc 24<210>32<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物<222>(1)..(26)<223>
<400>32agagcaaggc cagcaggacc acaacc 26<210>33<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物<222>(1)..(26)<223>
<400>33ccttgggagc ttttgggata ggctag 26<210>34<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物<222>(1)..(26)<223>
<400>34tcacgccttg tatctgtttg gattgg 26<210>35<211>15<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物<222>(1)..(15)<223>
<400>35gtcgagtatg gagtt 15<210>36<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物<222>(1)..(28)<223>
<400>36aagcttaccg atagtaaaat cgttagtt 28<210>37<211>31<212>DNA<213>人工序列
<220>
<221>引物<222>(1)..(31)<223>
<400>37ctcgagctta ccgatagtaa aatcgttagt t 31<210>38<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物<222>(1)..(28)<223>
<400>38gtcgacaaca acaacaaaca acctttgc 28<210>39<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物<222>(1)..(28)<223>
<400>39ggatccaaca acaacaaaca acctttgc 28<210>40<211>28<212>DNA<213>人工序列
<220>
<221>引物<222>(1)..(28)<223>
<400>40gtcgactttt tgttgaagag atttggtg 28<210>41<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物<222>(1)..(28)<223>
<400>41ctcgagactc actgatttcc attgcttg 28<210>42<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物<222>(1)..(22)<223>
<400>42gagctctaca aattagggtt ac 22<210>43<211>23<212>DNA
<213>人工序列<220>
<221>引物<222>(1)..(23)<223>
<400>43aagcttatta tttccaaatt ccg2權(quán)利要求
1.通過培養(yǎng)經(jīng)遺傳修飾植物制備玉米黃素和/或其生物合成中間體和/或次級產(chǎn)物的方法，其中經(jīng)遺傳修飾植物與野生型相比具有由于雙鏈ε-環(huán)化酶核糖核酸序列引起的ε-環(huán)化酶活性降低。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中將這樣的RNA導(dǎo)入植物，所述RNA具有雙鏈結(jié)構(gòu)區(qū)域并且在所述區(qū)域中包含下述核酸序列a)與所述植物固有的至少部分ε-環(huán)化酶轉(zhuǎn)錄本相同和/或b)與所述植物固有的至少部分ε-環(huán)化酶-啟動子序列相同。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述雙鏈結(jié)構(gòu)區(qū)域包含這樣的核酸序列，其與所述植物固有的至少部分ε-環(huán)化酶轉(zhuǎn)錄本相同并包含所述植物固有的編碼ε-環(huán)化酶的核酸的5’端或3’端。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其中在每一情況下所述雙鏈結(jié)構(gòu)區(qū)域包含含有至少一種基本上與至少部分有意-RNAε-環(huán)化酶轉(zhuǎn)錄本相同的核糖核苷酸序列的有意-RNA鏈，并且包含基本上與所述有意-RNA鏈互補的反義-RNA鏈。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任意一項所述的方法，其中所使用的經(jīng)遺傳修飾植物的花具有最低比率的ε-環(huán)化酶表達。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述雙鏈ε-環(huán)化酶核糖核酸序列在花特異的啟動子控制下轉(zhuǎn)錄，見序列+附圖。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任意一項所述的方法，其中所使用的植物選自以下科毛茛科、小檗科、罌粟科、大麻科、薔薇科、豆科、亞麻科、葡萄科、蕓苔科、葫蘆科、報春花科、石竹科、莧科、龍膽科、牻牛兒苗科、忍冬科、木犀科、旱金蓮科、茄科、玄參科、菊科、百合科、石蒜科、禾本科、蘭科、錦葵科、木蘭科或唇形科。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所使用的植物選自以下植物屬金盞菊屬、萬壽菊屬、金合歡屬、烏頭屬、側(cè)金盞花屬、阿尼菊屬、耬斗菜屬、紫菀屬、黃芪屬、紫葳屬、金盞花屬、驢蹄草屬、風(fēng)鈴草屬、美人蕉屬、矢車菊屬、桂竹香屬、茼蒿屬、柑桔屬、還陽參屬、番紅花屬、南瓜屬、金雀兒屬、鳳凰木屬、翠雀屬、石竹屬、異果菊屬、多榔菊屬、花菱草屬、連翹屬、Fremontia、勛章菊屬、斷腸草屬、染料木屬、龍膽屬、老鸛草屬、扶郎花屬、水楊梅屬、銀樺屬、堆心菊屬、向日葵屬、獐耳細(xì)辛屬、獨活屬、木槿屬、賽菊芋屬、金絲桃屬、貓兒菊屬、鳳仙花屬、鳶尾屬、藍花楹屬、棣棠屬、毒豆屬、香豌豆屬、獅齒菊屬、百合屬、亞麻屬、百脈根屬、番茄屬、珍珠菜屬、合囊蕨屬、苜蓿屬、溝酸漿屬、水仙屬、月見草屬、木犀屬、碧冬茄屬、石楠屬、酸漿屬、牧根草屬、委陵菜屬、火棘屬、毛茛屬、杜鵑花屬、薔薇屬、金光菊屬、千里光屬、蠅子草屬、松香草屬、白芥屬、花楸屬、鷹爪豆屬、黃鐘花屬、蝴蝶草屬、婆羅門參屬、金蓮花屬、旱金蓮屬、郁金香屬、款冬屬、荊豆屬、堇菜屬或百日草屬。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所用植物是選自金盞菊(Marigold)、萬壽菊(Tagetes erecta)或孔雀草(Tagetes patula)植物物種。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任意一項所述的方法，其中在培養(yǎng)之后收獲經(jīng)遺傳修飾植物并且隨后從所述植物中分離玉米黃素和/或其生物合成中間體和/或次級產(chǎn)物。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任意一項所述的方法，其中生物合成中間體和/或次級產(chǎn)物選自番茄紅素、β-胡蘿卜素、蝦青素、角黃素、β-胡蘿卜素-4-酮、3-羥基β-胡蘿卜素-4-酮、3’-羥基β-胡蘿卜素-4-酮、金盞花玉紅質(zhì)、金盞花黃質(zhì)、花藥黃質(zhì)、堇菜黃素、新黃素、辣椒紅素、和辣椒紅。
12.核糖核酸構(gòu)建體，其包含具雙鏈結(jié)構(gòu)區(qū)域并且在所述區(qū)域中包含以下核酸序列的RNAa)與所述植物固有的至少部分ε-環(huán)化酶轉(zhuǎn)錄本相同和/或b)與所述植物固有的至少部分ε-環(huán)化酶啟動子序列相同。
13.核酸構(gòu)建體，其可轉(zhuǎn)錄成a)包含至少一種基本上與至少部分有意-RNAε-環(huán)化酶轉(zhuǎn)錄本相同的核糖核苷酸序列的有意-RNA鏈，和b)基本上，優(yōu)選地完全，與a)中的RNA有意鏈互補的反義-RNA鏈。
14.核酸構(gòu)建體，其包含a)基本上與至少部分ε-環(huán)化酶基因啟動子區(qū)相同的有意-DNA鏈，和b)基本上，優(yōu)選地完全，與a)中的DNA有意鏈互補的反義-DNA鏈。
15.根據(jù)權(quán)利要求13所述的核酸構(gòu)建體，其中SEQ ID No.4描述了可推導(dǎo)自ε-環(huán)化酶轉(zhuǎn)錄本的cDNA序列。
16.根據(jù)權(quán)利要求14所述的核酸構(gòu)建體，其中SEQ ID No.13描述了ε-環(huán)化酶基因啟動子區(qū)的核酸序列。
17.根據(jù)權(quán)利要求12-16中任意一項所述的核酸構(gòu)建體，其中有意-RNA鏈和反義-RNA鏈以反向重復(fù)形式彼此共價連接。
18.根據(jù)權(quán)利要求12-17中任意一項所述的核酸構(gòu)建體，其中該核酸構(gòu)建體還包含功能性連接的啟動子。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的核酸構(gòu)建體，其中使用了花特異的啟動子。
20.制備經(jīng)遺傳修飾植物的方法，其中將包含根據(jù)權(quán)利要求12-19中任意一項所述的核酸構(gòu)建體的表達盒導(dǎo)入親本植物。
21.經(jīng)遺傳修飾植物，與野生型相比其具有由于雙鏈ε-環(huán)化酶核糖核酸序列引起的ε-環(huán)化酶活性降低。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的經(jīng)遺傳修飾植物，其中所述經(jīng)遺傳修飾植物包含具雙鏈結(jié)構(gòu)區(qū)域并且在所述區(qū)域中包含以下核酸序列的RNAa)與所述植物固有的至少部分ε-環(huán)化酶轉(zhuǎn)錄本相同和/或b)與所述植物固有的至少部分ε-環(huán)化酶啟動子序列相同。
23.根據(jù)權(quán)利要求21或22所述的經(jīng)遺傳修飾植物，其中植物選自以下科毛茛科、小檗科、罌粟科、大麻科、薔薇科、豆科、亞麻科、葡萄科、蕓苔科、葫蘆科、報春花科、石竹科、莧科、龍膽科、牻牛兒苗科、忍冬科、木犀科、旱金蓮科、茄科、玄參科、菊科、百合科、石蒜科、禾本科、蘭科、錦葵科、木蘭科或唇形科。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的經(jīng)遺傳修飾植物，其中植物選自以下植物屬金盞菊屬、萬壽菊屬、金合歡屬、烏頭屬、側(cè)金盞花屬、阿尼菊屬、耬斗菜屬、紫菀屬、黃芪屬、紫葳屬、金盞花屬、驢蹄草屬、風(fēng)鈴草屬、美人蕉屬、矢車菊屬、桂竹香屬、茼蒿屬、柑桔屬、還陽參屬、番紅花屬、南瓜屬、金雀兒屬、鳳凰木屬、翠雀屬、石竹屬、異果菊屬、多榔菊屬、花菱草屬、連翹屬、Fremontia、勛章菊屬、斷腸草屬、染料木屬、龍膽屬、老鸛草屬、扶郎花屬、水楊梅屬、銀樺屬、堆心菊屬、向日葵屬、獐耳細(xì)辛屬、獨活屬、木槿屬、賽菊芋屬、金絲桃屬、貓兒菊屬、鳳仙花屬、鳶尾屬、藍花楹屬、棣棠屬、毒豆屬、香豌豆屬、獅齒菊屬、百合屬、亞麻屬、百脈根屬、番茄屬、珍珠菜屬、合囊蕨屬、苜蓿屬、溝酸漿屬、水仙屬、月見草屬、木犀屬、碧冬茄屬、石楠屬、酸漿屬、牧根草屬、委陵菜屬、火棘屬、毛茛屬、杜鵑花屬、薔薇屬、金光菊屬、千里光屬、蠅子草屬、松香草屬、白芥屬、花楸屬、鷹爪豆屬、黃鐘花屬、蝴蝶草屬、婆羅門參屬、金蓮花屬、旱金蓮屬、郁金香屬、款冬屬、荊豆屬、堇菜屬或百日草屬。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的經(jīng)遺傳修飾植物，其中植物選自植物物種金盞菊、萬壽菊或孔雀草。
26.根據(jù)權(quán)利要求21-25中任意一項所述的經(jīng)遺傳修飾植物的用途，用作裝飾植物或用作飼料和食品。
27.根據(jù)權(quán)利要求21-25中任意一項所述的經(jīng)遺傳修飾植物的用途，用于制備含類胡蘿卜素的提取物或用于制備飼料和食品添加劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及通過培養(yǎng)與野生型相比由于雙鏈ε－環(huán)化酶核糖核酸序列而具有降低的ε－環(huán)化酶活性的經(jīng)遺傳修飾植物制備玉米黃素和/或其生物合成中間體和/或次級產(chǎn)物的方法，并且涉及經(jīng)遺傳修飾植物以及其作為食品和飼料的用途和用于生產(chǎn)類胡蘿卜素提取物的用途。
文檔編號A23K1/18GK1675367SQ03819751
公開日2005年9月28日 申請日期2003年8月18日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月20日
發(fā)明者C·R·朔普費爾, R·弗拉赫曼, K·赫伯斯, I·孔策, M·紹爾, M·克勒布薩特爾 申請人:太陽基因兩合公司