一種雞傳染性法氏囊病病毒vp2蛋白及其制備方法與應(yīng)用及試劑盒的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供一種雞傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白及其制備方法與應(yīng)用，具體地，編碼該VP2蛋白的核苷酸序列含有如SEQ ID No.1所示序列。制備該VP2蛋白方法包括以下步驟：1)化學(xué)合成SEQ ID No.1序列，2)構(gòu)建表達(dá)載體和3)轉(zhuǎn)染sf9細(xì)胞。該VP2蛋白可用于制備雞傳染性法氏囊病的疫苗。該SEQ ID No.1是根據(jù)昆蟲(chóng)細(xì)胞偏愛(ài)密碼子對(duì)雞IBDV VP2基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化而得，比一般的從IBDV病毒擴(kuò)增的VP2基因，更適應(yīng)在昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)，更能提高蛋白表達(dá)量。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
一種雞傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白及其制備方法與應(yīng)用及 試劑盒
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種雞傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白及其制 備方法與應(yīng)用及試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 雞傳染性法氏囊?。↖nfectious Bursal Disease，IBD)是由傳染性法氏囊病毒 (Infectious Bursal Disease Virus，IBDV)侵害引起的一種急性、高度接觸性傳染病，主 要侵害雛雞和青年雞的法氏囊。該病不僅造成雞只死亡還導(dǎo)致免疫抑制，是目前危害世界 養(yǎng)禽業(yè)的主要傳染病之一。傳染性法氏囊病病毒屬于雙股雙節(jié)段dsRNA病毒，其基因組是由 A、B兩個(gè)雙鏈RNA片段組成。A片段長(zhǎng)度為3200bp，B片段長(zhǎng)度約為2800bP<3A片段具有兩個(gè)開(kāi) 放閱讀框，大閱讀框0RF1編碼VP2、VP4、VP3三個(gè)蛋白質(zhì)，小開(kāi)放閱讀框0RF2編碼VP5蛋白。B 片段只有一個(gè)0RF，編碼VP1蛋白。VP2蛋白是病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，與病毒的抗原性、免疫原 性、毒力、細(xì)胞嗜性等有關(guān)，另外，VP2蛋白也是IBDV的保護(hù)性抗原成分，與病毒中和性抗體 的誘導(dǎo)和識(shí)別等生物學(xué)功能有關(guān)，其位于病毒粒子的外表面，占總結(jié)構(gòu)蛋白量的51%，與另 一主要結(jié)構(gòu)蛋白VP3-起構(gòu)成核衣殼的骨架。研究已經(jīng)證實(shí)VP2主要暴露在核衣殼的外面， 攜帶病毒主要的中和性抗原表位。
[0003] VP2基因在外源系統(tǒng)中表達(dá)的方法很多，比如原核表達(dá)系統(tǒng)，該系統(tǒng)表達(dá)量較高， 但產(chǎn)物往往為包涵體，不具備生物活性;酵母表達(dá)系統(tǒng)對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的糖基化修飾不完全;而 哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)雖然能夠?qū)Ρ磉_(dá)產(chǎn)物進(jìn)行糖基化等修飾，產(chǎn)生活性蛋白，但其表達(dá) 水平較低、不易于放大，而且細(xì)胞生長(zhǎng)條件要求較高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種雞傳染性法氏囊病毒VP2 蛋白。
[0005] 為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下：
[0006] 一種雞傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白，編碼該VP2蛋白的核苷酸序列含有如SEQ ID No. 1所示序列。
[0007] 作為優(yōu)選，該VP2蛋白由含有SEQ ID No. 1所示序列的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染sf9細(xì)胞表達(dá) 而得。
[0008] 本發(fā)明的目的之二在于提供制上述的雞傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白的方法，包 括以下步驟：
[0009] 1)合成:化學(xué)合成SEQ ID No. 1序列，與載體質(zhì)粒連接，得到重組質(zhì)粒；
[0010] 2)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，構(gòu)建包含SEQ ID No.l序列的表達(dá)載體；
[0011] 3)轉(zhuǎn)染:將表達(dá)載體轉(zhuǎn)染sf9細(xì)胞，得到含有雞傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白的重 組病毒。
[0012]作為優(yōu)選，步驟1)中，所述重組質(zhì)粒是通過(guò)將SEQ IDNo.l序列連接到PUC57載體 上，得到PUC57-VP2重組質(zhì)粒。
[0013]作為優(yōu)選，步驟2)中，利用pTriEx-4質(zhì)粒構(gòu)建包含SEQ IDNo.l序列的表達(dá)載體。 [0014] 作為優(yōu)選，步驟2)中，使用如SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示的引物對(duì)重組質(zhì)粒 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，
[0015] SEQ ID No·2:5 '-TTTGAGCTCATGACCAACCTCCAAGACCAG-3 '；
[0016] SEQ ID No.3:5'-CCCAAGCTTACGGAGGGCACGAATGATGTC-3。
[0017] 作為優(yōu)選，步驟2)中，其PCR擴(kuò)增體系如下:rTaq酶2yL，重組質(zhì)粒lyL，SEQ ID Νο·2 0.5yL,SEQ ID No.3 0.5yL；
[0018] 其PCR擴(kuò)增程序如下:95°C預(yù)變性5min，l個(gè)循環(huán);95°C變性30s，56°C退火30s，72°C 延伸90s，35個(gè)循環(huán);72°C延伸10min，1個(gè)循環(huán)。
[0019]作為優(yōu)選，采用pTriEx-4質(zhì)粒構(gòu)建表達(dá)載體。
[0020] 本發(fā)明的目的之三在于提供上述雞傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白在制備雞傳染性 法氏囊病的疫苗中的應(yīng)用。
[0021] 本發(fā)明的目的之四在于提供一種用于檢測(cè)雞傳染性法氏囊病病毒的試劑盒，所述 試劑盒內(nèi)包括上述雞傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白。
[0022] 相比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果在于：
[0023] 本發(fā)明提供一種雞傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白，編碼該蛋白的核苷酸序列含有 如SEQ ID No.l所示序列。該SEQ ID No.l是根據(jù)昆蟲(chóng)細(xì)胞偏愛(ài)密碼子對(duì)雞IBDV VP2基因進(jìn) 行密碼子優(yōu)化而得，比一般從IBDV病毒擴(kuò)增的VP2基因，更適應(yīng)在昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)，更能提 尚蛋白表達(dá)量。
[0024]下面結(jié)合附圖和【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。
【附圖說(shuō)明】
[0025] 圖1為pUC57-VP2擴(kuò)增產(chǎn)物;其中，Μ泳道為Mark，l泳道為目的基因 VP2;
[0026]圖2為重組質(zhì)粒pTriEx-4-VP2的雙酶切鑒定結(jié)果圖，其中Μ泳道為mark，l泳道為重 組質(zhì)粒pTriEx-4用SacI和Hindlll雙酶切鑒定結(jié)果;2泳道為重組質(zhì)粒pTriEx-4-VP2用SacI 和Hindlll雙酶切鑒定結(jié)果；
[0027] 圖3為SDS-PAGE檢測(cè)重組桿狀病毒Bac-VP2感染Sf9細(xì)胞產(chǎn)物，其中Μ泳道為mark， 1-3泳道為重組桿狀病毒Bac-VP2感染Sf9的細(xì)胞產(chǎn)物;4泳道為為未感染病毒Sf 9的細(xì)胞產(chǎn) 物;5泳道為重組桿狀病毒Bac-VP2感染Sf9細(xì)胞裂解產(chǎn)物Ni-NTA純化結(jié)果；
[0028] 圖4為Western blot檢測(cè)重組桿狀病毒Bac_VP2感染Sf9細(xì)胞產(chǎn)物；其中，Μ泳道為 mark; 1-2泳道:重組桿狀病毒Bac-VP2感染Sf9細(xì)胞產(chǎn)物的Western blot分析結(jié)果；3泳道： 未感染病毒Sf9細(xì)胞產(chǎn)物的Western blot分析結(jié)果；
[0029] 圖5為IFA檢測(cè)重組桿狀病毒Bac_VP2感染Sf9細(xì)胞產(chǎn)物。左圖：重組桿狀病毒Bac-VP2感染Sf9細(xì)胞的IFA分析結(jié)果;右圖：未感染病毒Sf9細(xì)胞的IFA分析結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0030]本發(fā)明提供一種雞傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白，其特征在于，該VP2蛋白的核苷 酸序列含有如SEQ ID No. 1所示序列。
[0031] 本發(fā)明提供一種雞傳染性法氏囊病毒蛋白VP2的制備方法，該方法包括以下步驟：
[0032] 1)優(yōu)化:根據(jù)昆蟲(chóng)細(xì)胞偏愛(ài)密碼子對(duì)雞IBDV VP2基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化，得到優(yōu)化 后的雞IBDV VP2基因序列；
[0033] 2)合成：化學(xué)合成優(yōu)化后的雞IBDV VP2基因序列，與載體質(zhì)粒連接，得到重組質(zhì) 粒；
[0034] 3)構(gòu)建包含SEQ ID No. 1序列的表達(dá)載體；
[0035] 4)轉(zhuǎn)染:將表達(dá)載體轉(zhuǎn)染sf9細(xì)胞，得到含有雞傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白的重 組病毒。
[0036]本發(fā)明應(yīng)用VP2基因序列在昆蟲(chóng)細(xì)胞中進(jìn)行過(guò)優(yōu)化，比一般從IBDV病毒擴(kuò)增的VP2 基因，更適應(yīng)在昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)，更能提尚蛋白表達(dá)量；
[0037]本發(fā)明采用化學(xué)合成IBDV VP2基因的方法，與傳統(tǒng)組織提取DNA或RNA獲得目的基 因的方法相比，基因合成無(wú)需模板，因而不受基因來(lái)源限制，更經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便、省時(shí)省力；
[0038]本發(fā)明以昆蟲(chóng)細(xì)胞作為生物反應(yīng)器制備IBDV VP2,與細(xì)菌、酵母、真核細(xì)胞表達(dá)系 統(tǒng)相比，因 sf9細(xì)胞生長(zhǎng)條件簡(jiǎn)單，可無(wú)⑶2、無(wú)血清、27°C生長(zhǎng)，因此具有節(jié)省成本、產(chǎn)量高、 可大規(guī)模制備的優(yōu)點(diǎn)。
[0039] 本發(fā)明應(yīng)用的昆蟲(chóng)表達(dá)系統(tǒng)使用多角體啟動(dòng)子，能夠高效表達(dá)蛋白，還有完善的 翻譯后修飾，而且昆蟲(chóng)細(xì)胞可以無(wú)血清培養(yǎng)，能夠大規(guī)模用于蛋白的生產(chǎn)。
[0040] 以下【具體實(shí)施方式】中，如未特殊說(shuō)明，所使用的試劑或儀器均可通過(guò)市售的途徑 獲得。
[0041 ] 實(shí)施例1:優(yōu)化雞IBDV VP2基因序列、合成并克隆
[0042] 參考GenBank上公布的雞IBDV VP2基因序列（登錄號(hào)AF508177)，根據(jù)昆蟲(chóng)細(xì)胞偏 愛(ài)密碼子對(duì)雞IBDV VP2基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化，得到優(yōu)化后的雞IBDV VP2基因序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0043]化學(xué)合成優(yōu)化后的雞IBDV VP2基因序列，并將其克隆到pUC57載體上，得到的載體 命名為 PUC57-VP2。
[0044] 實(shí)施例2:構(gòu)建桿狀病毒表達(dá)載體pTriEx-4-VP2
[0045] 實(shí)施例2A)對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增
[0046]設(shè)計(jì)了一對(duì)擴(kuò)增優(yōu)化后的雞IBDV VP2基因全長(zhǎng)的引物，并在上游引物5 '端加入保 護(hù)性堿基及SacI酶切位點(diǎn)，在下游引物5'端加入保護(hù)性堿基及Hindm酶切位點(diǎn)，引物序列 為：
[0047] SEQ ID No.2:5 '-TTTGAGCTCATGACCAACCTCCAAGACCAG-3 '；
[0048] SEQ ID No.3:5 '-CCCAAGCTTACGGAGGGCACGAATGATGTC-3；
[0049] 下劃線(xiàn)部分分別是Sac I和Hind ΙΠ 酶切位點(diǎn)。
[0050] 其PCR反應(yīng)體系：rTaq酶8yL，pUC57-VP21yL，上游引物0.5yL，下游引物0.5yL; ddH20 補(bǔ)足至 20yL;
[0051 ] 其中，rTaq酶購(gòu)自TAKARA公司，pUC57-VP2的濃度為lOOng/yL，上游引物為SEQ ID No.2，濃度為20nM;下游引物為SEQIDNo.3，濃度為20nM。
[0052] 其PCR反應(yīng)程序?yàn)?95 °C預(yù)變性5min，1個(gè)循環(huán);95 °C變性30s，56 °C退火30s，72 °C延 伸90s，35個(gè)循環(huán);72°C延伸lOmin，1個(gè)循環(huán)。
[0053] PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，得到一個(gè)1400bp左右的片段，結(jié)果見(jiàn)圖 1，其中，Μ泳道為Mark，1泳道為目的基因 VP2。切膠回收后進(jìn)行純化。
[0054]實(shí)施例2B)將目的基因 VP2與載體質(zhì)粒pTriEx-4進(jìn)行連接
[0055] 將實(shí)施例2A)獲得的目的基因 VP2與載體質(zhì)粒pTriEx-4分別用SacI和Hindlll在37 °C恒溫箱中雙酶切2h后進(jìn)行連接。
[0056]其雙酶切操作的具體參數(shù)如下：
[0057] 雙酶切目的基因 VP2體系：目的基因 VP2 16yL、10XM buffer 2yL，SacI限制性?xún)?nèi) 切酶lyL，Hindm限制性?xún)?nèi)切酶lyL;
[0058] 雙酶切載體質(zhì)粒pTriEx-4體系:載體質(zhì)粒pTriEx-4 lyg，10 XM buff er2yL，SacI 限制性?xún)?nèi)切酶lyL，Hindm限制性?xún)?nèi)切酶lyL，ddH20補(bǔ)足至20yL。
[0059] 上述雙酶切目的基因 VP2的產(chǎn)物、雙酶切載體質(zhì)粒pTriEx-4的產(chǎn)物分別經(jīng)1%瓊脂 糖凝膠電泳檢測(cè)，切膠后回收純化用T4連接酶在16°C進(jìn)行連接反應(yīng)，過(guò)夜，得到重組質(zhì)粒 pTriEx-4-VP2〇
[0060] 上述連接反應(yīng)體系：雙酶切載體質(zhì)粒pTriEx-4的純化產(chǎn)物（30ngAiL) 2yL，雙酶切 目的基因 VP2的純化產(chǎn)物（50ngAiL)6yL，10XDNA Ligase Buffer lyL，T4DNA Ligase lyL〇 [0061 ] 實(shí)施例2C)重組質(zhì)粒pTriEx-4-VP2轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞
[0062] 將實(shí)施例2B)得到的重組質(zhì)粒pTriEx-4_VP2與大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞混勻后冰 浴30min，42°C水浴熱擊90s后立即轉(zhuǎn)移至冰上放置lOmin，加入LB新鮮培養(yǎng)基，37°C恒溫?fù)u 床培養(yǎng)lh后，離心棄去部分上清，以剩余部分培養(yǎng)基重懸菌泥后均勾涂布于含Amp ici 11 in 的LB平板上，37 °C恒溫培養(yǎng)箱倒置過(guò)夜培養(yǎng)。挑取單菌落，于含Ampi ci 11 in (100ng/mL)的LB 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)8h，得到菌液。
[0063] 實(shí)施例2D)PCR鑒定陽(yáng)性菌
[0064]取實(shí)施例2C)得到的菌液，進(jìn)行PCR鑒定，挑選出陽(yáng)性菌。
[0065] PCR鑒定的反應(yīng)體系:rTaq酶8yL，菌液lyL，上游引物0.5yL，下游引物0.5yL，ddH20 補(bǔ)足至20μL。上游引物為SEQIDNo.2，濃度為20nM ;下游引物為SEQIDNo.3，濃度為20nM。
[0066] PCR鑒定的反應(yīng)程序:95°C預(yù)變性5min，l個(gè)循環(huán);95°C變性30s，56°C退火30s，72°C 延伸90s，35個(gè)循環(huán);72°C延伸10min，1個(gè)循環(huán)。
[0067] PCR鑒定后的產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，擴(kuò)增得到1400bp左右基因片段即為 陽(yáng)性菌，試劑盒提取陽(yáng)性菌的質(zhì)粒。
[0068] 實(shí)施例2E)雙酶切鑒定
[0069]將實(shí)施例2D)得到的陽(yáng)性菌的質(zhì)粒，經(jīng)SacI和Hindm雙酶切鑒定，其結(jié)果如圖2所 示，得到大小分別約是5.2kb和1.4kb的基因片段，鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為pTriEx-4-VP2,并送至生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。實(shí)施例3:轉(zhuǎn)染sf 9昆蟲(chóng)細(xì)胞
[0070] 將無(wú)血清培養(yǎng)基(BacVector Insect Cell Medium)培養(yǎng)的Sf9細(xì)胞鋪入六孔板， 鋪板濃度為1 X 106cells/孔。
[0071] 轉(zhuǎn)染體系:無(wú)血清培養(yǎng)基lmL;昆蟲(chóng)轉(zhuǎn)染試劑5yL，桿狀病毒DNA 5yL;pTriEx-4-VP2 5yL;其中，昆蟲(chóng)轉(zhuǎn)染試劑為品牌為GeneJuice?的轉(zhuǎn)染試劑；桿狀病毒的品牌及型號(hào)為 BacMagic?-3;pTriEx-4-VP2 重組質(zhì)粒的濃度為 500ng/yL。
[0072]棄去六孔板中的無(wú)血清培養(yǎng)基，將轉(zhuǎn)染體系全部加入到板孔中，28°C繼續(xù)培養(yǎng)5d， 收集培養(yǎng)基，即為P1代重組桿狀病毒。
[0073] 將P1代重組病毒按照Μ0Ι = 0.05-0.1接種貼壁培養(yǎng)的Sf 9細(xì)胞傳代兩次，獲得P3代 重組桿狀病毒，命名為Bac-VP2,該病毒中含有得到含有雞傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白的 重組病毒。
[0074] 實(shí)施例4:重組桿狀病毒Bac_VP2的鑒定
[0075]實(shí)施例4A)SDS-PAGE和Western blot聯(lián)合檢測(cè)
[0076] 將實(shí)施例3)得到的Bac-VP2按照Μ0Ι = 1-5接種懸浮培養(yǎng)的Sf9細(xì)胞，28°C繼續(xù)培養(yǎng) 72h后，離心收集細(xì)胞，加入RIPA裂解液進(jìn)行裂解，獲得蛋白液。取少量上述蛋白加入5 X SDS LoadingBuffer，以10%分離膠和4%濃縮膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳。SDS-PAGE結(jié)果如3所示，細(xì) 胞感染Bac-VP2后，其細(xì)胞裂解蛋白在58kDa附近有一條帶。
[0077]然后將上述SDS-PAGE電泳條帶轉(zhuǎn)印到NC膜上以5%脫脂奶粉封閉，先后以一抗稀 釋液(雞IBDV陽(yáng)性血清)和二抗稀釋液(HRP標(biāo)記兔抗雞IgG)孵育，DAB底物顯色后觀(guān)察特異 性條帶以確定雞傳染性法氏囊病毒VP2蛋白的表達(dá)。Western blot結(jié)果如圖4所示，該條帶 與雞IBD陽(yáng)性血清發(fā)生特異性反應(yīng)。
[0078]實(shí)施例4B)間接免疫熒光檢測(cè)
[0079] 將實(shí)施例3)得到的Bac-VP2按照Μ0Ι = 1-5接種貼壁培養(yǎng)的Sf9細(xì)胞，28°C繼續(xù)培養(yǎng) 72h后，棄掉培養(yǎng)基，以4 %多聚甲醛室溫固定30min; TOST洗滌三次并拍干后以1000倍稀釋 的雞IBD陽(yáng)性血清為一抗4°C孵育過(guò)夜；以PBST洗滌三次并拍干后以2000倍稀釋的FITC標(biāo)記 的兔抗雞IgG孵育，37 °C反應(yīng)2h;再次以PBST洗滌三次，置于熒光顯微鏡下觀(guān)察，結(jié)果如圖5 所示，可以看到重組桿狀病毒Bac-VP2感染后的細(xì)胞呈現(xiàn)特異性的熒光，而對(duì)比例則無(wú)熒光 反應(yīng)。
[0080] 實(shí)施例5:雞傳染性法氏囊病毒IBDV VP2蛋白的純化
[0081] 使用 Amic()n?Pro Affinity Concerntration Kit Ni-NTA進(jìn)行雞傳染性法氏 囊病毒IBDV VP2蛋白的純化。其具體操作步驟為:取200yL Ni-NTA加入到平衡柱中，1000X g離心lmin;以2.5倍體積的Binding buffer清洗平衡住，1000 X g離心lmin;取5mL實(shí)施例 4A)的蛋白液加入到平衡柱中，室溫低速搖床孵育60min，1000 X g離心lmin ;將Amicon Ultra-〇.5微型管介導(dǎo)平衡柱下方，再在平衡柱中加入500yL Elution buffer，4000Xg離 心15min;再將Ami con Ultra-0.5微型管倒置放入2mL收集管，1000 X g離心2min，獲得純化 蛋白HiS-VP2，以SDS-PAGE進(jìn)行鑒定，結(jié)果如圖3所示。
[0082] 實(shí)施例6:間接ELISA方法
[0083] 將實(shí)施例5獲得的純化蛋白His-VP2用包被液稀釋至5mg/L，取lOOyL/孔包被酶標(biāo) 板，4 °C過(guò)夜；將陽(yáng)性血清和陰性血清分別稀釋100倍，37 °C孵育2h; PBST洗滌三次后加入稀 釋的兔抗雞IgG孵育，37°C反應(yīng)lh;再以TOST洗滌三次，TMB顯色15min;加入2M H2S〇4終止反 應(yīng)，于450nm處讀取吸光值，結(jié)果如表1所示。
[0084] 表1間接ELISA鑒定結(jié)果
[0087] 臨界值=0 · 168+0 · 0890 X 3 = 0 · 435，P/N>2 · 1;
[0088] 即以此種用于檢測(cè)雞傳染性法氏囊病病毒的ELISA檢測(cè)試劑盒成立。
[0089] 在進(jìn)行ELISA檢測(cè)時(shí)，100倍稀釋的待檢血清0D45Q>0.435，即可視為陽(yáng)性。
[0090]上述實(shí)施方式僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，不能以此來(lái)限定本發(fā)明保護(hù)的范圍， 本領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明的基礎(chǔ)上所做的任何非實(shí)質(zhì)性的變化及替換均屬于本發(fā)明所 要求保護(hù)的范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種雞傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白，其特征在于，編碼該VP2蛋白的核苷酸序列含 有如SEQ ID No.l所示序列。2. 如權(quán)利要求1所述的雞傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白，其特征在于，該VP2蛋白由含有 SEQ ID No.l所示序列的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染sf9細(xì)胞表達(dá)而得。3. 制備如權(quán)利要求1或2所述的雞傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白的方法，其特征在于，包 括以下步驟： 1) 合成:化學(xué)合成SEQ ID No.l序列，與載體質(zhì)粒連接，得到重組質(zhì)粒； 2) 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，構(gòu)建包含SEQ ID No.l序列的表達(dá)載體； 3) 轉(zhuǎn)染:將表達(dá)載體轉(zhuǎn)染sf9細(xì)胞，得到含有雞傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白的重組病 毒。4. 如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，步驟1)中，所述重組質(zhì)粒是通過(guò)將SEQ IDNo. 1序列連接到pUC57載體上，得到pUC57-VP2重組質(zhì)粒。5. 如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，步驟2)中，利用pTriEx-4質(zhì)粒構(gòu)建包含SEQ IDNo. 1序列的表達(dá)載體。6. 如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，步驟2)中，使用如SEQ ID No. 2和SEQ ID No. 3所示的引物對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增， SEQ ID No.2:5，-TTTGAGCTCATGACCAACCTCCAAGACCAG-3,； SEQ ID No.3:5'-CCCAAGCTTACGGAGGGCACGAATGATGTC-3。7. 如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步驟2)中，其PCR擴(kuò)增體系如下:rTaq酶2yL， 重組質(zhì)粒lyL，SEQ ID Νο·2 0.5yL，SEQ ID Νο·3 0.5yL; 其PCR擴(kuò)增程序如下:95 °C預(yù)變性5min，1個(gè)循環(huán);95 °C變性30s，56 °C退火30s，72 °C延伸 90s，35個(gè)循環(huán)；72°C延伸lOmin，1個(gè)循環(huán)。8. 如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，采用pTriEx-4質(zhì)粒構(gòu)建表達(dá)載體。9. 如權(quán)利要求1或2所述的雞傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白在制備雞傳染性法氏囊病的 疫苗中的應(yīng)用。10. -種用于檢測(cè)雞傳染性法氏囊病病毒的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒內(nèi)包括如 權(quán)利要求1或2所述的雞傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白。
【文檔編號(hào)】A61K39/12GK106046123SQ201610375787
【公開(kāi)日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2016年5月30日
【發(fā)明人】任廣彩, 劉傳高, 黃妙容, 陳瑞愛(ài)
【申請(qǐng)人】廣東溫氏大華農(nóng)生物科技有限公司, 肇慶大華農(nóng)生物藥品有限公司