一種便捷式降鈣素原檢測試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術領域，具體地說涉及一種便捷式降鈣素原檢測試劑盒。
【背景技術】
[0002] 目前定量免疫檢測技術中，主要有以下幾種定量檢測方法：
[0003] -是配套大型、高度集成的自動化儀器的免疫比濁檢測技術；
[0004] 二是酶聯(lián)免疫層析檢測技術；
[0005] 三是免疫層析快速檢測技術；
[0006] 其中免疫比濁檢測技術和酶聯(lián)免疫檢測技術存在樣本需要預處理、操作復雜、檢 測時間長、需配套復雜的大型儀器、機動性差、出報告時間長等缺點，更適合大批量樣本的 集中檢測，不適合急診及各科室門診、社區(qū)醫(yī)院、小型診所、急救現(xiàn)場等的快速檢測。
[0007] 而免疫層析快速檢測技術是近年發(fā)達國家發(fā)展起來的一種快速免疫分析技術。其 原理是樣本液在毛細迀移作用下在硝酸纖維素膜上迀移，其中的待測物與膜上一定區(qū)域的 抗體(抗原)結合，通過有色標記物，十幾分鐘甚至幾分鐘內(nèi)即可得到肉眼可見的直觀結果。 免疫層析快速檢測技術不需將游離的抗體(抗原)和形成復合物的抗體(抗原)進行分離，省 去了繁瑣洗滌步驟，因而操作便捷，出報告時間短，在基層醫(yī)療機構、急診、現(xiàn)場、家庭自檢 等場所得到了廣泛的應用。
[0008] 以膠體金為標記物的第一代免疫層析技術已發(fā)展了將近30多年，目前仍廣泛應 用，但由于其只能用于定性或半定量的檢測，難以滿足臨床對微量、超微量分析物定量檢測 的要求。急需一種能定量快速檢測的新技術產(chǎn)品替代膠體金免疫分析產(chǎn)品，滿足臨床診斷 需求。一些診斷試劑企業(yè)開發(fā)了能定量檢測的熒光免疫檢測試劑，但存在抗干擾能力差，使 用不方便等缺點。
[0009] 其中中國國家知識產(chǎn)權局網(wǎng)站上公開了一種降鈣素原檢測試紙條，采用轉換發(fā)光 技術，但其檢測方法易受類風濕因子和嗜異性抗體的干擾，造成假陽性，而且使用過程需要 對試紙條進行定標，增加了操作復雜性。
[0010] 中國國家知識產(chǎn)權局網(wǎng)站上還公開了一種降鈣素原熒光免疫層析法檢測試劑盒， 包括PCT反應板，HS-CRP檢測緩沖液，HS-CRP ID芯片，其使用過程為使用者將HS-CRP ID芯 片插入熒光檢測儀讀取ID芯片數(shù)據(jù)，然后將樣品加入HS-CRP檢測緩沖液中反應1分鐘，然后 立刻將反應后的HS-CRP檢測緩沖液加入HS-CRP反應板加樣孔中進行反應，反應結束后插入 熒光檢測儀讀取熒光信號。其檢測過程需讀取ID芯片數(shù)據(jù)和計時反應兩次，操作過程復雜， 而且ID芯片無加密功能，容易被復制篡改；而且該方法同樣易受類風濕因子和嗜異性抗體 的干擾，造成假陽性。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0011] 本發(fā)明所要解決的問題是針對現(xiàn)有技術的不足，提供一種不易受類風濕因子和嗜 異性抗體的干擾、操作簡單的便捷式降鈣素原檢測試劑盒。
[0012] 為了解決上述技術問題，本發(fā)明所采用的技術方案為:一種便捷式降鈣素原檢測 試劑盒，包括試紙條、用于固定試紙條的上卡槽(上殼體)和下卡槽（下殼體）、射頻識別芯 片;所述的試紙條包括塑料膠板和塑料膠板上依次設置的樣品墊、熒光示蹤物標記的降鈣 素原第一抗體承載墊、纖維素膜和吸水墊;所述的第一抗體承載墊和吸水墊分別搭接于纖 維素膜的兩端;所述樣品墊的一端搭接于第一抗體承載墊上;所述樣品墊為經(jīng)過抗人紅細 胞抗體溶液處理、具有吸附紅細胞作用的樣品墊;所述纖維素膜上具有固定降鈣素原第二 抗體的檢測帶T和固定羊抗鼠抗體的質(zhì)控帶C;所述的試紙條置于上卡槽和下卡槽相互拼合 構成的腔體內(nèi)；所述的上卡槽上對應于樣品墊的位置設置有用于添加用樣品稀釋液稀釋后 的目標分析物校準品或待測樣本的加樣孔(即該加樣孔用于添加用樣品稀釋液稀釋后的目 標分析物校準品或用樣品稀釋液稀釋后的待測樣本），對應于纖維素膜位置設置有檢測窗 口；所述樣品稀釋液為含有類風濕因子和嗜異性抗體阻斷劑的緩沖液;所述的下卡槽靠近 左端設置有射頻識別芯片。
[0013] 本發(fā)明所述的阻斷劑為鼠熱處理IgG(將鼠 IgG(小鼠 IgG)置于60-75°C水浴中加熱 10分鐘即可得到熱處理IgG)或商業(yè)化阻斷劑復合物(如羅氏的MAB33、SCABTIB0D的HBR等）。
[0014] 本發(fā)明所述的射頻識別芯片用于存儲試紙條分析物濃度與熒光信號之間的對應 關系計算方程、測試板生產(chǎn)日期、批號、有效期、參考范圍等信息。
[0015] 本發(fā)明所述降鈣素原第一抗體為能特異性結合降鈣素原第一表位的鼠單克隆抗 體(為通過降鈣素原抗原免疫小鼠取得的脾細胞與骨髓細胞融合，篩選取得能永久產(chǎn)生降 鈣素原第一表位抗體的雜交瘤細胞，并將此雜交瘤細胞培養(yǎng)分離純化獲得目標鼠單克隆抗 體（"能特異性結合降鈣素原第一表位的鼠單克隆抗體"獲得過程為行業(yè)常規(guī)技術）。
[0016] 本發(fā)明所述降鈣素原第二抗體為能特異性結合降鈣素原第二表位的鼠單克隆抗 體(為通過降鈣素原抗原免疫小鼠取得的脾細胞與骨髓細胞融合，篩選取得能永久產(chǎn)生降 鈣素原第二表位抗體的雜交瘤細胞，并將此雜交瘤細胞培養(yǎng)分離純化獲得目標鼠單克隆抗 體)。
[0017] 本發(fā)明所述熒光示蹤物為能在一定波長激發(fā)光源的激發(fā)下產(chǎn)生熒光的帶有功能 團的有機納米微球，進一步地，優(yōu)選帶有羧基功能基團的有機熒光微球。
[0018] 本發(fā)明所述樣本墊為濾紙、玻璃纖維、聚酯纖維、無紡布中的一種。
[0019] 本發(fā)明所述纖維素膜為硝酸纖維素膜。
[0020] 本發(fā)明所述熒光示蹤物標記的降鈣素原第一抗體承載墊為濾紙、玻璃纖維、聚酯 纖維、無紡布中的一種。
[0021] 本發(fā)明所述吸水墊為濾紙。
[0022] 本發(fā)明便捷式降鈣素原檢測試劑盒的制備方法為：
[0023] 1)熒光示蹤物標記的降鈣素原第一抗體(熒光抗體)的制備
[0024]用10mmol/L、pH=6.5磷酸鹽緩沖液將羧基熒光微球(如東莞市漢諾生物技術有限 公司銷售的Carboxylate Microspheres和絲bdt§#Multifluorescent Microspheres中的一種)稀釋到濃度為5mg/ml，配制成微球懸液，每10ml上述微球懸液中加 入EDAC(乙基二甲基胺丙基碳化二亞胺，CAS: 25952-53-8) 1~10mg，溶解混勻，室溫靜置1小 時，lOOOOrpm離心20min，去上清液，然后將沉淀懸浮于等體積的10mmol/L pH=7.2的磷酸 鹽緩沖液中，超聲分散;然后向羧基微球懸液中加入降鈣素原第一表位單克隆抗體(能特異 性結合降鈣素原第一表位的鼠單克隆抗體），每10 m 1上述微球懸液中加入抗體1~5 m g，混 合，室溫反應2小時，再向上述微球懸液中加入牛血清白蛋白，使得微球懸液中牛血清白蛋 白的濃度為2~20mg/ml，混勻，室溫反應1小時；lOOOOrpm離心20min，去上清，沉淀懸浮于等 體積的10mm 〇l/L pH=7.2的磷酸鹽緩沖液中，超聲分散，4°C保存?zhèn)溆茫?br>[0025] 2)熒光示蹤物標記的降鈣素原第一抗體承載墊的制備
[0026]用步驟（1)制備的熒光抗體噴涂稀釋液稀釋熒光抗體到0.5~2mg/ml，在三維噴點 平臺上將熒光抗體涂于玻璃纖維墊上，37°C干燥1小時，備用；
[0027] 3)纖維素膜包被抗體的制備
[0028]將硝酸纖維素膜黏貼在PVC塑料膠板中間位置，用抗體包被稀釋液分別稀釋降鈣 素原第二表位單克隆抗體和羊抗鼠抗體到濃度為0.5~2.0mg/ml制備成噴膜液，其中，在三 維噴點平臺上噴膜液以條帶狀噴點在硝酸纖維素膜上適當位置(分別形成固定降鈣素原第 二抗體的檢測帶T和固定羊抗鼠抗體的質(zhì)控帶C)，37°C干燥1小時，備用。
[0029] 4)樣品墊的預處理
[0030] 將裁剪好的樣品墊置于抗人紅細胞抗體溶液中浸泡5分鐘，撈出后瀝干