B型肝炎慢性化素因的檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及包括與B型肝炎慢性化和/或病癥發(fā)展有關(guān)的等位基因在內(nèi)的B型肝炎 慢性化和/或病癥發(fā)展的素因的檢測(cè)方法、對(duì)慢性B型肝炎或其病癥發(fā)展進(jìn)行檢測(cè)的方法、 用于檢測(cè)B型肝炎慢性化和/或病癥發(fā)展的素因的試劑、W及包含該試劑的B型肝炎慢性化 和/或病癥發(fā)展的檢測(cè)試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 據(jù)稱，世界人口的1/3比例的人感染B型肝炎病毒化BVKB型肝炎可大致分為一時(shí) 性終止的一時(shí)性感染和慢性肝炎。對(duì)于急性肝炎，在感染后經(jīng)1~6個(gè)月的潛伏期即出現(xiàn)癥 狀，幾周后進(jìn)入恢復(fù)階段。然而，在急性肝炎的發(fā)病患者中，有1~2%的人具有暴發(fā)性肝炎 的發(fā)病危險(xiǎn)性，暴發(fā)性肝炎的發(fā)病患者中有70~80%會(huì)死亡。
[0003] 另外，由于感染的皿V不從體內(nèi)清除而在肝臟中停留6個(gè)月W上會(huì)成為攜帶者。8~ 9成的攜帶者在歷經(jīng)無(wú)癥狀期、一時(shí)性肝炎期、肝炎平靜期之后，W無(wú)癥狀攜帶者的狀態(tài)度 過(guò)。然而，其中的1~2成會(huì)轉(zhuǎn)變成慢性肝炎，其中的一部分會(huì)進(jìn)一步轉(zhuǎn)變成肝硬化、肝癌。據(jù) 稱，B型肝炎病毒慢性攜帶者多數(shù)分布在東南亞、東太平洋地區(qū)，特別是在日本約有150萬(wàn)人 為B型肝炎感染者。
[0004] 皿V感染后的過(guò)程有許多分支，人們主要探究了與慢性肝炎、肝癌有關(guān)的病毒一方 的遺傳因素。然而，近年來(lái)，關(guān)于宿主一方的遺傳因素的探究也在開(kāi)展之中，根據(jù)使用包括 日本人在內(nèi)的亞洲人樣本的全基因組關(guān)聯(lián)分析(Genome Wide Association Study:GWAS)， 報(bào)告了與B型慢性肝炎(C皿)有關(guān)的新的遺傳因素。提出了在皿V持續(xù)感染、病毒清除方面， HLA-DPAl和HLA-DPBl與其相關(guān)(非專利文獻(xiàn)1、非專利文獻(xiàn)2)，還提出了HLA-DR與具有連鎖 不平衡的HLA-DQ的關(guān)聯(lián)性(非專利文獻(xiàn)3)。然而，在使用GWAS的分析中，與慢性化相關(guān)的其 他影響力較大的遺傳因素未被發(fā)現(xiàn)。另外，針對(duì)癌變而言，根據(jù)近年的GWAS可見(jiàn)，中國(guó)報(bào)告 了幾個(gè)宿主遺傳因素(非專利文獻(xiàn)4和5)。
[0005] 現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0006] 非專利文獻(xiàn)
[0007] 非專利文獻(xiàn)l:Kamatani Y,Wattanapokayakit S,Ochi H,Kawaguchi T, Takahashi A,et al.(2009)A genome-wide association study identifies variants in the HLA-DP locus associated with chronic hepatitis B in Asians.Nat Genet 41:591-595.
[000引 非專利文獻(xiàn)2:Nishida N,et.al. ,Genome-Wide Association Sl:udy Confirming Association of HLA-DP with Protection against Chronic Hepatitis B and Viral Clearance in Japanese and Korean Plos ONE June 2012 vol.7,Issue 5,e39175 [0009]非專利文獻(xiàn)3:Mbarek H，0chi H，Urabe Y，Kumar V，Kubo M，et al.(2011)A genome-wide association study of chronic hepatitis B identified novel risk locus in a Japanese population.Hum Mol Genet 20:3884-3892
[0010] 非專利文獻(xiàn)4:Li S，Qian J，Yang Y，Zhao W，Dai J，et al . (2012)GWAS Identifies Novel Susceptibility Loci on 6p21.32and 21q21.3for Hepatocellular Carcinoma in Chronic Hepatitis B Virus Carriers.PloS Genet 7(5):e39175
[0011] 非專利文獻(xiàn)5:Jiang DK，Sun J，Cao G，Liu Y，Lin D，et al.(2013)Genetic variants in STAT4 and HLA-DQ genes confer risk of hepatitis B virus-related hepatocellular carcinoma.Nat Genet 45:72-5

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 發(fā)明要解決的課題
[0013] 對(duì)于HLA-DP而言，雖然已存在通過(guò)B型慢性肝炎患者組和比較對(duì)照組對(duì)等位基因 頻率進(jìn)行比較的報(bào)告（非專利文獻(xiàn)1)，但是，在該等位基因頻率的研究中，由于使用非肝炎 患者組作為比較對(duì)照組，因而所引起的問(wèn)題是，尚不明確該實(shí)驗(yàn)結(jié)果是否反映了B型慢性肝 炎患者組和健康者組的差異。另外，關(guān)于病癥發(fā)展，與HLA-DPB等位基因的關(guān)聯(lián)也未作研究。
[0014] 因此，本發(fā)明的目的在于，使用健康者組、皿V患者組、B型慢性肝炎組和B型肝炎病 癥發(fā)展組(肝硬化或肝癌)來(lái)進(jìn)行分析，鑒定對(duì)B型慢性肝炎和病癥發(fā)展具有敏感性和抵抗 性的等位基因，從而提供包括與B型肝炎慢性化和/或病癥發(fā)展有關(guān)的等位基因在內(nèi)的B型 肝炎慢性化和/或病癥發(fā)展的遺傳素因的檢測(cè)方法、慢性B型肝炎、肝硬化或肝癌的檢測(cè)方 法、用于檢測(cè)B型肝炎慢性化和/或病癥發(fā)展的素因的試劑和包含該試劑的B型肝炎慢性化 和/或病癥發(fā)展的檢測(cè)試劑盒。
[0015] 解決課題的方法
[0016] 本發(fā)明者等人使用健康者組、HBV患者組、B型慢性肝炎組和B型肝炎病癥發(fā)展組 (肝硬化或肝癌），實(shí)施關(guān)于HLA-DP的分型，找出了與B型肝炎慢性化有關(guān)的等位基因。由此， 建立了使用該等位基因的B型肝炎慢性化和病癥發(fā)展的素因的檢測(cè)方法、對(duì)慢性B型肝炎、 肝硬化或肝癌進(jìn)行檢測(cè)的方法、用于檢測(cè)B型肝炎慢性化和病癥發(fā)展的素因的試劑和包括 該試劑的B型肝炎慢性化和病癥發(fā)展的檢測(cè)試劑盒。
[0017] 目P，本發(fā)明提供了如下技術(shù)方案。
[0018] (1) -種B型肝炎慢性化和/或病癥發(fā)展的素因的檢測(cè)方法，所述方法包括：
[0019] a)比較工序:將與B型肝炎慢性化和/或病癥發(fā)展有關(guān)的等位基因和檢測(cè)體中對(duì)應(yīng) 于所述等位基因的堿基序列或氨基酸序列進(jìn)行比較；
[0020] b)分析工序:對(duì)檢測(cè)體中對(duì)應(yīng)于所述等位基因的位點(diǎn)的堿基或氨基酸殘基是否與 等位基因的堿基或氨基酸殘基一致進(jìn)行分析;W及，
[0021] C)確定工序:對(duì)檢測(cè)體的B型肝炎是否發(fā)生慢性化和/或病癥是否發(fā)展進(jìn)行確定。
[0022] (2)如（1)所述的方法，與B型肝炎慢性化和/或病癥發(fā)展有關(guān)的等位基因?qū)型肝 炎慢性化和/或病癥發(fā)展具有敏感性或者抵抗性。
[0023] (3)如(2)所述的方法，所述與B型肝炎慢性化和/或病癥發(fā)展有關(guān)的等位基因的組 合是下述組合中的任意一種:僅所述具有敏感性的等位基因的組合、僅所述具有抵抗性的 等位基因的組合、或者所述具有敏感性的等位基因與所述具有抵抗性的等位基因的組合。
[0024] (4)如(2)或(3)所述的方法，對(duì)所述B型肝炎慢性化具有敏感性的等位基因是HLA-DPB1*05: Ol和HLA-DPB1*09: Ol，對(duì)所述B型肝炎慢性化具有抵抗性的等位基因是HLA-DPB1* 04:02、化4-0?81*04:01和化4-0?81*02:01，對(duì)所述8型慢性肝炎的病癥發(fā)展具有抵抗性的 等位基因是HLA-DPB1*02: Ol。
[0025] (5)如(2)~(4)中任一項(xiàng)所述的方法，所述對(duì)B型肝炎慢性化具有抵抗性的等位基 因的組合是HLA-DPB1*02: Ol、HLA-DPB1*04: Ol或HLA-DPB1*04:0 巧肌 LA-DPB1*05: Ol或HLA-DPB1*09:01。
[0026] (6)根據(jù)(1)~(5)所述的方法，對(duì)B型肝炎慢性化和/或病癥發(fā)展進(jìn)行檢測(cè)的方法。
[0027] (7)-種用于檢測(cè)B型肝炎慢性化和/或病癥發(fā)展的素因的試劑，其含有檢測(cè)與B型 肝炎慢性化和/或病癥發(fā)展有關(guān)的等位基因的引物。
[0028] (8)如（7)所述的試劑，與所述B型肝炎慢性化和/或病癥發(fā)展有關(guān)的等位基因?qū) 型肝炎慢性化和/或病癥發(fā)展具有敏感性或者抵抗性。
[0029] (9)如(8)所述的試劑，與B型肝炎慢性化和/或病癥發(fā)展有關(guān)的等位基因的組合是 下述組合中的任意一種:僅所述具有敏感性的等位基因的組合、僅所述具有抵抗性的等位 基因的組合、或者所述具有敏感性的等位基因和所述具有抵抗性的等位基因的組合。
[0030] (10)如（8)或（9)所述的試劑，所述對(duì)B型肝炎慢性化具有敏感性的等位基因是 化八-0?81*05:01和化4-0?81*09:01，對(duì)所述8型肝炎慢性他具抵抗性的等位基因是化八-DPB1*04:02、HLA-DPB1*04: Ol和HLA-DPB1*02: Ol，對(duì)所述B型慢性肝炎的病癥發(fā)展具有抵抗 性的等位基因是HLA-DPB1*02: Ol。
[0031] (11)如(8)~（10)中任一項(xiàng)所述的試劑，對(duì)所述B型肝炎慢性化具有抵抗性的等位 基因的組合是化A-DPB1 *02:01、HLA-DPB1 *04:01 或HLA-DPB1 *04:02 和HLA-DPB1 *05:01 或 HLA-DPB1*09:01。
[0032] (12)-種試劑盒，其含有(7)~（11)中任一項(xiàng)所述的用于檢測(cè)B型肝炎慢性化和/ 或病癥發(fā)展的素因的試劑，所述試劑包含與B型肝炎慢性化和/或病癥發(fā)展有關(guān)的等位基 因。
[0033] 發(fā)明效果
[0034] 在本發(fā)明中，對(duì)于皿V患者組，通過(guò)進(jìn)行與B型肝炎慢性化和/或病癥發(fā)展有關(guān)的等 位基因的分析，能闡明B型肝炎慢性化和/或病癥發(fā)展的分子機(jī)理、并能鑒定藥物祀點(diǎn)候選 分子。另外，通過(guò)對(duì)皿V攜帶者進(jìn)行分析，可對(duì)該攜帶者進(jìn)行分類，從而分成易于發(fā)生慢性化 和病癥發(fā)展的組、W及難W發(fā)生慢性化和病癥發(fā)展的組，其優(yōu)勢(shì)在于，能夠提供有助于確定 后續(xù)治療方針的信息。從而能預(yù)防B型肝炎慢性化和/或病癥發(fā)展，防止惡化，且能進(jìn)行合適 的治療。
[0035] 另外，關(guān)于B型肝炎慢性化和病癥發(fā)展的遺傳因素，沒(méi)有明確包括日本人在內(nèi)的亞 洲人和西方人之間是否存在同樣的傾向。通過(guò)本發(fā)明的與B型肝炎慢性化和/或病癥發(fā)展相 關(guān)的等位基因，能確定專用于包括日本人在內(nèi)的亞洲人的B型肝炎慢性化和/或病癥發(fā)展的 治療方針、鑒定藥物祀點(diǎn)候選分子。
[0036] 進(jìn)而，還能開(kāi)發(fā)精度更高的檢測(cè)試劑盒，除了含有該等位基因之外，還含有其他免 疫相關(guān)基因的單核巧酸多態(tài)性(SNP)。
【附圖說(shuō)明】
[0037] 圖1是表示根據(jù)本發(fā)明的等位基因和DPB1*01:01:01的氨基酸序列的序列比對(duì)的 圖。
【具體實(shí)施方式】
[0038] 本發(fā)明設(shè)及包括與B型肝炎慢性化和/或病癥發(fā)展有關(guān)的等位基因在內(nèi)的B型肝炎 慢性化和/或病癥發(fā)展的遺傳素因的檢測(cè)方法、對(duì)慢性B型肝炎和/或其病癥發(fā)展進(jìn)行檢測(cè) 的方法、用于檢測(cè)B型肝炎慢性化和/或病癥發(fā)展的素因的試劑、W及包括該試劑的B型肝炎 慢性化和/或病癥發(fā)展的檢測(cè)試劑盒。下面對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說(shuō)明。
[0039] (1)本發(fā)明的與B型肝炎慢性化和/或病癥發(fā)展相關(guān)的等位基因
[0040] 本發(fā)明設(shè)及與B型肝炎慢性化和/或病癥發(fā)展相關(guān)的等位基因。所謂與B型肝炎慢 性化、病癥發(fā)展相關(guān)的等位基因，是指對(duì)B型肝炎慢性化、病癥發(fā)展具有敏感性(B型肝炎容 易發(fā)生慢性化、容易發(fā)生病癥發(fā)展)或具有抵抗性(B型肝炎難W發(fā)生慢性化、難W發(fā)生病癥 發(fā)展)的等位基因。
[0041] 在本發(fā)明中，"B型肝炎慢性化"是指皿V持續(xù)感染的狀態(tài)，作為發(fā)病的主要原因，可 W舉出下述情況:來(lái)自于皿V持續(xù)感染者的母嬰感染(垂直感染）的情況;在嬰幼兒時(shí)期，由 于醫(yī)療行為等原因，導(dǎo)致皿V持續(xù)感染者的血液、體液侵入至體內(nèi)的情況;在使用如使身體 的免疫力降低的免疫抑制劑、抗癌