一種降鈣素原光激化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑盒及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及試劑盒診斷檢測(cè)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種降巧素原光激化學(xué)發(fā)光免疫分析 試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 細(xì)菌或病毒等經(jīng)由創(chuàng)面、呼吸道、泌尿道、消化道入侵，在嚴(yán)重創(chuàng)傷，全身抵抗力 下降，體內(nèi)正常菌群失調(diào)，細(xì)菌移位等時(shí)，均可引起機(jī)體出現(xiàn)嚴(yán)重的感染癥狀，是引起臨床 各種并發(fā)癥，如脈毒癥、敗血癥休克，多器官功能障礙癥（multiple organ dys化nction syn化ome，M孤巧，乃至死亡的主要原因。據(jù)美國(guó)2001年統(tǒng)計(jì)資料顯示，該年僅重度脈 血癥就有75. 1萬(wàn)例，平均死亡率高達(dá)28. 5%，該意味著該年死亡的人數(shù)竟然是愛(ài)滋病 (acquired immunodeficien巧syn化ome, AID巧的近S倍。對(duì)感染性疾病及其并發(fā)癥能早 期診斷和及時(shí)治療，可有效降低死亡率。而目前常規(guī)使用的診斷指標(biāo)（如白細(xì)胞分類和計(jì) 數(shù)，C-反應(yīng)蛋白，血常規(guī)檢查等），由于是非特異性的，所W易引起誤診或漏診。
[0003] 1990年發(fā)現(xiàn)的降巧素原（procalcitonin，PCT)經(jīng)證實(shí)其在血清中濃度的增高與 感染的發(fā)生有密切關(guān)系，能為疾病的診斷、鑒別，治療方案的選擇，預(yù)后判斷等提供新的實(shí) 驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)。在正常及健康的個(gè)體中，其血清濃度極低，僅為10-5化g/ml，一般方法檢測(cè)不 到。在全身性細(xì)菌、真菌及寄生蟲(chóng)感染，系統(tǒng)炎癥反應(yīng)綜合癥、敗血癥、急慢性肺炎、急性膜 腺炎、活動(dòng)性肝炎、創(chuàng)傷等患者的血清PCT水平異常增高，其濃度科大正常水平的幾倍甚至 上萬(wàn)倍；在病毒感染，自身免疫性疾病，器官移植排除反應(yīng)等患者的血清濃度不增高或輕微 增高。該就決定了PCT的高度特異性，因此可用于此類疾病的鑒別診斷，在全身性細(xì)菌感染 和脈毒癥輔助鑒別診斷、預(yù)后判斷、療效觀察等方面有很高的臨床價(jià)值，可廣泛用于ICU病 房、血液科、外科、內(nèi)科、器官移植科、治療實(shí)驗(yàn)室等。
[0004] 目前PCT在醫(yī)院和血液系統(tǒng)廣泛使用的檢測(cè)方法看，大部分是標(biāo)記免疫分析技 術(shù)，此技術(shù)具有靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于PCT的基礎(chǔ)研究和臨床各個(gè)領(lǐng) 域的應(yīng)用研究。最常用的標(biāo)記免疫分析技術(shù)是放射免疫分析化IA)和酶免疫分析巧IA)，但 在實(shí)際應(yīng)用中存在著一些缺陷；RIA的放射性核素污染、標(biāo)記物的貨架期短；EIA酶的活性 容易失活，導(dǎo)致其靈敏度不高，酶的大分子標(biāo)記容易影響被標(biāo)記物的空間結(jié)構(gòu)，使得EIA靈 敏度的提高受到限制。
[0005] 光激化學(xué)發(fā)光法（AlphaLisa)是通過(guò)引用激光技術(shù)和納米微球技術(shù)為基礎(chǔ)的新 型化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)，該技術(shù)將被廣泛應(yīng)用于研究生物分子的幸相互作用。AlphaLisa試劑 由含有生物素化抗體、包被有抗體的受體微球和鏈霉親和素化供體微球共同組成。微球表 面覆蓋多糖水凝膠，故能減少非特異性結(jié)合，并增加微球的懸浮性；納米級(jí)微球大大增加了 反應(yīng)的表面積；同時(shí)反應(yīng)在均相進(jìn)行，故它具有快速、免洗板、靈敏度高、量程寬、操作簡(jiǎn)便 實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化操作等優(yōu)點(diǎn)。
[0006] AlphaLisa技術(shù)的核屯、原理是單線態(tài)氧的產(chǎn)生和傳遞。在680nm的光照下，供體 微球中的光敏物質(zhì)受到激發(fā)產(chǎn)生單線態(tài)氧，單線態(tài)氧擴(kuò)散至受體微球，與其中的發(fā)光物質(zhì) 反應(yīng)后產(chǎn)生615nm的化學(xué)發(fā)光。由于單線態(tài)氧在溶液中維持活性的時(shí)間很短（約4 y s)， 只能擴(kuò)散約200nm的距離，因此只有那些通過(guò)包被在微球表面的生物分子拉近受體微球和 供體微球才能產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供一種檢測(cè)降巧素原的試劑盒。
[000引本發(fā)明另一目的在于提供上述檢測(cè)降巧素原的試劑盒的制備方法。
[0009] 本發(fā)明還有一個(gè)目的在于提供上述檢測(cè)降巧素原的試劑盒的檢測(cè)方法。
[0010] 本發(fā)明上述目的通過(guò)W下技術(shù)方案予W實(shí)現(xiàn)：
[0011] 本發(fā)明主要采用光激化學(xué)發(fā)光免疫分析法（AlphaLisa)檢測(cè)PCT。其技術(shù)方案為： 一種降巧素原PCT的光激化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑盒，由（1)白色不透明96孔板，（2)PCT定 標(biāo)品，（3)包被有抗-降巧素原單克隆抗體的受體微球，（4)生物素化抗-降巧素原單克隆 抗體，（5)鏈霉親和素化的供體微球。
[0012] 其中，所述降巧素原定標(biāo)品是降巧素原溶于含有牛血清白蛋白的Tris-HCl緩 沖液中，共六管，濃度依次為 0ng/mL、0. 5ng/mL、2ng/mL、10ng/mL、25ng/mL、50ng/mL，每管 0. 5血凍干；
[0013] 所述包被有抗-降巧素原單克隆抗體的受體微球2. 5mU含抗體濃度為1. 0~ 15. 0 y g/mL ；
[0014] 所述生物素化抗-降巧素原單克隆抗體2. 5血，含抗體濃度為1. 0~15. 0 y g/血；
[0015] 所述鏈霉親和素化的供體微球20血，含微球量30. 0~100. 0 y g/血。
[0016] 包被有抗-降巧素原單克隆抗體的受體微球的制備：將0. 2mg PCT單克隆抗體加 入到帶有濾膜的離屯、管中，W 8 00化/min離屯、5~6min，用標(biāo)記緩沖液化13mol/L，pH 8. OPB巧重復(fù)洗漆6次后，在抗體溶液中加入Img受體微球、10化25mg/mL NaB冊(cè)CN(用標(biāo) 記緩沖液配制）、1. 25 y L 10% Tween-20,用標(biāo)記緩沖液將體積補(bǔ)充到200 y L 37°C避光振 蕩反應(yīng)48小時(shí)。加入lOyL 65mg/mLCM0(用0.8M化OH配制）封閉未結(jié)合位點(diǎn)，37°C避光 解育1小時(shí)后離屯、洗漆，得到已連接抗體的受體微球，稀釋備用。
[0017] PCT 定標(biāo)品，用標(biāo)準(zhǔn)品緩沖液巧Ommol/L Tris-HCl，1. 5% BSA、0. 9% 化C1、0. 05% Proclin-300、0. 01% Tween-20，pH7. 8)將 PCT 配制成 0ng/mL、0. 5ng/mL、2ng/mL、10ng/mL、 25ng/mL、5化g/mL系列濃度，每瓶0. 5血分裝凍干，4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0018] 生物素化抗-降巧素原單克隆抗體，將Im評(píng)CT單克隆抗體加入到帶有濾膜的離 屯、管中，W 8000r/min 離屯、5 ~6min。用標(biāo)記緩沖液（0.1mol/L、化2C03/Na肥03, pH 9. 5) 重復(fù)洗漆6次后，將50 y L抗體溶液中加入5 y L22mg/mL生物素中（用DMS0配制），室溫振 動(dòng)解育化。利用PBS (抑7. 4) 4°C透析24小時(shí)，每化換液一次，收集透析袋中液體，稀釋備 用。
[0019]用所述的試劑盒檢測(cè)PCT的方法，測(cè)定的基礎(chǔ)是標(biāo)記免疫反應(yīng)。順次向白色不透 明微孔板中加入定標(biāo)品或待檢測(cè)樣品，包被有抗-降巧素原單克隆抗體的受體微球，生物 素化抗-降巧素原單克隆抗體進(jìn)行免疫反應(yīng)；接著加入鏈霉親和素化的供體微球進(jìn)行反應(yīng) 后檢測(cè)信號(hào)值，W加入PCT定標(biāo)品的檢測(cè)值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，W加入待檢測(cè)樣品的檢測(cè)值從 標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算被測(cè)樣品的PCT含量。
[0020] 所述的檢測(cè)PCT的方法，其操作為；將定標(biāo)品、包被有抗-降巧素原單克隆抗體 的受體微球、生物素化抗-降巧素原單克隆抗各25 y L加入到白色不透明板孔中，37°C振 動(dòng)解育15min，然后再加入鏈霉親和素化的供體微球175y^37°C振動(dòng)解育15min后在 A1地aScreen/Lisa檢測(cè)儀上檢測(cè)信號(hào)值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出被測(cè)樣品的PCT含量。
[0021] 上述待測(cè)樣品包括血清。
[0022] 本發(fā)明所用到的受體微球和鏈霉親和素化的供體微球均購(gòu)自Perki址Imer。
[0023]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：
[0024] 本發(fā)明是采用光激化學(xué)發(fā)光檢測(cè)技術(shù)，測(cè)定人血清樣品中的降巧素原的定量體外 診斷試劑盒，可W與其他血清和臨床信息聯(lián)合用于診斷和鑒別診斷個(gè)體感染性疾病。本發(fā) 明的試劑盒采用光激化學(xué)發(fā)光法測(cè)定標(biāo)本中的PCT含量，具有快速、靈敏度高、量程寬、操 作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，在方法學(xué)上較酶免法能達(dá)到更高的靈敏度和更寬的檢測(cè)范圍。
【附圖說(shuō)明】
[0025] 圖1;降巧素原光激化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑盒技術(shù)原理圖。<