一種降鈣素原定量檢測的磁微粒化學(xué)發(fā)光微流控芯片的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)免疫體外診斷領(lǐng)域，具體涉及一種降鈣素原定量檢測的磁微?；瘜W(xué)發(fā)光微流控芯片，能夠在很短時間內(nèi)實現(xiàn)對生物樣品中降鈣素原的定量檢測，具有操作簡單，靈敏度高，低成本等特點。
技術(shù)背景
[0002]降I丐素原(procalcitonin，PCT)是一個小分子蛋白，含有116個氨基酸殘基，分子量為大約13kDa。PCT的氨基酸序列首次在1984年被Moullec等人發(fā)現(xiàn)。它屬于一類相關(guān)蛋白的家族(CAPA肽家族)，包括降鈣素基因相關(guān)肽I和I1、淀粉不溶素、腎上腺髓質(zhì)素和降鈣素。類似于CAPA家族的其他肽，PCT來源于一個前體分子-降鈣素原前體。降鈣素原前體含有141個氨基酸，其N端去除25個氨基酸殘基后得到降鈣素原。
[0003]1993年，有報道發(fā)現(xiàn)PCT水平在細(xì)菌系統(tǒng)感染患者中有所升高。如今PCT已經(jīng)成為伴隨有全身性炎癥和敗血癥疾病的主標(biāo)記物。PCT在臨床診斷中的價值，主要是基于PCT濃度和炎癥嚴(yán)重程度的緊密相關(guān)。PCT在正常人血中濃度低于0.05ng/ml，當(dāng)血清中PCT濃度高于0.5ng/ml時出現(xiàn)重癥敗血癥和/或敗血癥休克的風(fēng)險較低；血清PCT濃度彡2ng/mL出現(xiàn)重癥敗血癥和/或敗血癥休克的風(fēng)險較高，在膿毒血癥、敗血癥患者其濃度顯著增高，可達(dá)1000ng/ml，是正常人的2000倍。PCT可在感染后2個小時后檢測到，對臨床早期診斷具有重要意義，且在感染后12-24小時達(dá)到高峰，體內(nèi)、外穩(wěn)定性好。
[0004]PCT作為一種具有創(chuàng)新意義的嚴(yán)重細(xì)菌性感染等疾病的實驗指標(biāo)，提高了臨床診斷的準(zhǔn)確性。因此，PCT的診斷價值非常之高，使用單克隆抗體定量檢測患者血液中PCT的重要性更是顯而易見。
[0005]目前，用于PCT檢測的方法主要有酶聯(lián)免疫法，免疫比濁法，膠體金免疫層析，免疫熒光法等，這些方法在一定程度上能夠?qū)崿F(xiàn)對PCT的檢測，但是還存在操作復(fù)雜，靈敏度低，檢測成本高等不足?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析(chemiluminescence immunoassay, CLIA)，是將具有高靈敏度的化學(xué)發(fā)光測定技術(shù)與高特異性的免疫反應(yīng)相結(jié)合，用于各種抗原、半抗原、抗體、激素、酶、脂肪酸、維生素和藥物等的檢測分析技術(shù)，是繼放免分析、酶免分析、熒光免疫分析和時間分辨焚光免疫分析之后發(fā)展起來的一項最新免疫測定技術(shù)。中國專利(CN102359958 A)公開了一種檢測降鈣素原的試劑盒，采用酶促化學(xué)發(fā)光法實現(xiàn)對降鈣素原的定量檢測，本方法相比其他傳統(tǒng)方法提高了檢測的靈敏度和準(zhǔn)確性，但需要對檢測樣品進(jìn)行復(fù)雜的預(yù)處理，需要借助大型化學(xué)發(fā)光檢測儀，同時所需試劑消耗量大，檢測時間長。
[0006]近年來，生物分析技術(shù)領(lǐng)域得到了快速的發(fā)展，出現(xiàn)了很多重要的研究方向。微流控芯片分析技術(shù)是其中最活躍的一支，在科研和實際應(yīng)用領(lǐng)域都獲得了廣泛的重視。微流控芯片作為一種新型的分析檢測平臺，具有高通量、集成化、便攜式、易操作、低成本等優(yōu)點，已經(jīng)在眾多領(lǐng)域中得到了廣泛的應(yīng)用，尤其是在免疫分析領(lǐng)域已嶄露頭角。
[0007]表面功能化的磁性微球作為固相載體，可以用來有效地捕獲核酸、蛋白分子、病毒顆粒甚至細(xì)胞，已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于各種生化指標(biāo)的臨床診斷等領(lǐng)域。而微流控芯片系統(tǒng)具有快速、高效、集成化等特點，兩者相結(jié)合，將成為一種新型的高性能檢測方法，以解決當(dāng)前檢測方法中存在的靈敏度低，檢測過程復(fù)雜，難以實現(xiàn)微量樣本檢測的問題，有望進(jìn)一步推動臨床檢測儀器向便攜化和微型化發(fā)展。
[0008]免疫磁珠的生物微流控芯片是將磁顆粒技術(shù)，免疫分析集成到微流控芯片上的一種分析檢測方法，目前這種綜合性的檢測方法的主要難點表現(xiàn)為:1)液體在芯片內(nèi)部微流動的智能控制，目前常采用的方法是在芯片內(nèi)部設(shè)置多個微栗和微閥，使得微流控體系變得更加復(fù)雜化；2)反應(yīng)體系的混合不充分，導(dǎo)致反應(yīng)不充分；3)集成化程度不高，導(dǎo)致非特異性背景高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明的目的是為解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，提出一種降鈣素原定量檢測的磁微?；瘜W(xué)發(fā)光微流控芯片，臨床檢驗人員只需經(jīng)過簡單操作，即可在15分鐘內(nèi)快速實現(xiàn)樣品中降鈣素原濃度的定量檢測。檢測結(jié)果靈敏度高，準(zhǔn)確可靠，重復(fù)性好，交叉污染率低。
[0010]本發(fā)明的技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案如下為:
[0011]—種降鈣素原定量檢測的磁微?；瘜W(xué)發(fā)光微流控芯片，所述微流控芯片結(jié)構(gòu)主要包括蓋片⑴和底片(11)，其中蓋片⑴上的空氣栗(3)，氣流微通道(5)，加樣口⑵、樣本液流通道出)、第一生物標(biāo)記物存儲池(4)、微混合器(7)以及過渡區(qū)(10)依次連接；底片(11)上的過濾器(12)，反應(yīng)池(13)，清洗池(14)，檢測池(15)，溶液釋放通道(18)依次連接；檢測池(15)通過溶液釋放通道(18)與清洗液存儲池(16)和發(fā)光液存儲池(17)連接；第一生物標(biāo)記物存儲池(4)存儲預(yù)封裝酶或發(fā)光劑標(biāo)記的抗降鈣素原抗體溶液；反應(yīng)池(13)存儲預(yù)封裝磁顆粒標(biāo)記的抗降鈣素原抗體；所述清洗液存儲池(16)和發(fā)光液存儲池(17)存儲預(yù)封裝清洗液和發(fā)光基底液；蓋片(I)過渡區(qū)(10)和底片(11)過濾器(12)連接；所述標(biāo)記配體存儲池(5)、清洗液存儲池(9)、發(fā)光基底液存儲池(10)為液體密封池，可通過外力擠壓而局部破裂，釋放液體；過濾器(12)由腔體和濾血膜組成；所述微流控芯片測試流程中，用磁鐵操控磁顆粒移動或聚集。
[0012]具體地，所述第一生物標(biāo)記物存儲池(4)、清洗液存儲池(16)和發(fā)光液存儲池(17)為液囊或腔體，體積為10?500 μ I，進(jìn)一步優(yōu)選10?300 μ I。
[0013]具體地，所述微流控芯片的微混合器是寬度為20?300 μ m，深度為10?100 μ m的蛇形，折線形或方形結(jié)構(gòu)。
[0014]優(yōu)選地，微混合器為寬150 μ m，深度為50 μ m的方形結(jié)構(gòu)，在外部壓力作用下，可使樣本和試劑充分混合，提高反應(yīng)效率。
[0015]具體地，所述微流控芯片的反應(yīng)池為毛細(xì)管微通道，該毛細(xì)管微通道為管狀通道或矩形通道，允許微液體流進(jìn)或通過。
[0016]具體地，所述微流控芯片的反應(yīng)池為管狀通道，直徑為0.5?10mm，作為優(yōu)選微通道的直徑為5mm，進(jìn)一步優(yōu)選2mm或Imm0
[0017]具體地，所述微流控芯片的毛細(xì)管微通道為矩形通道時尺寸范圍:寬為0.1?5臟，深度為0.01?2臟，長為5?40mm η
[0018]優(yōu)選地，所述微流控芯片的毛細(xì)管微通道為矩形通道時尺寸范圍:寬為0.3?2謹(jǐn)，深度為0.2?I謹(jǐn)，長為5?2Ctam。
[0019]具體地，所述微流控芯片的過濾器主要包括具有一定形狀的腔體和濾血膜，所述腔體體積為樣本體積的3?10倍，優(yōu)選腔體體積為樣本體積的4?6倍。
[0020]具體地，所述微流控芯片底片中過濾器內(nèi)的濾血膜材質(zhì)可以為玻璃纖維膜，聚酯纖維膜或CytoSep膜等。
[0021]優(yōu)選地，以玻璃纖維膜作為濾血膜。
[0022]具體地，本發(fā)明所述微流控芯片的過濾器具有濾除樣本雜質(zhì)的功能外，還可以將液體引導(dǎo)進(jìn)入下一級微結(jié)構(gòu)和微通道。
[0023]本發(fā)明所述毛細(xì)管通道的體積小于150 μ 1，作為優(yōu)選，毛細(xì)管通道的體積小于100 μ I，進(jìn)一步優(yōu)選，毛細(xì)管通道體積小于50 μ I。
[0024]具體地，所述發(fā)光基底液包含與酶對應(yīng)的底物及發(fā)光增強劑，可混合后注入同一個發(fā)光液存儲池，或分別注入兩個不同的發(fā)光液存儲池；
[0025]具體地，所述磁顆粒標(biāo)記的抗降鈣素原抗體使用的磁顆粒為超順磁性顆粒，為順磁性的Fe3O4或γ -Fe 203化合物，磁顆粒粒徑為0.1?10 μ m。優(yōu)選Fe 304化合物，且磁顆粒粒徑為I?3 μ m，更優(yōu)選粒徑為2.0 μ m的磁顆粒。
[0026]具體地，本發(fā)明所述微流控芯片，各功能區(qū)之間通過微通道和微結(jié)構(gòu)進(jìn)行銜接，內(nèi)部形成一個完整的液流和氣流系統(tǒng)。
[0027]具體地，本發(fā)明所述微流控芯片蓋片和底片內(nèi)的微通道和微結(jié)構(gòu)的加工工藝包括模塑法、熱壓法、激光刻蝕法和軟光刻法等，本發(fā)明的實施例中優(yōu)選模塑法來制作微流控芯片。
[0028]本發(fā)明所述微流控芯片的蓋片和底片材料可為聚酰胺(PI)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚碳酸酯(PC)，聚二甲基硅氧烷(PDMS)、環(huán)氧樹脂，聚丙烯(PP)和ABS樹脂等，優(yōu)選環(huán)氧樹脂和ABS樹脂，進(jìn)一步優(yōu)選環(huán)氧樹脂。
[0029]具體地，本發(fā)明所述微流控芯片蓋片和底片內(nèi)除上述主要微通道和微結(jié)構(gòu)外還有許多透氣孔用于消除液體流動過程中產(chǎn)生的氣泡，以及用于組裝固定的讓位孔和立柱。
[0030]具體地，所述微流控芯片蓋片上的空氣栗(3)主要是通過氣流通道(5)傳遞壓力，主要作用是用于樣本和第一生物標(biāo)記物的混合，提高一級孵育效果。
[0031]具體地，所述微流控芯片的氣流通道尺寸為0.1?100 μπι，進(jìn)一步優(yōu)選2?50 μ mD
[0032]具體地，所述微流控芯片蓋片的過渡區(qū)是蓋片和底片連接的樞紐，一級反應(yīng)混合物經(jīng)過渡區(qū)流入過濾器，實現(xiàn)了液體在微流控芯片的上下片層間的流動。
[0033]本發(fā)明所述微流控芯片的反應(yīng)池內(nèi)部需進(jìn)行一定的表面改性處理，所述表面改性處理方法可為化學(xué)反應(yīng)，表面涂層，等離子處理等，從而獲得良好的親水性，促使液體樣本在毛細(xì)管作用下流動，快速填充微通道。
[0034]本發(fā)明中所述酶，包含但不限定于過氧化氫酶(HRP)和堿