降鈣素原檢測試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及降鈣素原的檢測技術，具體為降鈣素原檢測試劑盒。
【背景技術】
[0002]血清降鈣素(CT)是最先從甲狀腺腫瘤細胞培養(yǎng)液中提取的一種多肽激素，因此成為該腫瘤血清學標志物。降鈣素原(PCT)，CT的前體，是1992年由德國科學家發(fā)現的一種116個分子的氨基酸組成的糖蛋白，在人體內的半衰期約為20-24小時，穩(wěn)定性好;在正常人血清中含量極低，在除甲狀腺創(chuàng)傷或腫瘤外，系統(tǒng)炎癥反應綜合癥(SIRS)、敗血癥、急慢性肺炎、急性胰腺炎、活動性肝炎、創(chuàng)傷等患者血清中顯著升高，是一種非常敏感特異的血清學標志。而在病素毒感染、腫瘤物術創(chuàng)傷時則保持低水平，PCT在嚴重細菌感染(2-3小時后)早期即可升高，因此具有早期診斷價值；在局部感染、病毒感染、慢性非特異性炎癥、癌癥發(fā)熱、移植物宿主排斥反應或自身免疫性等疾病時PCT濃度不增加或輕微增加，而只在嚴重的全身系統(tǒng)性感染時才明顯增加，這就決定了 PCT的高度特異性，因此也可用于各種臨床情況的鑒別診斷；PCT濃度和炎癥嚴重程度成正相關，并隨著炎癥的控制和病情的緩解而降低至正常水平，因而PCT又可作為判斷病情與預后以及療效觀察的可靠指標。PCT在臨床上具有廣泛而又重要的應用價值；并且對ICU病人的死亡率及住院時間提供標準。
[0003]正常人血液中降鈣素原的濃度很低，通常無法檢測到。只有當細菌感染時降鈣素原才會升高，而其他的炎性反應如病毒感染、自身免疫性疾病和創(chuàng)傷等降鈣素原不會升高。從產生和消除的動力學過程來看，PCT也是最適合用作臨床診斷指標的。IL-6、IL-10、TNF-α的在血液循環(huán)中達峰值時間太早，約2小時左右，且很快下降，臨床上不易檢測至IJ15CRP在24-48小時達峰值，炎癥控制后CRP濃度仍然居高不下，過一段時間才會緩慢恢復。而感染后6-12小時PCT濃度達峰值，PCT的半衰期為24小時左右。所以，比較而言，降鈣素原能在早期提高感染性疾病的診斷率并反映疾病轉歸，對于抗生素的用藥、停藥指征有很好的指導意義。
[0004]目前對PCT的檢測方法主要是發(fā)學發(fā)光法及ELISA方法，這些方法適合在大醫(yī)院進行大樣本的檢測。另外市場上有一種定性檢測PCT的膠體金試劑，不能定量檢測。尚未有采用免疫層析膠體金技術制備的可定量檢測PCT的檢測試劑盒。

【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明所解決的技術問題在于提供一種降鈣素原檢測試劑盒，以解決上述【背景技術】中提出的問題。
[0006]本發(fā)明所解決的技術問題采用以下技術方案來實現:
降鈣素原檢測試劑盒，包括磁微粒分離試劑、PCT檢測抗體、酶結合物、發(fā)光底物、PCT標準品、用于稀釋所述酶結合物的酶稀釋液；所述磁微粒分離試劑中磁微粒偶聯的蛋白分子為鼠抗人免疫球蛋白G ;所述PCT檢測抗體為抗鼠IgG抗體；所述酶結合物為辣根過氧化物酶標記鼠抗人IgG;所述發(fā)光底物為HRP發(fā)光底物；所述HRP發(fā)光底物包括A液和B液，所述HRP發(fā)光底物的A液和B液實用時1:1混合。
[0007]所述HRP發(fā)光底物的A液包括光劑魯米諾或魯米諾衍生物、增強劑和緩沖劑，HRP發(fā)光底物的B液包括過硼酸鈉和雙氧水。
[0008]所述磁微粒分離試劑中磁微粒的大小為100 μ πΓ8 μ m,磁微粒表面的活性基團為COOH 或 NH2。
[0009]綜上所述，本發(fā)明有益效果:
本發(fā)明采用鼠抗人免疫球蛋白G偶聯磁微粒，PCT單克隆抗體結合鼠抗人免疫球蛋白G這種間接包被模式。這種模式降低了 PCT單抗的用量，從而降低了成本。通過增加偶聯磁微粒的鼠抗人免疫球蛋白G的濃度，能夠明顯的提高檢測靈敏度。
【具體實施方式】
[0010]下面將結合本發(fā)明實施例，對本發(fā)明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。
實施例
[0011]降鈣素原檢測試劑盒，包括磁微粒分離試劑、PCT檢測抗體、酶結合物、發(fā)光底物、PCT標準品、用于稀釋所述酶結合物的酶稀釋液；所述磁微粒分離試劑中磁微粒偶聯的蛋白分子為鼠抗人免疫球蛋白G ;所述PCT檢測抗體為抗鼠IgG抗體；所述酶結合物為辣根過氧化物酶標記鼠抗人IgG ;所述發(fā)光底物為HRP發(fā)光底物；所述HRP發(fā)光底物包括A液和B液，所述HRP發(fā)光底物的A液和B液實用時1:1混合。
[0012]所述HRP發(fā)光底物的A液包括光劑魯米諾或魯米諾衍生物、增強劑和緩沖劑，HRP發(fā)光底物的B液包括過硼酸鈉和雙氧水。
[0013]所述磁微粒分離試劑中磁微粒的大小為100 μ πΓ8 μ m,磁微粒表面的活性基團為COOH 或 NH2。
[0014]所述磁微粒分離試劑，其制備方法如下:
取緩沖液3mL，吹打均勻，置于磁分離器上分離4min，棄去上清液，重復洗滌2次。清洗完畢后，加入碳二亞胺溶液，活化磁微粒，吹打均勻后，置于振蕩器上，反應30mirTlh。然后加入鼠抗人免疫球蛋白G進行偶聯:向活化后的磁性微粒中加入lmg/mL鼠抗人免疫球蛋白G溶液600 yL,置于振蕩器上反應3?6 h ;偶聯完成后,加入I mol/L甘氨酸3mL封閉磁微粒表面的活性基團，混勻后,置于振蕩器上反應45 min ;加入0.1mol/mL磷酸鹽吐溫緩沖液3mL，混合均勻，置于磁分離器上分離，棄去上清液，重復洗滌2次；最后加入含0.1mol/mL的PBS、0.5% (體積分數)羊血清白蛋白的保存液復溶磁微粒，使磁微粒的濃度為lmg/mL,置于4°C備用。
[0015]所述酶結合物，其制備方法如下:
取HRP 5mg溶于蒸懼水0.5mL中，加入60mmol/L Na1040.5mL,放置4°C,混合均勻，氧化30min，然后加入0.16mol/L乙二醇0.5mL，再置4°C終止30min。加入鼠抗人IgG 5mg，用0.05mol/L碳酸鹽緩沖液透析，4°C過夜，加KBH4 (5mg/mL) 0.3mL，置4度終止3h。加等容積飽和硫酸銨,4度沉淀30min后用4000r/min離心15min。沉淀物用PH7.4、0.02mol/L的PBS 0.5mL溶解，用PBS透析除銨。完成后零下20°C保存。
[0016]對于本領域技術人員而言，顯然本發(fā)明不限于上述示范性實施例的細節(jié)，而且在不背離本發(fā)明的精神或基本特征的情況下，能夠以其他的具體形式實現本發(fā)明。因此，無論從哪一點來看，均應將實施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本發(fā)明的范圍由所附權利要求而不是上述說明限定，因此旨在將落在權利要求的等同要件的含義和范圍內的所有變化囊括在本發(fā)明內。
[0017]此外，應當理解，雖然本說明書按照實施方式加以描述，但并非每個實施方式僅包含一個獨立的技術方案，說明書的這種敘述方式僅僅是為清楚起見，本領域技術人員應當將說明書作為一個整體，各實施例中的技術方案也可以經適當組合，形成本領域技術人員可以理解的其他實施方式。
【主權項】
1.降鈣素原檢測試劑盒，包括磁微粒分離試劑、PCT檢測抗體、酶結合物、發(fā)光底物、PCT標準品、用于稀釋所述酶結合物的酶稀釋液；其特征是，所述磁微粒分離試劑中磁微粒偶聯的蛋白分子為鼠抗人免疫球蛋白G ;所述PCT檢測抗體為抗鼠IgG抗體；所述酶結合物為辣根過氧化物酶標記鼠抗人IgG ;所述發(fā)光底物為HRP發(fā)光底物；所述HRP發(fā)光底物包括A液和B液，所述HRP發(fā)光底物的A液和B液實用時1:1混合。
2.根據權利要求1所述的降鈣素原檢測試劑盒，其特征是，所述HRP發(fā)光底物的A液包括光劑魯米諾或魯米諾衍生物、增強劑和緩沖劑，HRP發(fā)光底物的B液包括過硼酸鈉和雙氧水。
3.根據權利要求1所述的降鈣素原檢測試劑盒，其特征是，所述磁微粒分離試劑中磁微粒的大小為100 μ πΓ8 μ m，磁微粒表面的活性基團為COOH或NH2。
【專利摘要】降鈣素原檢測試劑盒，包括磁微粒分離試劑、PCT檢測抗體、酶結合物、發(fā)光底物、PCT標準品、用于稀釋所述酶結合物的酶稀釋液；所述磁微粒分離試劑中磁微粒偶聯的蛋白分子為鼠抗人免疫球蛋白G；所述PCT檢測抗體為抗鼠IgG抗體；所述酶結合物為辣根過氧化物酶標記鼠抗人IgG。本發(fā)明采用鼠抗人免疫球蛋白G偶聯磁微粒，PCT單克隆抗體結合鼠抗人免疫球蛋白G這種間接包被模式。這種模式降低了PCT單抗的用量，從而降低了成本。通過增加偶聯磁微粒的鼠抗人免疫球蛋白G的濃度，能夠明顯的提高檢測靈敏度。
【IPC分類】G01N33-68
【公開號】CN104714019
【申請?zhí)枴緾N201310667453
【發(fā)明人】不公告發(fā)明人
【申請人】上海國興醫(yī)療器械有限公司
【公開日】2015年6月17日
【申請日】2013年12月11日